Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы: физиологическая активность пенициллинов
Глава 2. Экспериментальные модели стресса 22
Стрессорный ульцерогенез 23
Поведенческие модели стресса
Тест Порсолта, норковая камера, вертикальный экран-сетка, крестообразный приподнятый лабиринт, черно-белая камера, приподнятая открытая платформа, модель «подвешивание за хвост».
Модель хемо-индуцированного эпилептогенеза 41
Глава 3. Методы экспериментальных исследований 43
Стрессорный ульцерогенез, вызванный плаванием 43
Поведенческие модели стресса 45
Поведенческие эффекты комбинации бензилпенициллина и ГАМК-литиков коразола и пикротоксина 54
Модель хемо-индуцированного эпилептогенеза 55
Статистическая обработка данных 57
Глава 4. Результаты экспериментальных исследований и их обсуждение 57
1. Антистрессорное антиязвенное действие бензилпенициллина при стрессе 57
2. Изменение поведения при действии бензилпенициллина 62
Межтестовый анализ эффектов бензилпенициллина при стрессе 80
Поведенческие эффекты бензилпенициллина в некоторых блиц-тестах на стресс 87
3. Изучение влияния бензилпенициллина на ГАМК-ергические механизмы при стрессе 99
Поведенческие эффекты комбинации бензилпенициллина и ГАМК-литиков в крестообразном приподнятом лабиринте 99
Влияние бензилпенициллина на коразоловые и пикротоксиновые судороги 112
4. Общее заключение 117
Выводы 119
Практические рекомендации 121
Список работ, опубликованных по теме диссертации 121
Список литературы 123
Условные обозначения и единицы измерения 148
Аннотация на русском и английском языках 149
- Стрессорный ульцерогенез
- Стрессорный ульцерогенез, вызванный плаванием
- Антистрессорное антиязвенное действие бензилпенициллина при стрессе
- Изменение поведения при действии бензилпенициллина
Введение к работе
Стресс характеризуется комплексным воздействием на нейрогуморальные механизмы организма и сопровождается выраженными изменениями поведения человека и животных [Селье Г., 1967; Айрапетянц М.Г., Вейн A.M., 1992; Симонов П.В., 1993; Хананашвили М.М., 1998]. Стресс и поведение, связанное с ним, представляют собой область, в которой сегодня наиболее активно работают нейрофизиологи мира. За последние десятилетия накоплены обширные сведения о нейротропном действии пенициллинов. Было показано, что данная группа препаратов способна воздействовать на нервные механизмы, связанные с системой гамма-аминомасляной кислоты, ГАМК [Olsen R.W., McDonald R., 1994]. Роль центральной ГАМК-ергической системы в регуляции поведенческих реакций на стресс, в том числе состояния тревожности, хорошо изучена [Судаков К.В., 1987; McNaughton N., 1993]. При этом, несмотря на обилие данных по нейрохимии пенициллинов, мало известно об их способности влиять на центральные процессы и механизмы, в том числе действовать на поведение при стрессе. В литературе по данному вопросу крайне мало сведений, и поэтому изучение поведенческих эффектов пенициллинов в различных моделях стресса представляет собой актуальную самостоятельную научную задачу. В настоящей работе была также сделана попытка при помощи нейротропного препарата бензилпенициллина (БП) изучить внутрицентральные физиологические механизмы, лежащие в основе регуляции поведенческих реакций животных на стресс различного генеза.
Цель работы: Исследовать особенности поведения животных при стрессе на фоне действия БП и изучить возможные физиологические внутрицентраль-ные механизмы, лежащие в основе нейротропных, стресс-тропных свойств БП.
Задачи исследования:
Изучить поведенческие изменения, вызываемые при действии БП в серии экспериментальных моделей стресса различной природы (стрессорное яз-вообразование, вызванное плаванием, тест «вынужденного плавания» Порсол-та, норковая камера, вертикальный экран, крестообразный приподнятый лабиринт, тест «подвешивание за хвост», приподнятая платформа, черно-белая камера);
провести сравнительный анализ стрессорных моделей с точки зрения выраженности стресс-тропного действия БП в указанных тестах и в зависимости от природы и силы использованных стрессоров;
исследовать возможность действия БП на ГАМК-ергические механизмы при стрессе (в моделях эпилептогенеза и тревожности в крестообразном приподнятом лабиринте, вызванных ГАМК-литиками коразолом и пикротокси-ном) и тем самым оценить значение центральных ГАМК-ергических механизмов в регуляции поведенческих реакций животных при стрессе.
Научная новизна исследования.
В работе впервые осуществлено исследование особенностей поведения крыс в серии различных поведенческих моделей стресса крыс на фоне действия широкого диапазона доз нейротропного препарата БП. Выявлены быстро-активируемые антистрессорные, антитревожные эффекты, вызываемые БП. Впервые на поведенческом уровне проведено исследование возможных ГАМК-ергических медиаторных механизмов при стрессе, на которые оказывает корректирующее действие БП, и экспериментально подтверждена роль данных механизмов при стрессе различной природы.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Результаты исследования позволяют расширить представления о роли центральных неиромедиаторных механизмов при стрессе различной природы и свидетельствуют о важной роли ГАМК-ергической системы в регуляции стрессорного поведения животных. В работе получает дальнейшее подтверждение концепция о положительном антистрессорном эффекте умеренного физиологического возбуждения ЦНС. Полученные данные также существенно дополняют сведения о спектре физиологически активных свойств пеницилли-новых соединений и могут служить базой для создания на их основе эффективных стресс-протективных нейротропных препаратов.
Апробация работы.
Результаты работы были доложены и обсуждались на заседаниях кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ (1993-1996, 2002), 3-й Международной школе по нейробиологии (Иерусалим, 1994), 19-й Ежегодной конференции Европейской нейробиологической ассоциации (ENA, Вена, Австрия, 1994), на XIX Международном конгрессе нейропсихо-фармакологов (CINP; Вашингтон, США, 1994), семинарах Медицинских школ Бристольского и Бирмингемского Университетов (Великобритания, 1995, 1996), Ежегодной конференции Международного общества по изучению нейробиологии поведения (IBNS, Сантьяго-де-Компостелла, Испания, 1995), 8-й Сардинской школе по нейробиологии (Кальяри, Италия, 1995), на Ежегодных съездах Британского общества психофармакологов (Кембридж, 1995) и Британского физиологического общества (Оксфорд, 1995), на 33-м Международном конгрессе физиологических наук (С-Петербург, 1997), семинарах Института физиологии им. А.А.Богомольца АН Украины и семинарах кафедры физиологии человека и животных биологического факультета КНУ им. Тараса Шевченко (Киев, 1998-1999), II и III Междисциплинарных конференциях по
нейробиологии (Киев, 1998, 1999), на заседаниях Научно-технического совета Центра физиолого-биохимических проблем (1999-2002), а также конференции, посвященной 160-летию кафедры физиологии Киевского Университета (2002).
Публикации. Результаты исследования изложены в 18 публикациях. Работа выполнена при поддержке Государственной научной стипендии Президента Российской Федерации и грантов Европейской Нейробиологической программы.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 150 страницах печатного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания применяемых методов, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, общего обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 14 таблицами. Список литературы включает 230 источников, из них 164 на иностранных языках.
Общее примечание. Настоящая работа была начата диссертантом в период обучения на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (зав. акад. РАМН проф. И.П.Ашмарин) и продолжена на базе Центра физиолого-биохимических проблем (ЦФБП, Киев). Отдельные эксперименты проводились на базе Медицинской школы Бристольского Университета Великобритании (зав. проф. Д.Натт). Научная идея проведения данного исследования действия пенициллиновых препаратов в моделях стресса принадлежит акад. РАМН проф. И.П.Ашмарину совместно с д.б.н. проф. Г.Е.Самониной (МГУ). Автор выражает признательность И.П.Ашмарину за все рекомендации и указания, а также поддержку во время выполнения части экспериментов на руководимой им кафедре. Автор выражает личную признательность Г.Е.Самониной за ценные практические указания при изучении ульцерогенеза и полезные критические замечания по работе, а также
д.б.н. А.П.Зарубиной. Следует выразить благодарность проф. Д.Натту из Бристольского Университета (за дискуссии о механизмах тревожности и обсуждение некоторых полученных данных), а также проф. Р.Роджерсу из Лидского Университета (за комментарии и советы по поводу анксиотропных свойств ГАМК-активных препаратов и личный интерес к результатам исследований). Автор искренне благодарит за полезную дискуссию всех коллег и сотрудников.
Стрессорный ульцерогенез
Классической моделью стресса является язвообразование слизистых желудка [Селье Г., 1982], используемое как при изучении стресс-тропного действия препаратов с заранее известными свойствами, так и для выявления новых классов стресс-тропных веществ [Overmier J.B. et al, 1997]. Патогенез СОЖ традиционно рассматривается как результат дисбаланса между защитными и агрессивными факторами при непосредственном участии нейрогуморальных механизмов [Барановский Ю.А., 1991; Циммерман Я.С., 1992; Ашмарин И.П. и др., 1992, 1996; Филаретова Л.П. и др., 1995, 1996; Нижевич А.А. и др., 1996; Овсянников В.И., 1996; Brooks F.P., 1985]. Агрессивные факторы СОЖ - низкие рН, пепсин и лизосомные ферменты - считаются основными факторами патогенеза СОЖ при стрессе [Ашмарин И.П. и др., 1992]. Снижение кровотока в СОЖ и накопление там продуктов окисления и повреждающих ткани свободных радикалов также приводит к поражению СОЖ и развитию ульцерогенеза. Обсуждается важная роль бактериальной микрофлоры в патогенезе СОЖ [Зайцева К.К., 1991; Преображенский В.Н. и др., 1991; Зверков И.В. и др., 1996; Goodwin C.S. et al, 1986]. Важна также и роль психофизиологических факторов в патогенезе СОЖ [Березин Ф. и др., 1993], позволяя рассматривать язвенную болезнь в качестве классического психосоматоза и выдвигая психофизиологическую дезадаптацию на первое место среди причин ее возникновения. При обострениях болезни усиливалась чувствительность пациентов к фрустрирующим воздействиям и «негативная» фиксация [Березин Ф. и др., 1993]. Для больных язвенной болезнью хара ктерны повышенная тревожность, депрессивные реакции и стремление к ограничению контактов с окружающими [Березин Ф. и др., 1993]. Таким образом, следует особо подчеркнуть двухстороннюю связь патогенеза СОЖ с социально-психологическими и психическими факторами. С одной стороны, это позволит при анализе результатов наших экспериментов провести параллели между эффектами препарата на ульцерогенез и его влиянием на поведение при стрессе. С другой стороны, связь патологии СОЖ со стрессом справедливо распространить не только на психический, но и на любой другой вид стресса вообще. Так, появление язвочек ЖКТ, является объективным фактором стресса и одной из стандартных реакций на стресс компонентой «триады» общего адаптационного синдрома [Селье Г., 1982]. Отмечается безотносительность данной реакции к разновидностям стресса - физической, психо-эмоциональ-ной и т.д. Это указывает на универсальный характер ульцерогенеза при стрессе, и позволяет рассматривать его как удобный маркер биологического стресса и его эффективную экспериментальную модель [Overmier J.B. et al., 1997].
Поведенческие модели стресса. Воздействие стресса на организм носит целостный характер сразу на многие его физиологические системы, включая поведение [Селье Г., 1982; Судаков К.В., 1987; Каплан Г.И., Сэдок Б.Дж., 1994]. Поэтому особое внимание следует уделить изучению эмоционального поведения животных в различных экспериментальных моделях стресса [Бу-реш Я. и др., 1991; Крупина Н.А. и др., 1996; Dunn A., Berridge К., 1987; Grie-bel G. et al., 1993, 1996; Willner P., 1993, 1995]. Наиболее часто встречающиеся проявления стресса в поведении - состояния страха или тревожности, к которым при переходе в хроническую стадию добавляется депрессивно-подобные состояния [Бачериков Н.Е. и др., 1989, Андрющенко А.В., 1995; Gray J., 1974; Cassano G.B. et al., 1992]. При этом именно тревожность является наиболее часто встречающимся спутником эмоционального стресса, своего рода "первым эшелоном" реакций ЦНС на стрессор, биологический смысл которых заключается в мобилизации резервов организма для избежания угрозы [Каплан Г.И., Сэдок Б.Дж., 1994; Ковалев Ю.В., 1995; Zacharko R.M., Anisman Н., 1989]. Тревожность - это эмоциональное состояние, характеризующееся ощущением ожидания грозящей опасности [Салтыков А.Б. и др., 1996; Фрейд, 1991; Gray J., 1974; Costa Е., 1985]. Оно часто встречается в норме и патологии, и тесно взаимосвязано с биологическим стрессом [Бачериков Н.Е. и др., 1989; Каплан Г.И., Сэдок Б.Дж., 1994; McNaughton N., 1993; File S.E., 1996; Flaherty C.F. et al., 1998]. В психиатрии тревога входит в целый кластер различных осознанных/неосознанных форм тревожностных реакций, включая панические атаки, фобии, пост-травматический стресс, депрессии и т.д. [Аведисова А.С. и др., 1995; Ковалев Ю.В., 1995; Coupland N.J., Nutt D.J., 1995]. Следует, однако, дифференцировать собственно тревожность от близкого ей состояния страха, при котором ощущение направлено на конкретную опасность или причину, а не представляет собой ожидание неконкретной, «диффузной», безобъектной угрозы [Чайченко Г.М., 2001; McNaughton N., 1993]. Последнее подчеркивает ценность тревоги как показателя «готовности страха» [Фрейд, 1991] или реакции на «внутреннюю, смутную, противоречивую опасность» [McNaughton N., 1993; Каплан Г.П., Сэдок Б.Дж., 1994]. Отмечают также важную роль когнитивных механизмов (особенно памяти) в формирования тревожности [Салтыков А.Б. и др., 1996; File S.E., 1993, 1995; Kalueff A.V., Nutt D.J., 1997]. Тревожность - это одна из реакций на стресс вообще, представляющая собой его «эмоционально окрашенную перцепцию» [Вилюнас В.К., 1990; Селье Г., 1982; Чайлахян Л.М., 1992]. При изучении тревожности у животных невозможно непосредственно оценить и измерить ее путем опроса, как это делается на людях, и для этого используют модели [Costa Е., 1985]. В нейроэтологии тревожности используются тесты-модели двух категорий [Maier S.F., 1993]. В тестах первой группы провоцируется конфликт, обычно - поощряя и наказывая один и тот же поведенческий ответ, при этом степень ингибирования умовнорефлекторного ответа отражает уровень тревожности животного [Leonard В.Е., 1989]. Второй тип тестов (большая часть их которых использована в данной работе) основан на анализе спонтанного поведения при помещении животных в незнакомую для них среду [Griebel G. et al, 1993, 1996; Salum et al, 2000]. Ожидание потенциальной опасности и новизна/неопределенность окружающей среды в этих тестах порождают тревожность. При этом степень ингибирования поведения (прежде всего, исследовательской активности как самостоятельной потребности в получении информации о новых стимулах с невыясненным прагматическим значением [Симонов П.В., 1993]) будет объективно отражать уровень тревожности [Gray J., 1974; Maier S.F., 1993; Salum et al., 2000]. Данная активность будет максимальна в самом начале (соответствуя внешне программе случайного поиска), однако будет плавно снижаться по мере привыкания животного к новым условиям в ходе его ориентировочно-исследовательской деятельности и накопления первичной информации [Салтыков А.Б. и др., 1996]. В данной ситуации в поведении животного сталкиваются две противоположные тенденции - боязнь нового и тяга к нему, а тревожные тесты строятся на балансе двух данных мотиваций. Более того, некоторые из тестов используют не просто новизну окружающей среды, а делают ее более аверсивной для животного - например, используя высоту, открытые и освещенные пространства и т.д. [File S.E., 1995, 1996, 2001]. При этом возникающая аверсия условий теста вызывает у людей и животных страх и тревожность, которые могут быть скорректированы введением анксиолитиков [Stanford S.C., 1996]. Важно отметить, что в данных тестах для выявления тревожности в том или ином виде используются стрессоры и анализируется реакция на них. Отмечается, однако, мягкий характер таких стрессорных воздействий, отличный, например, от возможных более жестких условий (которые в ряде случаев полезны при моделировании депрессивных состояний) [Stanford S.C., 1996]. В частности, на этом основаны такие поведенческие тесты как КПЛ, норковая камера, вертикальный экран, черно-белая камера и другие, о которых пойдет речь ниже.
Стрессорный ульцерогенез, вызванный плаванием
В опытах было использовано 340 беспородных белых крыс (самцов, самок массой 150-200г). Животные во всех экспериментах содержались в виварии группами по 10 особей как минимум две недели до начала экспериментов, не получая пишу за 48 часов до опытов. Для избежания копрофагии дно садка заменялось на решетчатую сетку с поддоном. Доступ к воде был свободным. До начала опыта животным внутрибрю-шинно вводили 0.2 мл препарата: контрольным животным - 0.5%-ный раствор новокаина, животным опытных групп - раствор натриевой соли БП в 0.5%-ном растворе новокаина. Новокаин вместо физиологического раствора применяли для купирования болевой реакции крыс на введение БП, что могло быть дополнительным стрессогенным фактором. Растворы разводились в день эксперимента за час до введения. Температура растворителя была предварительно доведена до комнатной. В работе использовали дозы 6, 30, 60, 120 и 150 мг/кг для БП. Указанные дозы были эквивалентны 1, 5, 10, 15, 20 и 25 ОСД, обычно применямых в терапии для БП. Эксперименты проводились в дневное время суток в промежутке между 14 и 17 часами. Препараты вводили за 48 часов и (или) за 1 мин до стресса. Затем животных всех групп метили водоустойчивой краской и подвергали стрессу - плаванию в бассейне в течение 1 часа. Для большего стресса одновременно в бассейн загружалось 20-30 крыс, по 10-15 особей из опытной и контрольной групп. Бассейн представлял собой прямоугольный аквариум 80 х 80 х 130 см, сделанный из прочного прозрачного оргстекла и закрывающийся сверху сеткой. Уровень воды составлял 30 см. Температура воды была 20С. Иногда 1-2 крысы (в равной мере из опытных и контрольных групп) из 20-30 особей, плавающих в бассейне, тонули к моменту окончания эксперимента. Такие особи в дальнейшем не учитывались при анализе интенсивности ульцерогенеза. После плавания крысы извлекались из бассейна, после чего их немедленно умерщвляли эфиром и выделяли их желудки. В тот же день, сразу же после извлечения желудков, их рассекали по малой кривизне, промывали теплой водой и после растягивания на восковой подложке под бинокулярной лупой визуально оценивали состояние слизистой. При исследовании СОЖ учитывали следующие показатели повреждений: общую площадь точеных язвенных поражений, кв.мм (площадь каждого принимается равной 1 кв.мм), общую площадь локальных язвенных повреждений, кв.мм. В случае линейных язв их измеряли по длине (в мм), а ширина принималась равной 1 мм. Для итоговой оценки поражений СОЖ использовали показатель язвенного индекса, представляющий собой сумму площадей точечных и локальных язв в одном желудке (кв. мм). При анализе результатов под считывал ся усредненный язвенный индекс для каждой из групп.
Тест Порсолта. Эксперименты проводились на 120 белых беспородных крысах (самцах, самках) массой 200-240 г. Тестирование проводилось в вечернее время, в промежутке между 18 и 20 часами. В работе использовались животные группами по 5 особей. Препараты вводились опытным и контрольным животным по очереди. БП растворялся в дистиллированной воде в день эксперимента за час до его начала. Препарат БП вводился за 30 мин до теста в дозах 6, 30 и 60 мг/кг. Использовалось системное (і.р.) введение препарата в объеме 0.2 мл. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду в аналогичном объеме. После введения препаратов животные помещались на 30 мин в специальный садок. При тестировании крысы опускались в белый пластиковый цилиндр высотой 60 см и диаметром 50 см, в который на две трети была налита вода (температура 24С). Длительность теста составляла 6 мин, в течение которых регистрировалось поведение животных. Поведенческими показателями служили: латентность первого «зависания» (иммобильность 5 сек), а также суммарное время иммобильности (сек). Под иммобильностью подразумевалось полное отсутствие плавательных движений при пассивном удержании животного на воде. Норковая камера. Норковая камера представляла собой открытый пластиковый ящик коричневого цвета 60 х 60 х 60 см, одна из четырех сторон которого была сделана из прозрачного оргстекла. Пол ящика представлял собой квадрат из оргстекла, выкрашенный изнутри зелено-голубой краской. Пол был приподнят над дном ящика на высоту 3 см и был разделен тонкими белыми линиями на 9 квадратиков 20 х 20 см. По периметру квадратиков в полу были просверлены отверстия-»норки» диаметром 3 см. Эксперименты проводились на 90 белых беспородных крысах (самцах, самках) массой 220-250 г, ранее использовавшихся в черно-белой камере. Тестирование проводилось в вечернее время, в промежутке между 18 и 20 часами.В работе использовались животные группами по 20 особей. Препараты вводились опытным и контрольным животным по очереди. БП растворялся в дистиллированной воде в день эксперимента за час до его начала. Температура растворителя была предварительно доведена до комнатной. Препарат БП вводился за 45 мин до теста в дозах 6, 30 и 60 мг/кг. Использовалось системное (i.p.) введение препарата в объеме 0.2 мл. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду в аналогичном объеме. После введения препаратов животные помещались на 45 мин в специальный садок. При тестировании крысы плавно опускались в норковую камеру, где визуально регистрировалось их поведение. После каждого животного камера протиралась изнутри мокрыми и сухими салфетками. Длительность теста составляла 5 мин. В ходе эксперимента были использованы следующие поведенческие показатели: число пересеченных квадратиков (горизонтальная активность), стойки (вертикальная активность) и число обследованных отверстий-»норок» (исследовательская активность). Квадратик считался пересеченным, если животное пересекало своим туловищем какую-либо из его границ. Под обследованием «норки» подразумевалось опускание какой-либо части мордочки животного в отверстие в полу камеры. Отдельно регистрировали также неспецифическое поведение животных - число болюсов дефекации, частоту актов и суммарную продолжительность груминга в сек.
Вертикальный экран. Экран представлял собой металлическую сетку 1 х 1 мм, натянутую на деревяную раму 40 х 60 см толщиной 1см. В центре рамы была устроена вертикальная деревяная перегородка высотой 10 см и толщиной 1 см, разделяющая сетку на две части так, что можно одновременно тестировать двух животных. По краям (кроме нижнего) рама была обнесена аналогичного размера стенками. Сетка устанавливалась вертикально на самом краю стола на высоте 60 см от уровня пола. Снизу, на полу, под сетку подкладывали ветошь для смягчения удара при падении животного с сетки на пол. Эксперименты проводились на 90 белых беспородных крысах (самцах, самках) массой 230-250 г, ранее (с промежутками в 7 дней) использованных в черно-белой и норковой камере. Дополнительно было использовано 40 интактных крыс для повторного исследования дефекаций (см. ниже) в трех опытных и одной контрольной группах (п=10). Тестирование проводилось в вечернее время, в период между 18 и 20 часами. В работе использовались животные группами по 10 особей. Препараты вводились опытным и контрольным животным по очереди (п=10). БП вводился за 30 мин до теста в дозах 6, 30 и 60 мг/кг. Использовалось системное (i.p.) введение препарата в объеме 0.2 мл. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду в аналогичном объеме. После введения препаратов животное метилось индивидуально специальной краской и помещалось на 30 мин в специальный садок, откуда затем крыса помещалась на вертикальную сетку и плавно отпускалась, оставаясь висеть, зацепившись за сетку лапами. Продолжительность теста была ограничена 3 мин. Одновременно тестировались одна опытная и одна контрольная особи. Регистрировалось время удержания на сетке (сек). В случае, если в течение этого времени крыса падала вниз, ее сажали на сетку снова, в общей сложности до трех раз, все - в пределах 3 мин опыта. Подсчитывалость суммарное время удержания по всем трем повторам вместе. Учитывалась также латентность первого падения (сек). После эксперимента животные сажались в отдельный садок, после чего тест повторялся через 30 и 60 мин (посадки 2 и 3, соответственно). Каждое животное регистрировалось индивидуально, согласно исходной нумерации. Дополнительным показателем, свидетельствовавшим о неспецифическом поведении во время первой посадки на сетку, служила интенсивность дефекаций (число болюсов, которые животное выделило за время пребывания на сетке) и уринаций (% уринировавших животных). При повторных тестированиях (посадки 2 и 3) анализ этих двух показателей не производился.
Антистрессорное антиязвенное действие бензилпенициллина при стрессе
Введение БП в разных дозах непосредственно перед стрессом (в течение 1 часа) способствует существенному дозозависимому уменьшению степени поражения СОЖ по сравнению с контролем (рис. 3, 4). Различия в величинах язвенного индекса у опытных и контрольных групп были достоверными, что свидетельствует о способности БП оказывать быстрое дозозависимое защитное действие при патогенезе СОЖ в условиях острого стресса. БП обнаруживает антиульцероген-ные свойства в дозах 60 и 120 мг/кг. Более показательными стали результаты второго варианта опыта. При введении за 48 часов до стресса, БП не оказывал достоверно отличного от контроля антиульцерогенного действия, и на фоне подавленной микрофлоры происходило интенсивное язвообразование (рис. 5). Рисунок 3. Коррекция ульцерогенеза при введении БП (в % от контроля)
В то же время, дополнительное (повторное) введение БП за 1 мин до стресса вновь приводило к весьма эффективному быстрому антиульцерогенному действию в условиях, когда микрофлора СОЖ уже предварительно была подавлена введением 60 мг/кг БП за 48 часов. Следует также отметить четкую до-зозависимость данных эффектов, более выраженных при большей дозе БП в 120 мг/кг. Таким образом, было показано, что антиульцерогенность БП проявляется только при введении препарата непосредственно перед стрессом плаванием; введение БП за 48 часов не облегчает, а несколько усугубляет степень поражения СОЖ при стрессе; при «двойном» введении дозозависимость эффектов БП определяется дозой последнего введения, непосредственно предшествующего стрессу.
Контроль 60 мг/кг БП 120 мг/кг БП Антиульцерогенный эффект БП в отношении язвообразовании у крыс связан со способностью БП запускать быстроактивируемые физиологические механизмы защиты СОЖ. Однократное внутрибрюшинное введение БП в различных дозах (6-120 мг/кг) непосредственно перед стрессом приводит к существенному уменьшению степени язвенного поражения СОЖ по сравнению с животными контрольных групп, причем наблюдаемый эффект носит выраженный дозозависимый характер (табл. 1, рис. 3, 4).
Различия в величинах язвенного индекса у опытных и контрольных групп составили порядка 40-70%, являясь достоверными (особенно для дозы 30 мг/кг - Р 0.0001). Все вместе это свидетельствует о способности БП оказывать быстрое защитное действие при патогенезе СОЖ в условиях острого стресса. При введении за 48 часов до стресса БП не оказывал выраженного антиульце-рогенного действия: изменение язвенного индекса составили 25% против контроля, причем - в сторону усиления ульцерогенности. При этом введение 60 мг/кг БП за 1 мин до стресса на фоне предварительно введенных 120 мг/кг за 48 часов до эксперимента обнаруживает 40% антиязвенный эффект (рис. 6), близкий к эффектам аналогичной дозы препарата при его однократном введении, описанным ранее. При обсуждении полученных результатов следует учитывать, что концентрация БП в крови при внутрибрюшинном введении, достигая максимума к 30 мин, поддерживается в организме на постоянном уровне в течение 3-4 часов, после чего постепенно падает. Поэтому антиульцерогенное действие в наших экспериментах длилось не более 40-30 мин, в течение которых БП разносился кровью в разные органы и ткани. Обнаруженный эффект препарата свидетельствует о том, что наряду с хорошо известными антибиотическими свойствами, БП способен быстро активировать протективные механизмы при ульцерогенезе, вызванном стрессом. Временная динамика процесса указывает на вероятность нейрорегуляторных (центральных или периферических) механизмов быстроактивируемого действия БП в отношении СОЖ при стресс-индуцированном ульцерогенезе. Здесь можно указать на некоторые известные эффекты БП, могущие иметь отношение к СОЖ. Отмечают, например, способность БП влиять на уровень желудочной секреции [Мирзиашвили Г.И., 1967], его кардиоваскулярные эффекты [Tsoucaris-Kupfer D. et al, 1983], а также возможную нейротропность препарата. Определенный интерес в этой связи вызывают эффекты БП в отношении ГАМК-ергической системы, роль которой в механизмах стресса и стрессорных поражений СОЖ хорошо изучена. Антистрессорные гастропротективные эффекты ГАМК-тропных агентов, например, хорошо описаны в [Судаков К.В., 1987]. Нельзя, однако, исключить, что при осуществлении антистрессорного антиульцерогенного действия БП могут быть задействованы какие-либо другие механизмы. Следует особо подчеркнуть, что наблюдаемые эффекты БП не являются длительными и полностью исчезают спустя 48 часов с момента введения. Таким образом, можно сделать предположение, что при остром стрессе БП активирует быстрые защитные антиульцерогенные механизмы, не связанные непосредственно с его традиционными антибиотическими свойствами. Возможно, существуют центральные или периферические антистрессорные гастропротективные механизмы, активируемые БП в системных дозах 6-120 мг/кг.
Изменение поведения при действии бензилпенициллина
Эффекты в тесте Порсолта. Данные по изучению поведенческих эффектов БП в тесте Порсолта приведены в табл. 2. Введенный за 30 мин до тестирования, препарат ни в одной дозе не продемонстрировал достоверных эффектов в отношении плавания крыс. Так, примерно одинаковое количество животных сразу продемонстрировало отказ от плавания, а суммарное время иммо-бильности среди продемонстрировавших недостоверно уменьшилось в опыте по сравнению с контролем лишь на 23%, 15% и 22% для 6, 30 и 60 мг/кг соответственно. При этом латентность первого зависания в опыте соответственно увеличилась всего на 2%, 12% и 20%. Несмотря на то, что данные эффекты были недостоверны, прослеживается дозо-зависимая тенденция к увеличению поведенческих маркеров анксиолизиса, общепринятых в данном тесте.
Альтернативно, неэффективность БП в тесте Порсолта может наблюдаться потому, что плавание в течение 5 мин, лежащее в основе теста, провоцирует не только состояние тревожности само по себе (поведенческие маркеры которого могут быть и чувствительными к БП), но также вызывает физический стресс (который, как известно, в свою очередь самостоятельно способен усиливать тревожность [File S.E., 1996]). Последнее может привести к тому, что результирующий уровень тревожности не будет смещен, а препарат БП в итоге окажется неэффективным в тесте Порсолта.
Эффекты в норковой камере. Использование малых доз БП (6-60 мг/кг) в норковой камере (табл. 3) практически не обнаружило существенных различий в горизонтальной (число пересеченных квадратов) и вертикальной (стойки) активности. Так, отклонения от контроля были в пределах 12-26% для горизонтальной активности и 6-26% для стоек. Специфическая норковая исследовательская активность также существенно не изменилась при действии БП, обнаруживая незначительные отклонения от контроля в пределах 8-11%. Недостоверными были также эффекты БП на дефекацию. В то же время, интересная тенденция обнаружилась в отношении груминга. Так, препарат приводил к некоторому (правда, недостоверному) увеличению интенсивности груминга в дозах 30 и 60 мг/кг (но не 6 мг/кг), где число актов груминга возросло на 24.3 и 39.3% соответственно.
Более того, аналогичные эффекты продемонстрированы также в отношении другого показателя груминга - его продолжительности: препарат, неэффективный в дозе 6 мг/кг, вызвал достоверное 36.1%- и 50.2%-ное увеличение общей продолжительности груминга в дозах 30 и 60 мг/кг. Подобные эффекты сразу в двух дозах одновременно на частоту и продолжительность груминга подтверждают то, что они, по-видимому, не являются артефактами. Несмотря на описанные выше эффекты БП на количественные показатели груминга, определенную информацию может дать также «спектральный» подход. Применение данного подхода к эффектам БП (6-60 мг/кг) в норковой камере показало, однако, что при введении БП средняя продолжительность груминга у опытных животных мало отличается от контроля. Изменения при действии данных доз были недостоверными и во всех опытах находились в пределах +11% против контроля. Последнее указывает на то, что препарат, по-видимому, не влияет на качественную сторону груминга, вызывая в нем чисто количественные изменения (усиление частоты). К этим выводам приводят также данные анализа распределения животных по количеству и длительности индивидуальных актов груминга. С использованием критерия Х2 было показано, что БП в дозах 6, 30 и 60 мг/кг не вызывал в опыте отличий от контроля в распределении животных по числу актов груминга за время теста (Х2=7.68, 9.8 и 10.22 против критических значений 14.07, 16.92 и 12.59, соответственно). Аналогично, для 60 мг/кг продолжительности отдельных актов груминга у опытных и контрольных крыс не демонстрировали различий в характере распределения (Х2=40.92 43.77 для Р 0.05). Груминговый репертуар как в опыте, так и в контроле продемонстрировал примерно одинаковое преобладание коротких («прерванных») актов груминга продолжительностью менее 5 сек, однако - на уровне тенденции - увеличение в опыте нестереотипического («комфортного»?) более длительного груминга. Представляется, что эффекты препарата могут быть детектированы при исследовании его влияния на гистограммы распределения данных показателей. БП в дозе 60 мг/кг в целом не влиял на распределение продолжительностеи индивидуальных актов груминга в опыте и контроле, однако привел к 29.6%-ному увеличению кратких и 53.8%-ному увеличению числа длительных актов груминга по сравнению с контролем (при этом также регистрировалось втрое больше сверхдлительных актов). Если, однако, допустить, что краткие («прерванные») акты груминга представляют собой своего рода «недореализованные» акты (на фоне «реализованных» длительных, собственно груминговых актов), то соотношение К числа длительных к общему числу [длительных+кратких] актов груминга может отражать уровень «реализованности» поведения - показатель, который объективно должен зависеть от уровня тревоги. Однако, при действии 60 мг/кг БП в опыте и контроле значения К оказались близкими (0.36 и 0.33, соответственно). Неожиданным результатом в данном тесте явилась именно специфичность эффектов БП на груминг на фоне отсутствия каких-либо других видимых эффектов на поведение. Наблюдается и определенная дозозависимость данных эффектов на груминг, чувствительный, по-видимому, к дозам БП порядка 30 мг/кг и более (табл. 3). Последние эффекты представляют несомненный интерес, так как роль груминга в поведении животных при стрессе или тревожности до сих пор крайне неясна. Так, если рассматривать груминг, согласно традиционным воззрениям, как показатель уровня стресса, то усиление груминга под действием анксиогенных манипуляций или препаратов должно коррелировать с угнетением исследовательской и двигательной активности. В наших экспериментах подобного действия БП ни на показатель двигательной активности (стойки и число квадратиков), ни исследовательского поведения («норки») не наблюдалось. Обращает на себя внимание обсуждаемое ранее разнообразие форм груминга, а также возможность его связи в ряде случаев с комфортным поведением. Более того, часто наблюдается усиление груминга по мере адаптации животных к незнакомой среде. Если это предположение правильно, то активация груминга (в том числе в норковой камере) под действием БП может не обязательно означать усиление стресса или тревожности. Действительно, изменения в груминговом поведении необязательно сопровождаются какими-либо изменениями в двигательном или исследовательском поведении [Barros Н.М. et al, 1992, 1994; Aguilar R. et al, 2002]. В последней работе, например, груминг в норковой камере коррелировал только с грумингом в КПЛ, не обнаруживая сильной корреляции ни с показателями локомоции, ни исследовательского поведения. Это означает, что несмотря на отнесение груминга к довольно «безликому» неспецифическому поведению, он представляет собой достаточно автономный поведенческий показатель, который может быть специфически активирован в определенных условиях опытов, иногда на фоне отсутствия каких-либо других поведенческих эффектов. Не исключается также, что БП может воздействовать на какие-то другие механизмы, регулирующие груминговое поведение. В частности, возможно, что препарат оказывает активацию груминга по каким-либо другим причинам, не обязательно связанным со стрессом или комфортностью. Например, можно указать на известные ГАМК-тропные свойства БП, отметив также, что центральная ГАМК-ергичес-кая система играет ведущую роль в регуляции груминга грызунов [Barros Н.М. et al., 1992, 1994; Osborne P.G. et al., 1993]. Можно заключить, что ожидаемые анксиотропные (анксиолитические?) эффекты малых доз БП в норковой камере не проявились в отношении традиционных показателей активности. Эффекты препарата, однако, заключались в неожиданном усилении груминга.
