Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о структурных основах гипоталамической регуляции стрессорных реакций 14
1.1. Развитие учения о стрессе с позиции его
нейрогенного обеспечения 14
1.2. Строение гипоталамуса как отражение изменений основных концепций в нейроморфологии 34
1.3. Конституция и стресс-реактивность 5 о
Глава 2. Материал и методы исследования 59
2.1. Выделение животных с различиями
в конституциональной стресс-реактивности 59
2.2. Методы верификации стрессорных повреждений 64
2.3. Серийные срезы, идентификация основных ядер и полей гипоталамуса и классические нейрогистологические методики 65
2.4. Методы иммуногистохимического исследования 68
2.5. Методы электронной микроскопии 69
2.6. Методы количественного морфологического анализа (морфометрии) и математической обработки
результатов исследования 70
Глава 3. Морфофункциональная характеристика ядер и полей гипоталамуса интактных крыс с конституциональными различиями стресс-реактивности 75
3.1. Ядра и поля передней гипоталамической области 75
3.2. Ядра и поля латеральной и медиальной гипоталамических областей 116
3.3. Ядра и поля задней гипоталамической области 136
Глава 4. Морфофункциональная характеристика изменений «актуальных» структур гипоталамуса при моделировании стресса у крыс с конституциональными различиями стресс-реактивности 146
4.1. Скрининговая оценка стрессорных изменений
в ядрах и полях гипоталамической области 146
4.2. Различия в стрессорных изменениях супраоптического ядра гипоталамуса 151
4.3. Различия в стрессорных изменениях супрахиахматического ядра 158
4.4. Различия в стрессорных изменениях дорсомедиального ядра 165
4.5. Различия в стрессорных изменениях латерального гипоталамического поля 171
4.6. Различия в стрессорных изменениях маммилярного комплекса 175
Глава 5. Математическое доказательство вкладов в регуляцию стрессорных реакций отдельных структур гипоталамуса в связи с их конституциональной вариабельностью 183
5.1. Корреляционный анализ между количественными показателями стресс-реактивности и морфометрии различных структур гипоталамуса 183
5.2. Корреляционный анализ между количественными показателями стресс-реактивности и стрессорных изменений в гипоталамусе 202
Обсуждение полученных результатов 207
Выводы 237
Список литературы
- Строение гипоталамуса как отражение изменений основных концепций в нейроморфологии
- Серийные срезы, идентификация основных ядер и полей гипоталамуса и классические нейрогистологические методики
- Ядра и поля латеральной и медиальной гипоталамических областей
- Различия в стрессорных изменениях супрахиахматического ядра
Введение к работе
Стремительно нарастающий темп урбанической жизни, информационная перегрузка, скученность населения, возрастающая роль фактора общения в обеспечении социального статуса, нарастание доли ксенобиотиков в питании и окружающей бытовой среде современного человека - вот далеко не полный перечень факторов, определяющих возрастание роли стресса в патологии [Селье Г., 1960, 1982; Судаков К.В., 1997, 2002; Крыжановский Г.Н., 1999, 2004; Пшенникова М.Г., 2001; Вашадзе Ш.В., 2006; Глазачев О.С., 2006; Oliver G., Wardle J., 1999; Bell M.E. et al., 2002; Sivukhina E.V. et al., 2006; Gibson L.E., 2006].
С момента публикации Г.Селье в 1936 году статьи «Синдром, вызываемый разными повреждающими агентами», теория стресса прочно вошла в арсенал медицины. В настоящий момент в теории стресса раскрыто немало клеточных и молекулярных механизмов, определяющих его основную динамику и органопатологию, как в остром, так и хроническом варианте развития стрессорной реакции. Определен спектр стресс-активирующих и лимитирующих нейромедиаторов, ульцирогенные, кар-диотропные, иммуномодулирующие, дисгормональные и поведенческие эффекты развития стрессорных реакций [Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 1998; Котов А.В., 1999; Судаков К.В., 2003; Devries А.С., et al., 1997; Ber-ridge MJ., et al., 1998; Hamano H., et al., 2002; Dube L, et al., 2005; Wu Y.H. et al., 2006; Stone EA, et al., 2006; McCormick CM, et al., 2007].
В то же время, даже при ярко выраженных социальных и природных катастрофах тяжесть стрессорной реакции становится фатальной и определяет течение и прогноз болезней лишь примерно у трети лиц, в то время как примерно 20-25% людей при воздействиях тех же факторов практически не реализуют стресс-индуцированную патологию [Анохина И.П., 1997, 2002; Бадыштов Б.А., 1998; Соколова Е.Б., с соавт., 2000; Судаков К.В., Юматов
g E.A., 2001; Bremner J.D., et al, 1996; Kelley A.E., Berridge K.C., 2002; Pe-coraro N., et al., 2004; Dallman M.F., et al., 2005]. Изучение этой крайне интересной, на наш взгляд, проблемы можно проводить с различных позиций. Сейчас уже известно немало генетических особенностей, определяющих уровень реактивности при стрессе и чувствительности к действию стрес-сорных факторов, причем два этих свойства не могут рассматриваться как полностью генетически сопряженные [Середенин СБ., с соавт., 2000; Анохин К.В., Судаков К.В., 2003; Маркина Н.В., с соавт., 2003; Bartolomucci А., et al., 2003; Simpkiss J.L., Devine D.P., 2003; McGill, et al., 2006; Centeno M.L. et al., 2007; Goto S., et al., 2007; Ulrich-Lai Y.M. et al., 2007].
Помимо генетической детерминированности, одну из составляющих стресс-реактивности следует искать в морфо-функциональных особенностях основных структур, отвечающих за регуляцию отношений организма с внешней средой в целом — прежде всего организации церебральных структур [Пшенникова М.Г., с соавт., 2000; Yehuda R., et al., 1991; Avishai-Eliner S., et al., 2001; Morin SM, et al., 2001; Krady J.K., et al., 2002; Bluthe R.M., et al., 2002; Figueiredo H.F. et al., 2003; Inoue K., et al., 2003; Dallman M.F., et al., 2004; Badowska-Szalewska E., et al., 2006; Girotti M., et al., 2006].
В цикле работ, выполненных в Волгоградском государственном медицинском университете (1988-2007), ранее были раскрыты фундаментальные закономерности организации различных структур головного мозга при конституциональных фенотипах, связанных с высоким риском таких распространенных заболеваний как ишемическая болезнь сердца и алкоголизм. Расширены представления о структурных основах реагирования головного мозга на стресс, определяющих общую неспецифическую реактивность организма и, в итоге, органопатологию стрессовой реакции [Писарев В.Б., 1990; Баннов А.Н., 1994; Ерофеев А.Ю., 1995; Смирнов А.В., 1998, 2005; Гуров Д.Ю., 1999, 2005; Фролов В.И., 2004; Писарев В.Б. с соавт., 2006; За-гребин В.Л., 2007; Капитонова М.Ю. с соавт., 2007].
За рубежом многими учеными также демонстрировалась важная роль гипоталамуса в акцепции, трансформации и регулировании силы ответной реакции на стрессовые воздействия [Calogero А.Е., 1995; Stratakis С.А., Chrousos G.P., 1998; Thompson R.H., Swanson L.W., 2003; Okere CO., Water-house B.D., 2004; Kwon M.S., et al., 2006; Ostrander M.M., et al., 2006; Muramatsu Т., et al., 2006; Kiss A., 2007; Lowry C.A., et al., 2007].
За рамками этих исследований осталась такая теоретически и практически важная проблема, как определение особенностей в тех или иных структурах гипоталамуса у животных с доказанной высокой или низкой стресс-реактивностью. Равно не изучались в сравнении изменения этих «актуальных» для развития стресса структур при его воспроизведении у животных с диаметрально противоположными уровнями стресс-реактивности.
Получение нового знания в нейроморфологии на современном этапе немыслимо без сопоставления результатов классических методов светооп-тического исследования, иммуногистохимического выявления специфических молекул-участниц работы головного мозга и данных ультрамикроскопии нейронов, нейроглии и других элементов нейронального окружения [Боголепов Н.Н., 2002; Николлс Дж.Г., с соавт., 2003; Ахмадеев А.В., Кали-муллина Л.Б., 2007; Bonini P., et al., 2004; Gingerich S., Krukoff T.L., et al., 2006; Muramatsu Т., et al., 2006; Block M.L., et al., 2007; Ma S., et al., 2007]. С теоретических позиций рассмотрение структур мозга как гистотопографи-чески очерченных ядер и проводников, выделение нейрональных модулей и изучение межклеточных отношений в мозге следует рассматривать как взаимодополняющие при выполнении подобного исследования.
С этих позиций актуальным представляется фундаментальное морфо-функциональное исследование гипоталамуса как одной из ключевых структур в обеспечении конституционально различной стресс-реактивности.
Цель работы — установить закономерности варьирования отдельных гипоталамических структур у животных с различным уровнем конституциональной стресс-реактивности и уточнить на этой основе участие гипоталамуса в обеспечении силы и выраженности стрессорной реакции.
Задачи исследования.
Изучить морфофункциональные различия отдельных ядер и полей гипоталамуса у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.
Изучить на иммуногистохимическом и ультрамикроскопическом уровне особенности строения нейронов ядер гипоталамуса, наиболее различающихся у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.
Выявить характер и выраженность стресс-индуцированных изменений в ядрах гипоталамуса, наиболее различающихся у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.
Провести корреляционный анализ связей между показателями стресс-реактивности и морфометрии различных структур гипоталамуса.
Провести корреляционный анализ связей между показателями стресс-реактивности и стрессорных изменений в гипоталамусе и разработать математическую модель, характеризующую выраженность и характер стрессорных реакций с учетом стресс-реактивности и особенностей строения гипоталамуса на светооптическом и ультрамикроскопическом уровне.
Научная новизна.
На основании сопоставления результатов светооптического, иммуно-гистохимического, ультрамикроскопического методов исследования и привлечения методов современного математического анализа результатов морфометрии и определения стресс-реактивности получены новые данные о выделении наиболее ядер и полей гипоталамуса, наиболее актуальных с позиции формирования конституциональной стресс-реактивности. К ним, по-
11 мимо общепризнанных, впервые отнесены дорсомедиальное ядро, латеральное гипоталамическое поле и два ядра маммилярного комплекса. Показано, что нейроны разных ядер, участвующих в формировании стресс-реактивности, обладают общим ультрамикроскопическим признаком -сравнительно более высоким удельным объемом митохондрий в перика-рионах и их более функционально активной организацией. Выявлены как стойкие признаки строения ядер гипоталамуса у животных с высокой стресс-реактивностью: более плотная упаковка нейронов при относительно малом количестве граничных сосудов и астроглиоцитов, относительно больший процент гистамин и серотонинергических нейронов.
Показаны различия в краниокаудальных и дорсовентральных градиентах строения ядер и полей гипоталамуса как отражения различной конституциональной стресс-реактивности животных.
На основе полученных данных была сформирована теоретическая концепция о фенотипической вариабельности гипоталамуса, которая может рассматриваться как ключевой морфофункциональный субстрат стресс-реактивности. Это подтверждено данными математического анализа с построением адекватной модели взаимоотношений стрессорной афферента-ции, межъядерных взаимоотношений в гипоталамусе с учетом их конституциональных особенностей и силы последующего стрессорного ответа.
Научно-практическая значимость.
Полученные данные расширяют имеющиеся представления о структурных основах стрессорной реакции с позиции конституциональной ней-роморфологии. Выделение компонента вариабельности участия отдельных структур гипоталамуса за счет особенностей их строения в итоге существенно проясняет общие различия в выраженности стрессорного ответа у различных организмов на идентичные по характеру и силе воздействия.
Моделирование стресса у животных с конституционально высокой стресс-реактивностью целесообразно для получения наиболее ранней и полной картины стресс-индуцированной патологии при воздействии стрессоров даже умеренной силы.
Положения, выносимые на защиту.
На ультраструктурном, клеточном и тканевом уровне ядра и поля гипоталамуса (каждое — в разной степени) обладают широкой вариабельностью строения, среди которого можно выделить устойчивые наборы признаков, свойственных животным с конституционально высокой и низкой стресс-реактивностью.
Наличие (предсуществование) особенностей строения отдельных ядер и полей гипоталамуса у животных с различной стресс-реактивностью частично определяет характер и выраженность последующих стресс-индуцированных изменений в этих структурах.
Особенности строения гипоталамуса и происходящих в нем при стрессе изменений, в свою очередь, определяют общую выраженность и течение стрессорной реакции.
Апробация работы и публикации.
Основные результаты диссертационного исследования докладывались и обсуждались научных сессиях профессорско-преподавательского состава Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 1998-2006), на III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004), III Всероссийской научно-практической конференции «Медико-биологические и психолого-педагогические аспекты адаптации человека» (Волгоград, 2004), VII конгрессе Международной ассоциации морфологов (Казань, 2004), V съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2005); Международном конгрессе «Проблемы вегетативной дисрегуляции» (Донецк,
2005); Российской научной конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2006); Всероссийской конференции «Новые медицинские технологии» (Волгоград, 2007).
Апробация работы осуществлена на совместном заседании кафедр гистологии, цитологии и эмбриологии, патологической анатомии, анатомии человека, судебной медицины Волгоградского государственного медицинского университета 25 апреля 2008 года.
По материалам диссертации опубликованы 26 научных работ, в том числе 9 - в журналах «Морфология», «Морфологические ведомости», «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины» и «Вестник Волгоградского государственного медицинского университета», включенных в действующий «Перечень ... ВАК» (медицинские науки, редакция апрель 2008).
Реализация и внедрение результатов исследования.
Материалы диссертации внедрены в учебный процесс в Волгоградском государственном медицинском университете, Волгоградском государственном университете, Волгоградской государственной академии физической культуры, Саратовском государственном медицинском университете, Ставропольской государственной медицинской академии, Астраханской государственной медицинской академии. Разработанные и апробированные диагностические методики используются Волгоградского областного пато-логоанатомического бюро и Волгоградского научного центра РАМН и администрации Волгоградской области.
Строение гипоталамуса как отражение изменений основных концепций в нейроморфологии
Отечественная школа исследователей в области стресса в 60-80-е годы 20-го века уделяла большое внимание той части нервной дизрегуляции, которая связана с высшими корковыми функциями, сложными поведенческими реакциями. Такая «гуманизация стресса» и стресс-индуцированной патологии времен СССР породило несколько не вполне доказанных концепций, встроенных в понимание сущности ишемической болезни сердца, гипертонической болезни, язвенной болезни желудка и т.п.
Между тем, сам Г.Селье и вслед за ним его последователи в Канаде, США, Германии среди основных структур, ответственных за последовательность нейрогенных изменений при стрессе, рассматривали гипотала-мическую область мозга.
Одной из пионерских работ в России, рассматривающей гипоталамус именно под таким углом зрения, стало диссертационное исследование В.Б.Писарева (1990). В цикле работ и докторской диссертации автор доказывает наличие предсуществующих особенностей строения гипоталамуса человека, обусловливающие высокий риск, ранее наступление и неблагоприятное течение ишемической болезни сердца [Писарев В.Б., 1992, 1995].
При подострых стрессорных повреждениях в исследованиях, проводимых на кафедре патологической анатомии Волгоградского государственного медицинского университета, неоднократно показывалась сравнительная морфология ядер гипоталамуса: к наиболее поражаемым ядрам при хроническом стрессе у крыс были отнесены супраоптическое, супрахиазма-тическое, дорсомедиальное и аркуатное [Писарев В.Б., 1990; Писарев В.Б., с соавт., 1998, 2006; Фролов В.И., 2004].
Среди уязвимых структур гипоталамуса при хроническом иммобили-зационном стрессе у растущих крысят были названы дорсомедиальные яд
pa, с которыми автор связывает парасимпатические высшие функции. Это может быть косвенным подтверждением центрального механизма вагаль-ной дисфункции при хроническом стрессе [Смирнов А.В., 2003, 2005; Jin-gyi М.А. et al., 1994].
При хемоиндуцированном стрессе наиболее реактогенным оказывается SO гипоталамуса. С сохранением активности SCh связывают более высокую резистентность животных к шоку. Мелкоклеточные ядра гипоталамуса (ARC, VM) находятся в промежуточном положении [Демко П.С. с со-авт., 2002; Кузнецов И.Э., 2003; Sharkey J. et al., 2000; Fonnum F., Lock E.A., 2004; Slikker W.Jr. et al., 2005].
Гипоталамус, как полифункциональное образование, принято разделять на вегетативный гипоталамус и мамиллярный комплекс. Анатомически вегетативный гипоталамус содержит две группы ядер: ядра латеральной группы (АРО, латеральное ядро) и ядра медиальной группы (PeV, пре-оптическое медиальное ядро, переднее гипоталамическое поле, SCh, SO, PV, ARC, VM, заднее гипоталамическое). Известно, что эти ядра обладают нейросекреторной активностью. Для АРО достоверно выявлено наличие кортиколиберина, холинацетилтрансферазы и ацетилхолинэстеразы [Ару-шанян Э.Б. 1996; Писарев В.Б. с соавт., 2006; Akana S.F. et al., 1996; Rada P.V. et al., 2001; Avishai-Eliner S. et al., 2001].
В классических работах по нейроморфологии гипоталамуса основная роль отводится его гуморальной активности, описанной во многих литературных источниках, в частности нейросекреторным клеткам различных ядер. Считается, что одним из основных результатов возбуждения гипоталамуса в ответ на действие стрессовых стимулов является выработка кортиколиберина. Выброс около 100 нг этого рилизинг-фактора приводит к секреции в гипофизе до 1 мг АКТГ (коэффициент «усиления» — 1000), а после этого - до 40 мкг кортизола в надпочечнике (коэффициент 40). Стрессовая активация гипоталамуса сопровождается выработкой и других гормонов: люлиберина, тиреолиберина, соматостатинов и т.п. Их действие модулирует участие других гормональных систем и регуляции обмена на высоте стресса в целом [Судаков К.В., 1984; Дыгало Н.Н., 1993; Акмаев И.Г., 2001; Боголепов Н.Н., с соавт., 2002; Хитров Н.К., Салтыков А.Б., 2003; Dallman M.F. et al., 2004].
По современным представлениям, невозможно представить изолированную локализацию эндокринных функций в гипоталамусе. Оказалось, что на экспериментальные воздействия реагирует значительная часть всего гипоталамуса, хотя в некоторых случаях и отмечалось преобладание реакции отдельных ядер. Нейрохимические исследования также выявляют диффузное распределение симпатоактивирующих и парасимпатических нейронов в структурах заднего, туберального и переднего гипоталамуса [Артемчук А.Ф., 2003; Сивухина Е.В. с соавт., 2003; Писарев В.Б. с соавт., 2006; Laugero K.D. et al., 2001; Calhoun V.D. et al., 2004].
Параллельно этому «нисходящему» стимулированию эндокринной системы через гипофизарные гормоны из гипоталамуса при стрессе доказано усиление потоков эфферентных нервных импульсов, идущих по направлению к компонентам лимбической системы (так называемое «горизонтальное» стимулирование) и в направлении к коре головного мозга (то есть «восходящее» стимулирование) [Акмаев И.Г., 2003; Кузнецов И.Э., 2003; Ляшенко А.А., Уваров В.Ю., 2003; Jones S.L. et al., 2006].
Серийные срезы, идентификация основных ядер и полей гипоталамуса и классические нейрогистологические методики
Передняя гипоталамическая область была нами объединена с иногда описываемой отдельно преоптической областью. В ней выделяли и отдельно изучали строение медиального (РОт) и латерального преоптических (РОЇ), перивентрикулярного (PeV), переднего гипоталамического (NAH), супраоптического (SO), супрахиазматического (SCh) и паравентрикулярно-го (PV) ядер. Помимо ядер в классическом цитоархитектоническом смысле этого слова, здесь присутствовали и проводники, описанные как элементы нейропиля по различным направлениям и смешанные области, в частности -ретрохиазмальная (RCA).
В медиальной группе основу вещества гипоталамуса составляли крупные дорсомедиальное (DM) и вентромедиальные (VM) и аркуатное (Arc) ядра. В первом различали дорсальную и вентральную части. Особеннностью этой области было обилие вертикальных и горизонтальных проводников, формирующих в нейропиле ассоциативные связи с другими элементами стресс-системы.
Латеральное гипоталамическое ядро (LH) и серый бугор, составляющие наружную группу ядер гипоталамуса, были представлены скоплениями неплотно расположенных нейронов средних размеров с достаточно большим количеством астроглии и микроглии между ними. Большая масса ней-ропиля в этой области позволила рассматривать эту зону как единое латеральное гипоталамическое поле (AHL), простирающееся во фронтальных срезах в координатах Р1,5-Р3,0.
Элементы мамиллярного комплекса, то есть заднего гипоталамуса, обнаруживали в сечениях Р3,0 - Р4,5 по Сентаготаи и идентифицировали как супрамамиллярное ядро (SuM), дорсальная (PMd) и вентральная (PMv) части премамиллярных ядер, латеральное мамиллярное ядро (ML), медиальная (ММт) и латеральная (ММ1) части медиального мамиллярного ядра. В связи с достаточно однородным строением и непостоянством выявления ММ1 у крыс последние два объекта были подвергнуты анализу совместно. Среди большого количества проводников в задней гипоталамической области большое внимание уделяли мощному восходящему мамилло-таламическому тракту.
Для уточнения расположения ряда объектов и идентификации срезов вне типичных проекций использовали также современные атласы промежуточного мозга: Н.Н. Боголепова с соавт. (2002), Paxinos G., Watson С. (1996) и Swanson L.W. (1998). Для классического нейрогистологического исследования использовали окрашивание препаратов мозга гематоксилином и эозином, а также по Нисслю.
С типичных полей зрения в каждой окраске для иллюстрации находок и морфометрического исследования производили микрофотосъемку каждого актуального ядра и поля гипоталамуса цифровой камерой Canon (Japan, 5.0 мегапикселей) на базе микроскопа Axiostar plus (Карл Цейс, Германия) с использованием объектива х40, хЮО и окуляра х10. Всего было исследо вано свыше 1600 срезов, получено свыше 5500 оцифрованных изображений.
Иммуногистохимическую реакцию производили с использованием следующих моноклональных мышиных антител : - макрофагальный антиген, окрашивающий микроглиальные клетки (клоны НАМ-56, набор DakoCytomation, Дания); - кислый глиальный протеин, окрашивающий проводники (клон GFA, набор DakoCytomation, Дания); - к тирозингидроксилазе (клон ТН, набор DakoCytomation, Дания) - к глутаматному рецептору (клон GR-2, набор DakoCytomation, Дания) - к нейрональной нитроксидсинтазе (NOS-1, клон NOS-125, DakoCytomation, Дания); - к эндотелиальной нитроксидсинтазе (NOS-3, клон RN5, DakoCy tomation, Дания).
Выбор двух последних антигенов был обусловлен тем, что по современными данным, именно дисбаланс нитроксидсинтаз становится ключевым стартовым механизмом повреждений в центральной нервной системе при стрессе [Han H.S.,et al., 2002; Kotake Y., et al. 2002].
Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидаз-ного метода с высокотемпературной и ферментной демаскировкой антигенов. Экспрессию оценивали по разбиению нейронов на классы в зависимости от степени экспрессии иммунопозитивного материала по оптической плотности выделенных масок: негативные, слабопозитивные, позитивные и гиперэкспрессирующие с выражением доли каждого класса в процентах.
Соотношение экспрессии определяли через их удельные яркости в сопоставимых областях ГМ на серийных срезах, обработанных на одном предметном стекле.
Для достоверности полученных результатов применяли позитивные и негативные контроли антигенов, а так же негативные контроли антител [Петров СВ., Райхлин Н.Т., 2004; Kelman Z., 1997; Rosa М.А., et al. 2000; Paunesku Т. et al., 2001] .
Для электронно-микроскопического исследования животных подвергли эвтаназии путем внутривенной инфузии 4%-ного раствора парафор-ма на 0,1 М какодилатном буфере (суправитальной фиксации) под нембута-ловым наркозом.
Дофиксацию кусочков размером 1 мм3 производили в течение 12 часов В 4%-ном растворе параформа на 0,1М какодилатном буфере с последующей постфиксацией в течение 2 часов в 1% растворе тетраокиси осмия на 0,1М какодилатном буфере (рН=7,4) при температуре +4С [12]. После промывки в нескольких порциях раствора какодилатного буфера материал подвергали дегидратации в спиртах возрастающей концентрации и заливали в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие срезы толщиной 50-90 нм получали на ультрамикротомах LKB- 8800 и монтировали на медные сетки.
Ядра и поля латеральной и медиальной гипоталамических областей
Исследование вариабельности плотности нейронов показало, что у животных НСР группы наблюдалось более диффузное и равномерное распределение нейронов по всему объему PV, в то время, как у животных серии ВСР нейроны были расположены менее равномерно.
Полученные данные позволяют считать, что в паравентрикулярном ядре гипоталамуса крыс с конституционально высокой реактивностью имеются несколько особенностей морфологии: относительно малая плотность и небольшое число граничных нейронов и астроглиоцитов, более равномерное их расположение по территории ядра с тенденцией к большей плотности в вентральном направлении. Эти особенности необходимо учитывать при анализе стресс-индуцированной патологии PV могут иметь отношение к доле промежуточных и эфферентных нейронов в ядре, что, в сочетании с низким глиальным представительством у животных ВСР группы, предполагает быстрое развитие у них реакции истощения при стрессе.
Микроглиальное представительство в ядрах передней гипоталами-ческой области оценено путем иммуногистохимического выявления НАМ-56 (табл. 10).
Объемная доля микроглиоцитов в ядрах передней гипоталамической области варьировала от 3,1% до 6,1%. У крыс ВСР группы этот показатель для PV была меньше аналогичного показателя в альтернативной группе в 1,26 раза, для SCh — 1,51 раза, для SO - в 1,38 раза (все Р 0,05). По размерам клеток популяция микроглиоцитов в SO, SCh и PV оказалась достаточно гомогенной, их размеры были примерно одинаковыми у животных ВСР и НСР групп. Лишь глиоциты SO имели несколько большие размеры, но и в этом случае оказывались идентичными у животных обеих групп.
Интересные результаты были получены при расчете коэффициента глия/нейрон. Как известно, этот показатель во многом характеризует резистентность отдельных нейрональных групп к острому стрессорному воз действию [Сивухина Е.В., с соавт., 2003; Писарев В.Б. с соавт., 2006]. Коэффициент глия/нейрон не различался между альтернативными группами для паравентрикулярного ядра, и был больше в ВСР группе для супраопти-ческого и супрахиазматического ядер передней гипоталамической группы.
Это наблюдение было подтверждено при анализе ростро-каудального градиента коэффициента глия/нейрон (табл. 11).
Как видно из приведенных данных, у животных с конституциональной склонностью к потреблению алкоголя структуры передней гипоталамической области, расположенные более краниально, имели меньшее соотношение нейрон/глия, а структуры, расположенные каудальнее - напротив, большее соотношение, по сравнению с альтернативной группой.
Этот «перекрест» можно интерпретировать как относительно более высокое глиальное представительство и, следовательно, исходно больший «запас прочности» супраоптического и супрахиазматического ядер гипоталамической области к стрессорному воздействию.
Указанные свойства, безусловно, могут принимать участие в формировании повреждения гипоталамической области при моделировании стресса.
Экспрессия нитроксидсинтаз. В группе ВСР относительно высокий процент иммунопозитивных к NOS-1 нейронов выявлялся в паравентирку-лярном и супраоптическом ядрах, а в супрахиазматическом ядре гипоталамуса выявлялись только слабопозитивные клетки, составляющие менее 5% всех нейронов. Нив одном случае в переднем гипоталамусе интактных животных не было выявлено нейронов с гиперэкспрессией NOS-1 (табл. 12).
Относительная экспрессия NOS-3 была весьма вариабельной, составляла в исследуемых ядрах от 1,7 до 2,2 и возрастала в последовательности: супраоптическое паравентрикулярное супрахиазматическое ядро.
Аналогичный ростро-каудальный градиент со снижением экспрессии NOS-1 и показателя с NOS-1/NOS-3 выявлялся в гипоталамусе крыс НСР группы. Нейроны, позитивные к NOS-1, выявлялись только в преоптиче-ских и паравентрикулярном ядрах, но их доля оказывалась сходной по величине или меньше, в сравнении с аналогичным показателем в ВСР группе.
Различия в стрессорных изменениях супрахиахматического ядра
Нервные волокна АРО были преимущественно ориентированы в кранио-каудальном направлении и распределялись в ткани нейропиля не вполне равномерно. Тангенциальный ход и извитость большинства волокон не позволял проанализировать реальные размеры отдельных элементов.У животных ВСР группы организация этой области представлялась более сложной, в сравнении с аналогичной у животных НСР группы.
Количественный анализ выявил, что нейропиль АРО у животных ВСР группы характеризуется более плотным расположением волокон, они имеют почти вдвое больший показатель извитости (фактор формы) и занимают относительно большую площадь сечения АРО (табл. 15).
Ретрохиазмальная область характеризовалось несколько более гру-бодисперсной структурой нейропиля. У животных ВСР группы элементы нейропиля имели разнонаправленное ветвление, образуя хааркетрные перистые структуры со значительным представительством GFAP. У животных НСР группы картина ретрохиазмальной области представлялась несколько смазанной, волокона нервных проводников не были столь отчетливыми, но сохраняли трехмерно-направленный ход (рис. 18).
При количественном анализе установлено, что GPAP-позитивные структуры у животных ВСР группы занимали относительно большую объемную долю, при сходной яркости характеризовались высокой извитостью (фактор формы в 2,15 раза больше, в сравнении со значением в НСР группе, Р 0,01).
Исследования, проведенные в передней гипоталамической области у интактных животных с различной стресс-реактивностью, выявили существование многочисленных особенностей, связанных с ней. Они касались как показателей размерности ядер и отдельных структур, так и сложности их организации.
Наиболее яркие структурные отличия выявлены в медиальном преоп-тическом ядре, PeV, SO и SCh переднего гипоталамуса, а также в нейропи-ле ретрохиазмальной области. Интересно, что в триггерном ядре стресса -паравентрикулярном, отличия между группами не были столь выражены. На наш взгляд, это объясняется тем, что стресс-реактивность определяется на уровне гипоталамуса не столь филогенетически закрепленным для данного вида строением PV, а особенностями относительно молодых в филогенетическом отношении ядер с модулирующим в отношении стрессовой реакции действием, а также сложностью организации внутригипоталамиче-ских связей (нейропиля).
Также удалось показать, что нейроны разных ядер передней гипоталамической области, участвующих в формировании стресс-реактивности, обладают общим ультрамикроскопическим признаком - сравнительно более высоким удельным объемом митохондрий в перикарионах и их более функционально активной организацией. Выявлены как стойкие признаки строения ядер гипоталамуса у животных с высокой стресс-реактивностью: более плотная упаковка нейронов при относительно малом количестве граничных сосудов и астроглиоцитов, относительно больший процент гиста-мин и серотонинергических нейронов.
Наличие в ядрах переднего гипоталамуса интактных крыс ВСР группы относительно более высокого процента NOS-1-позитивных нейронов и малый коэффициент NOS-1/NOS-3 мы рассматриваем в качестве одной из ключевых характеристик этих структур, связанных с конституциональной стресс-реактивностью.
