Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Индивидуальные реакции систем организма при стрессорных нагрузках у животных с различной стресс-устойчивостью .14
1.2. Современные представления о составе, функциях и регуляции метаболизма сурфактантной системы легких
1.2.1. Состав и функции легочного сурфактанта 29
1.2.2. Метаболизм сурфактанта 34
1.2.3. Водный баланс легких .37
1.2.4. Гормональная регуляция сурфактантой системы легких .40
1.3. Сурфактантная система легких при стрессе
1.3.1. Влияние эмоционального стресса на сурфактантную систему легких 51
1.3.2. Влияние сахарного диабета на сурфактантную систему легких 57
1.3.3. Влияние гравитационного стресса на дыхательную систему 62
1.3.4. Влияние психосоциального стресса на состояние сурфактантной системы легких .67
Глава 2. Материал и методы исследования 73
Глава 3. Сурфактант легких при хроническом эмоциональном стрессе у крыс с различной стресс-устойчивостью .78
Глава 4. Сурфактант легких при аллоксановом диабете у крыс с различной стресс-устойчивостью 93
Глава 5. Сурфактант легких при введении даларгина на фоне хронического эмоционального стресса у крыс с различной стресс-устойчивостью .106
Глава 6. Сурфактант легких при введении даларгина на фоне аллоксанового диабета у крыс с различной стресс-устойчивостью 119
Глава 7. Сурфактант легких при зоосоциальном стрессе у крыс с различной стресс-устойчивостью .133
Глава 8. Сурфактант легких при гравитационном стрессе
8.1. Сурфактант легких при иммобилизации в условиях антиортостаза 140
8.2. Сурфактант легких при антиортостатическом вывешивании у крыс с различной стресс-устойчивостью 144
8.3. Сурфактант легких при антиортостатическом вывешивании у мышей .150
8.4. Сурфактант легких при антиортостатическом вывешивании у мышей разных генетических линий 153
Обсуждение результатов .158
Выводы 217
Список сокращений .206
Список литературы 207
Список иллюстративного материала
- Современные представления о составе, функциях и регуляции метаболизма сурфактантной системы легких
- Сурфактант легких при хроническом эмоциональном стрессе у крыс с различной стресс-устойчивостью
- Сурфактант легких при введении даларгина на фоне хронического эмоционального стресса у крыс с различной стресс-устойчивостью
- Сурфактант легких при введении даларгина на фоне аллоксанового диабета у крыс с различной стресс-устойчивостью
Введение к работе
Актуальность проблемы. В современной биологии и медицине одной из наиболее актуальных проблем является изучение различных аспектов влияния стресса на организм человека и животных. Изначально стресс – это адаптивная реакция организма, позволяющая ему противостоять различным воздействиям (Л.П. Филаретова, 2010). Кратковременный психоэмоциональный стресс вызывает мобилизацию функциональных систем организма (К.В. Судаков, 2005) с вовлечением в системную реакцию, направленную на адекватное энергетическое обеспечение развивающегося адаптационного процесса, поведенческих, нейроэндокринных, сомато-вегетативных и метаболических компонентов (M. et al., 2011). В ситуациях, когда предъявляемые организму требования превосходят физиологические возможности организма, теряется адаптивный характер стрессорной реакции, что становится причиной развития патологических процессов (Ф.З. Меерсон, 1993; М.Г. Пшенникова, 2000; В.Г. Шаляпина, 2004). Психоэмоциональный стресс является причиной многих хронических психосоматических заболеваний, уменьшения продолжительности жизни и повышения смертности (К.В. Судаков, П.Е. Умрюхин, 2010; T.G. Guilliams, L. Edwards, 2010). Восстановление гомеостатических констант происходит в результате активации регуляторных механизмов, обеспечивающих сохранение постоянства внутренней среды, и действия стресс-лимитирующих систем, что особенно важно при затяжном стрессовом воздействии (Е.В. Коплик и соавт., 2007; С.С. Перцов, 2008; Л.Н. Маслов и соавт., 2008).
В стрессорный ответ в той или иной мере оказываются вовлеченными практически все органы и ткани организма. Система внешнего дыхания принимает активное участие в развитии и реализации стрессорных изменений (Ф.З. Меерсон, 1989; И.Г. Брындина и соавт., 2007). В оптимальном функционировании аппарата внешнего дыхания существенная роль принадлежит легочному сурфактанту (W. Bernhard et al., 2004). Повышенный интерес к сурфактантной системе легких объясняется многогранностью ее функциональной роли в физиологии и патологии органов дыхания. Доказано, что сурфактант легких обладает антиателектатическими, иммуномодулирующими, бактерицидными, барьерно-очистительными, мембраностабилизирующими, трофическими, антирадикальными свойствами, участвует в процессе испарения воды и регуляции массопереноса кислорода через альвеолокапиллярную мембрану (В.В. Ерохин, Л.К. Романова, 2000; Е.Н. Нестеров, Г.Н. Паневская, 2000; Л.Н. Лепеха и соавт. 2011; H. Taeush et al., 2002; S. Saxena, 2005; J.R. Wright, 2005; F. Lhert et al., 2007; J.B. West, 2008; U. Christmann et al., 2009; V. Besnard et al., 2010).
Нарушения сурфактантной системы легких встречаются как при заболеваниях бронхо-легочного аппарата, так и при системных патологиях, сопровождаясь острой или хронической дыхательной недостаточностью (A.A. Биркун, 1981; В.В. Ерохин, 1987; В.В. Ерохин, JI.K. Романова, 2000). В условиях острого и хронического эмоционального стресса легочный сурфактант претерпевает существенные количественные и качественные изменения, при этом наблюдается также увеличение содержания жидкости в легких (И.Г. Брындина, 2002; Л.А. Украинская, 2002; S. Kovacheva-Ivanova, S.R. Ribarov, 1995).
Согласно классическим представлениям учения H. Selye (1936) об общем адаптационном синдроме, стресс возникает в ответ на действие стимулов разного происхождения: физических, химических, биологических, психогенных, социальных.
Несмотря на общность нейроэндокринных механизмов организации стрессорных реакций, на их реализацию могут оказывать влияние как модальность стрессора, так и особенности реактивности организма, связанные, в первую очередь, с индивидуальной стресс-резистентностью.
Поскольку большинство стрессирующих стимулов, провоцирующих у человека соматическую патологию, имеют социальную природу, изучение последствий их влияния на различные физиологические системы при экспериментальном моделировании на животных представляется в настоящее время весьма актуальным и требует использования адекватных моделей психосоциального стресса (G.F. Koob, 2012). Состояние сурфактантной системы легких при психосоциальном стрессе изучено недостаточно: имеются единичные работы о влиянии кратковременных зоосоциальных конфликтов на поведенческую активность и содержание альвеолярных фосфолипидов (И.Г. Брындина, 2002).
Известно, что стрессогенным эффектом характеризуются не только эмоциональные факторы, но и воздействия, сопровождающиеся сдвигом ряда гомеостатических параметров: изменением газового состава крови (гипоксия), уровня энергетических субстратов (гипогликемия) и др. (Ф.З. Меерсон, 1993; Н.К. Зенков и соавт., 2001). К данной категории можно отнести сахарный диабет, который, согласно современным представлениям, является хроническим гипергликемическим и метаболическим (окислительным) стрессом (М.И. Балаболкин, 2000; Е.Б. Меньщикова и соавт., 2008; И.А. Волчегорский и соавт., 2010; J. Baynes et al., 1999). Сахарный диабет – одно из самых распространенных эндокринных заболеваний: по оценкам ВОЗ (2006) более 180 млн. человек во всем мире страдают данной патологией, при этом количество больных ежегодно увеличивается на 5-7%, а каждые 10-15 лет – в 2 раза (И.И. Дедов и соавт., 2009; Ю.И. Сунцов и соавт., 2011). На экспериментальных моделях сахарного диабета многими авторами (Л.В. Коваленко, 1997; K. Sugahara et al., 1981; L.A. Brown, W.J. Longmore, 1986; B.D. Uhal, W.J. Longmore, 1986) показано снижение поверхностно-активных свойств легких.
Известно, что уменьшение гравитации или изменение ее вектора дезориентирует функциональные системы и вызывает умеренный стресс (А.И. Григорьев, 2004; С.И. Степанова, 2005), поскольку зависимость многих функций от гравитации сформировалась в филогенезе. В связи с активным исследованием механизмов адаптации к невесомости в условиях длительных космических полетов для обеспечения полноценного функционирования организма, изучение состояния одной из важнейших систем жизнеобеспечения – дыхательной – является актуальным. Результаты, полученные в полетных исследованиях и на экспериментальных моделях микрогравитации, показывают, что после длительного действия невесомости снижаются функциональные возможности дыхательной системы (Н.П. Александрова и соавт., 2007; В.М. Баранов, 2011; G.B. West, G.K. Prisk, 1999). Состояние сурфактантной системы легких в этих условиях совершенно не изучено.
Согласно литературным данным (Е.В. Коплик и соавт., 1995; К.В. Судаков, 2005), нейровегетативные реакции на стресс и их метаболическое обеспечение имеют ряд особенностей в зависимости от индивидуальной стресс-устойчивости особей. На основе поведения животных, формирующегося в результате взаимодействия генетических, возрастных, половых и других факторов, предпринимаются попытки прогнозировать устойчивость регуляции АД в условиях эмоционального стресса (К.В. Судаков, 1998), состояние сердечно-сосудистой системы (Е.А. Юматов, 1980), реакции соединительной ткани (В.В. Серов и соавт., 1995; В.А. Шахламов и соавт., 2000; С.В. Протасова, 2010; А.В. Оксузян, 2011), уровень стресс-гормонов (С.С. Перцов и соавт., 1997), активность процессов перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты (И.В. Вольхина и соавт., 2011; С.С. Перцов и соавт., 2011), состояние иммунной системы (Л.В. Девойно и соавт., 2009; С.С. Перцов и соавт., 2010; Е.В. Минаева, 2012), изучаются нейрохимические механизмы эмоциональной реактивности (К.В. Судаков, 2005; П.Е. Умрюхин и соавт., 2008).
Отмечено, что устойчивость к стрессорным нагрузкам в значительной степени зависит от содержания нейромедиаторов в структурах головного мозга и в периферических тканях. Одним из перспективных в плане восстановления вызванных стрессом нарушений рассматривается синтетический аналог лей-энкефалина даларгин (Л.Н. Маслов и соавт., 2008), оказывающий стресс-лимитирующее действие, а также обладающий выраженными антиоксидантными свойствами (О.А. Лебедько, С.С. Тимошин, 2002; А.В. Николаев и соавт., 2003; Л.Т. Таджибова и соавт., 2010). Влияние опиоидов на сурфактантную систему легких при стрессе изучено лишь в условиях их внутримозгового, а не системного введения и без учета индивидуальной стресс-устойчивости (И.Г. Брындина, 2002).
Влияние различных по природе и интенсивности видов хронического стресса на формирование стресс-индуцированных изменений легочного сурфактанта и возможность их коррекции в зависимости от прогностической устойчивости особей к эмоциональному стрессу являются практически не изученными.
Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования – комплексная оценка состояния сурфактантной системы и водного баланса легких у животных с различной стресс-устойчивостью в зависимости от модальности и продолжительности стресса.
Для достижения указанной цели поставлены следующие задачи:
-
Изучить поверхностно-активные свойства и состав фосфолипидов сурфактанта легких в динамике развития иммобилизационного, зоосоциального, метаболического и гравитационного стресса у животных, различающихся по прогностической устойчивости к стрессу.
-
Выявить направленность изменений водного баланса и кровенаполнения легких при вышеуказанных воздействиях у стресс-устойчивых и стресс-неустойчивых особей.
-
Провести сравнительный анализ функциональной активности легочного сурфактанта и состояния водного баланса легких у крыс с различной устойчивостью к стрессу при стрессовых воздействиях разной модальности.
-
Исследовать особенности стресс-индуцированных изменений сурфактантной системы легких у животных с различной стресс-резистентностью при многократном введении синтетического аналога лей-энкефалина даларгина.
-
Выявить возможные механизмы изменений сурфактантной системы и водного баланса легких в условиях хронического стресса различного происхождения у стресс-устойчивых и стресс-неустойчивых животных.
Научная новизна исследования. Впервые проведен сравнительный анализ направленности и характера взаимосвязей между изменениями сурфактанта и водного баланса легких при хронических стресс-индуцирующих воздействиях. Новизна полученных данных заключается в выявлении различных вариантов зависимости изученных показателей поверхностной активности, липидного статуса сурфактанта, а также водного баланса легких от стресс-устойчивости животных в динамике развития стресса различной модальности.
Дополнены сведения о зависимости изменений сурфактантной системы легких при хроническом иммобилизационном стрессе от индивидуальной стресс-устойчивости животных. Впервые получены данные об индивидуально-типологических особенностях реакции легочного сурфактанта на хронический метаболический стресс при аллоксановом диабете, а также в условиях зоосоциального и гравитационного стресса.
Получены данные о модулирующем влиянии даларгина на сурфактантную систему легких при хроническом иммобилизационном и метаболическом стрессе. Сравнительная оценка использования даларгина при воздействии стрессирующих факторов показала, что на более ранних сроках его введения протекторные эффекты реализуются у стресс-устойчивых крыс.
Впервые получены данные о состоянии сурфактантной системы легких у животных в условиях моделированной микрогравитации. Выявлен характер адаптивных эффектов при непродолжительном влиянии микрогравитации на организм и дизадаптивные сдвиги в сурфактантной системе легких при длительных воздействиях; показано, что более выраженным адаптивным потенциалом и менее существенными дизадаптивными расстройствами характеризуются стресс-устойчивые особи.
Положения, выносимые на защиту.
-
Хронический стресс различной модальности (иммобилизационный, метаболический, зоосоциальный, гравитационный) сопровождается понижением поверхностно-активных свойств легочного сурфактанта за счет изменения спектра альвеолярных фосфолипидов, который характеризуется, главным образом, увеличением доли лизофосфатидилхолина.
-
Аналог лей-энкефалина даларгин в условиях иммобилизационного и метаболического стресса оказывает корригирующее влияние на состав фосфолипидов и, в меньшей степени, на поверхностную активность сурфактанта, не влияя при этом на стресс-индуцированные изменения водного баланса легких. При метаболическом стрессе действие даларгина наиболее эффективно.
-
Понижение функциональных свойств сурфактанта легких при стрессовых воздействиях различного генеза выражено в большей степени у стресс-неустойчивых крыс. У этой же категории животных на фоне стресса существенно нарушается водный баланс легких, что сопровождается накоплением экстраваскулярной жидкости. Степень изменений сурфактантной системы, состава фосфолипидов и водного баланса легких определяется модальностью и интенсивностью действия стресс-индуцирующих факторов, а также индивидуальной стресс-устойчивостью особей.
Теоретическая и практическая значимость работы. Работа является первым систематическим экспериментальным исследованием реализации механизмов влияния индивидуальной устойчивости к стрессу на сурфактантную систему легких.
В работе показано, что направленность и степень изменений состояния поверхностной активности, липидного спектра и водного баланса легких в условиях хронического стресса зависят как от модальности и продолжительности действия стрессоров, так и от прогностической стресс-устойчивости животных.
Обнаруженное в исследовании протекторное действие даларгина, ограничивающего стресс-индуцированные изменения сурфактантной системы легких, открывает дальнейшие перспективы для возможной фармакологической коррекции стрессорных повреждений легких в медицине и ветеринарии.
Данные о характере взаимосвязи поверхностно-активных свойств сурфактанта с изменениями спектра фосфолипидов сурфактанта и водного баланса легких в условиях стресса являются теоретической основой для понимания механизмов их нарушений при действии экстремальных факторов, что имеет немаловажное значение для физиологии и практической медицины.
Изменения сурфактантной системы легких, полученные на использованных нами моделях микрогравитации, позволяют объяснить ряд ранее выявленных в условиях реальной и моделированной невесомости феноменов, связанных с респираторными функциями. Полученные данные позволяют в дальнейшем разработать стратегию, направленную на оптимизацию функционального состояния сурфактантной системы легких в условиях космического полета.
Данные о состоянии сурфактантной системы легких при стрессах различного генеза внедрены в учебный процесс на кафедрах нормальной физиологии, патофизиологии и биохимии ГБОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия».
Достоверность полученных данных. Достоверность полученных данных достигнута использованием достаточного для исследования количества наблюдений, конкретной постановкой и решением поставленных задач с использованием адекватных статистических методов. Достоверность различий между группами оценивали по U-критерию Манна-Уитни. Корреляциооные взаимосвязи выявляли на основании рангового теста Спирмена.
Апробация работы. Основные положения диссертации изложены на VIII Международном конгрессе «International society for adaptive medicine» (ISAM) (Москва, 2006), V Международном симпозиуме «Актуальные проблемы биофизической медицины» (Киев, 2007), межрегиональной научной конференции «Патофизиология современной медицине» (Ижевск, 2007), XX съезде Физиологического общества имени И.П. Павлова (Москва, 2007), VI, VII Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (С-Пб, 2008, 2009), II съезде физиологов СНГ (Кишинев, 2008), VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008), 1-й Всероссийской научно-практической конференции «Физиология адаптации» (Волгоград, 2008), научно-практической конференции «Современные методы реабилитации» (Ижевск, 2009), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009), X Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2009), XXI съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Калуга, 2010), Космическом форуме с международным участием, посвященном 50-летию полета в космос Ю.А. Гагарина (Москва, 2011), III Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Ялта, Украина, 2011), IV Всероссийской научной конференции с международным участием «Микроциркуляция в клинической практике» (Москва, 2012), IV международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (С-Пб, 2012), XXII съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013), XIV Конференции по космической биологии и авиакосмической медицине с международным участием (Москва, 2013).
Публикации по теме диссертации. Основное содержание диссертации отражено в 45 публикациях, из них 13 в журналах, рекомендованных ВАК, 1 монография.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 6 глав результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Материал диссертации изложен на 268 страницах, иллюстрирован 29 таблицами и 37 рисунками. Список литературы содержит 529 источников, в том числе 202 отечественных и 327 зарубежных.
Соавторство и благодарности. Автор выражает глубокую признательность к.б.н. С.В. Протасовой (каф. биохимии ГБОУ ВПО ИГМА МЗ РФ, зав. каф. – д.м.н., проф. Е.Г. Бутолин) за помощь в определении содержания 11-ОКС, глюкозы и гликозилированного гемоглобина в крови; зав. лаб. миологии ФГБУН ГНЦ РФ Института медико-биологических проблем РАН д.б.н., проф. Б.С. Шенкману за совместную работу в проведении экспериментов по моделированной микрогравитации на мышах линии C57Bl/6.
Современные представления о составе, функциях и регуляции метаболизма сурфактантной системы легких
Согласно сложившейся концепции (Л.К. Романова, 1983; Г.Н. Паневская и соавт., 1986; Е.Н. Нестеров, Г.Н. Паневская, 2000; В.В. Ерохин, Л.К. Романова, 2000; M. Post, L.M.G. ven Golde, 1988; J.P. Wright, L.G. Dobbs, 1991; E.M. Scarpelly, 1995; B.T. Smith, 1995; H.L. Halliday, 2008; J. Perez-Gil, 2008; Z.C. Chroneos et al., 2009), сурфактантная система легких в настоящее время представляется многокомпонентной, сложно организованной системой, к которой относят альвеолоциты II типа как единственный источник материала сурфактанта и альвеолярный выстилающий слой, представленный двумя фазами – мономолекулярной пленкой структурированных фосфолипидов и протеинов, адсорбированных на межфазной границе «жидкость-воздух», и гипофазой, состоящей из слоя жидкости неравномерной толщины, находящейся непосредственно на альвеолярном эпителии. По мнению некоторых авторов (Л.К. Романова, 1983, 1994; В.В. Ерохин, 1987; B. Robertson, 1995), к сурфактантной системе легких также следует отнести альвеолярные макрофаги, участвующие в процессах катаболизма сурфактанта. Главной функцией сурфактантной системы легких является понижение поверхностного натяжения на выдохе и предотвращение экспираторного коллапса в альвеолах (А.А. Биркун и соавт., 1981; В.А. Березовский и соавт., 1984; И.А. Серебровская, Л.В. Коваленко,1997; В.В. Ерохин, Л.К. Романова, 2000; C.R. Mendelson, 2000; F. Lhert et al., 2007; J.B. West, 2008; V. Besnard et al., 2010). По данным ряда авторов (W. Bernhard, 1995, J.M. Hohlfeld, 1995; W. Bernard et al., 2004), сурфактант содержится не только в альвеолах, но и в бронхиолах, предотвращая их коллабирование. Согласно многочисленным исследованиям, сурфактант выполняет ряд других важных функций: барьерно-очистительную, бактерицидную, мембраностабилизирующую, трофическую, иммуномодулирующую, антирадикальную, участвует в процессе испарения воды и регуляции массопереноса кислорода через альвеолокапиллярную мембрану (В.А. Березовский, 1982; Л.К. Романова, 1994; В.В. Ерохин, 1996; П.А. Мотавкин, Б.И. Гельцер, 1998; Е.Н. Нестеров, Г.Н. Паневская, 2000; Л.Н. Лепеха и соавт. 2011; В.С. Моисеев, 2011; S. Matalon et al., 1990; D. S. Phelps, 2001; H. Taeush et al., 2002; S. Saxena, 2005; J.R. Wright, 2005; U. Christmann et al., 2009). Таким образом, названные функции сурфактанта способствуют поддержанию гомеостазиса легких, особенно в условиях действия неблагоприятных факторов внешней среды.
В составе легочного сурфактанта выделяют около 80% фосфолипидов, 8% нейтральных липидов (холестерина и свободных жирных кислот) и 12% белков, которые синтезируются, секретируются и утилизируются альвеолоцитами II типа (S. Saxena, 2005; Z.C. Chroneos et al., 2009). Наиболее важными компонентами сурфактанта являются фосфолипиды, прежде всего дипальмитоилфосфатидилхолин (A.D. Postle et al., 2001; 2011), который опосредует основную функцию сурфактанта – снижение поверхностного натяжения (В.В. Ерохин, Л.К. Романова, 2000; E.J. Veldhuizen, H.P. Haagsman, 2000; X. Chen et al., 2006). Дипальмитоилфосфатидилхолин составляет около 50% спектра альвеолярных фосфолипидов (J.J. Batenburg, H.P. Haagsman, 1998; J. Goerke, 1998; Z.C. Chroneos et al., 2009). Последние данные показывают, что помимо дипальмитоилфосфатидилхолина – основного вида фосфатидилхолина – в молекулярной композиции альвеолярного сурфактанта взрослого человека, а также других млекопитающих и птиц присутствуют еще два, а именно пальмитоилмиристоил и пальмитоилпальмитолеоил, которые избирательно выделяются из альвеол млекопитающих (W. Bernhard et al., 2001; 2011). Интересно, что в отличие от взрослых, в составе поверхностно-активных веществ легких новорожденных детей, имеющих большую частоту дыхания, а также новорожденных свиней, крыс, мышей содержатся высокие концентрации этих компонентов. У взрослых млекопитающих их содержание также коррелирует с частотой дыхания. Предположили, что повышенная концентрация дробных, так называемых "минорных компонентов" фосфатидилхолина важна для поддержания нормальной функции (и дальнейшего развития) легких млекопитающих после рождения, а также дифференциации альвеолярных макрофагов (G. C. Burdge et al.,1993; E.M. Vlachaki et al., 2010; W. Bernhard et al., 2011).
Среди фосфолипидов сурфактанта, помимо фосфатидилхолина, обнаружены фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерин, фосфатидная кислота и небольшое количество лизоформ фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина (П.А. Мотавкин, Б.И. Гельцер, 1998; R.J. King, 1982; E.J. Veldhuizen, H.P. Haagsman, 2000). Фосфатидилглицерин, составляющий около 10% в составе фосфолипидов поверхностной выстилки легкого так же, как и фосфатидилхолин, способствует редукции сил поверхностного натяжения, а также выполняет роль стабилизатора сурфактанта и ускоряет формирование тубулярного миелина в монослое (M.L. Choukroun et al., 1994; J.B. Grotberg et al., 1995; D. Halpern et al., 1995). Важную роль в стабилизации поверхностно активного комплекса играет фосфатидилинозитол, связанный с фосфатидилглицерином инверсионно (П.А. Мотавкин, Б.И. Гельцер, 1998). Роль остальных фосфолипидных классов поверхностно-активных веществ легкого нуждается в дополнительном изучении (R. Ramanathan, 2009). Cфингомиелин содержится в сурфактанте в количестве от 4 до 13%. Определение соотношения фосфатидилхолин/сфингомиелин проводится для оценки созреванияи функциональной полноценности легких (C.A. Foerder et al., 1986). Фосфатидилэтаноламин рассматривается исследователями в основном как предшественник в синтезе фосфатидилхолина. Содержание его составляет примерно 5%. Представляет интерес для функции сурфактанта производное фосфатидилэтаноламина – N-ацилфосфатидилэтаноламин, который, обладая поверхностно-активными свойствами и кальцийрегулирующей активностью, может иметь непосредственное отношение к обеспечению функций легочного сурфактанта (V. Natarajan et al., 1986). Особую роль стабилизатора липидного биослоя играет холестерин (П.А. Мотавкин, Б.И. Гельцер, 1998), составляющий 14-20 молярных % от уровня альвеолярных липидов. Полагают, что синтез холестерина может быть функционально значимым в продукции сурфактанта легкими плода (J.J. Batenburg, 1992). S. Orgeig, C.B. Daniels (2001) предположили, что холестерин играет роль «протосурфактанта» в незрелых легких млекопитающих. Выделены также сурфактантные протеины, которые составляют не более 1-10% в липидных экстрактах легочного сурфактанта, но играют чрезвычайно важную роль в функционировании и структурном оформлении сурфактантной системы легких (Е.Н. Нестеров, Г.Н. Паневская, 2000; F. Possmayer, 1988, 2000; J. Perez-Gil, 2008; Z.C. Chroneos et al., 2009). Белки сурфактанта (SP) функционально разделены на две группы, в частности SP-В и SP-С являются гидрофобными и имеют непосредственное отношение к адсорбции и распределению фосфолипидов (H. Taeush, 2002; S. Saxena, 2005), ускоряя их «встраивание» в монослой (B.T. Smith, 1995). В экспериментах на трансгенных мышах, у которых вызывали дефицит SP-В, необходимого для быстрой адсорбции поверхностно-активных веществ (F. Possmayer et al., 2001), было показано, что наступает летальный исход на фоне нарушенного формирования ламеллярных телец, тубулярного миелина и активного монослоя фосфолипидов на границе фаз жидкость-воздух (L.M, Nogee et al., 1994; J.C. Clark et al., 1995; J.A. Whitsett et al., 1995; K. Tokieda et al., 1997; F.A. Schuerman, 2008). По мнению V. Besnard et al. (2010), SP-В и SP-С играют решающую роль в процессах формирования сурфактанта и обеспечении его функций.
Сурфактант легких при хроническом эмоциональном стрессе у крыс с различной стресс-устойчивостью
В настоящее время многие исследователи используют индивидуальный подход к анализу различных проявлений эмоционального стресса. Единичные работы посвящены изучению регуляции метаболизма и физиологической активности легочного сурфактанта в условиях эмоционального стресса у животных с разной степенью индивидуальной устойчивости к нему (И.Г. Брындина, 2002; А.В. Сорокин, 2009). В данной экспериментальной серии исследовали функциональные свойства легочного сурфактанта в динамике развития хронического иммобилизационного стресса на 10, 20, 30, 45 и 60 дни опытов у стресс-устойчивых и стресс-неустойчивых крыс. Рисунок 3.1 - Показатели поверхностной активности легочного сурфактанта при иммобилизационном стрессе у стресс-устойчивых и стресс-неустойчивых крыс: - статистически значимые отличия от контроля, # -статистически значимые отличия между СН и СУ. Так, на 10-й у всех животных возрастали показатели ПН и снижался индекс стабильности, но при этом у активных особей цифры статического и минимального ПН были ниже по сравнению с группой пассивных крыс (р0,05). На 20-е сутки значения ПН в обеих группах оставались повышенными на фоне низких цифр индекса стабильности альвеол, но по-прежнему показатели ПН стресс-устойчивых животных были достоверно ниже. На 30-й день сохранялись аналогичные предыдущему сроку изменения поверхностной активности, но межгрупповых отличий выявлено не было. К 45-му дню стресса было зафиксировано наименьшее значение индекса стабильности у предрасположенных к стрессу особей, составившее 66% (р0,001) от контрольного уровня и 68% (р0,01) от соответствующего значения стресс-устойчивых животных, при этом все показатели ПН достоверно превышали аналогичные цифры СУ крыс, у которых на данном сроке эксперимента изучаемые показатели имели наименьшие изменения из всех наблюдаемых временных отрезков. На 60-й день повышение ПН сохранялось в обеих группах, в большей степени у СН особей (р0,01), при этом индекс стабильности у активных крыс уменьшился по отношению к 45-му дню на 20% (р0,01), но тем не менее был выше, чем у пассивных крыс (р0,05).
Обнаружены межгрупповые различия у стресс-устойчивых и стресс-неустойчивых крыс по такому показателю, как количество общих фосфолипидов БАС (таблица 3.2). Если у СУ животных наблюдалось повышение количества ОФЛ на протяжении всего эксперимента, за исключением 30-х суток, то у СН особей повышение данного показателя было зафиксировано только на 45-й день, а к 60-му дню он был ниже контрольных цифр. Так, содержание фосфолипидов у стресс-устойчивых крыс на 10-й день составило 48,86 ± 5,71 мкмоль/г при 38,37 ± 4,33 мкмоль/г в контроле (р0,05), что на 47% (р0,05) было выше по сравнению со стресс-неустойчивыми особями, у которых этот показатель достоверно не изменялся. На 20-е сутки у активных крыс прирост количества ОФЛ составил 54% (р0,05) по отношению к исходным цифрам и 85% (р0,01) по отношению к группе сравнения. К 30-му дню достоверных изменений в содержании ОФЛ выявлено не было, но у СУ особей произошло снижение данного показателя относительно предыдущего срока наблюдения на 53% (р0,05). 45-й день выявил увеличение исследуемого показателя, составившего у стресс-устойчивых крыс 77,26 ± 2,35 мкмоль/г (р0,01) и у стресс-неустойчивых - 59,21 ± 4,7 мкмоль/г (р0,05), межгрупповая разница при этом равнялась 30% (р0,01). К 60-му дню у активных животных сохранялось повышенное относительно контроля количество ОФЛ (52,37 ± 4,81 мкмоль/г, р0,05), тогда как у пассивных животных произошло снижение данного показателя и по отношению к контролю (на 40%, р0,05), и по отношению к группе сравнения (на 97%, р0,01). В составе фосфолипидов на фоне длительной иммобилизации возросла доля сфингомиелина. Так, на 10-й день его количество в процентном соотношении у активных крыс составило 26% (р0,01), у пассивных 22% (р0,05) при 15% в контроле. На 20-й день на фоне повышения количества ФЛ у стресс-устойчивых животных содержание данной фракции превысило исходный уровень (р0,01), а также соответствующее значение стресс неустойчивых крыс (р0,05), хотя относительная величина сфингомиелина в этой группе наблюдения была также повышена и составила 22%. К 45-му дню прирост абсолютных цифр сфингомиелина к контрольным показателям был отмечен в обеих группах (р0,01), при этом у СН крыс на данном сроке его значение было максимальным и в процентном соотношении – 27%. На 60-е сутки абсолютное значение данного показателя у пассивных крыс было в пределах контроля, но относительное содержание оставалось повышенным (23%), в то время как у активных животных уровень сфингомиелина был выше и по отношению к контролю (р0,01), и по отношению к значению группы сравнения (р0,01). Индекс фосфатидилхолин/сфингомиелин снижался относительно исходных величин на всем протяжении экспериментов. Межгрупповые различия по данному показатели были обнаружены на 10-й, 20-й и 45 дни, когда в группе СН животных этот коэффициент был ниже по сравнению со СУ особями. Содержание фосфатидилэтаноламина повышалось на всем протяжении эксперимента. Так, на 10-й день иммобилизации количество фосфатидилэтаноламина составило у стресс-устойчивых крыс 12,19 ± 1,64 мкмоль/г при 4,24 ± 0,44 мкмоль/г в контроле (р0,01), что превышало на 67% (р0,05) соответствующее значение стресс-неустойчивых особей, у которых данный показатель также был выше по сравнению с контрольной величиной на 77% (р0,05). В процентном соотношении на данном сроке цифры фосфатидилэтаноламина имели максимальное значение – 22% у СН животных и 25% у СУ против 11% в контроле. На 20-й день сохранялась повышенной доля фосфатидилэтаноламина в структуре общих фосфолипидов в обеих группах, при этом абсолютное значение данного показателя у активных крыс было достоверно выше, чем у пассивных (на 52%, р0,05). К 30-му дню содержание фосфатидилэтаноламина оставалось высоким как у пассивных (на 52%, р0,01), так и у активных крыс (на 52%, р0,01), но при этом отсутствовала межгрупповая разница по данному показателю. Аналогичные изменения были зафиксированы и на 45-е сутки. На 60-й день в группе СН крыс на фоне снижения общего количества фосфолипидов абсолютное значение фосфатидилэтаноламина не имело достоверных отличий от контрольных цифр, но его процентное содержание превышало исходный показатель (21% при 11% в контроле). У СУ животных отмечалось превышение по данному показателю относительно контрольных значений более чем в 2 раза (р0,01), а по отношению к соответствующей величине группы сравнения – на 75% (р0,01).
Сурфактант легких при введении даларгина на фоне хронического эмоционального стресса у крыс с различной стресс-устойчивостью
Основываясь на многочисленных литературных данных о стресс лимитирующем действии опиоидных пептидов, мы исследовали влияние синтетического аналога лей-энкефалина даларгина на сурфактантную систему легких в условиях хронического иммобилизационного стресса. В качестве контроля были использованы интактные животные, а также крысы, которым сочетали иммобилизацию с введением эквивалентного количества изотонического раствора натрия хлорида. Последний не оказывал воздействия на стресс-индуцированные изменения функциональной активности сурфактанта. Многократное системное введение даларгина на фоне иммобилизационного стресса частично восстанавливало показатели поверхностной активности легких (рисунок 5.1, 5.2). Рисунок 5.1 – Показатели поверхностной активности легочного сурфактанта при иммобилизационном стрессе и введении даларгина на фоне иммобилизационного стресса у стресс-неустойчивых крыс: - статистически значимые отличия от контроля, # - статистически значимые отличия между СН и СУ
Так, на 10-й день опытов у стресс-устойчивых крыс (рисунок 5.2) индекс стабильности альвеол был равен 0,54 ± 0,01, в то время как при стрессе 0,48 ± 0,01 (р0,01). Примечательно, что этот показатель при сочетанном воздействии у СУ крыс сохранялся в пределах исходных цифр на всем протяжении экспериментов в отличие от «чистого» стресса, при котором индекс стабильности оставался на уровне контрольных величин только на 45-е сутки.
Показатели поверхностной активности легочного сурфактанта при иммобилизационном стрессе и введении даларгина на фоне иммобилизационного стресса у стресс-устойчивых крыс: - статистически значимые отличия от контроля, # - статистически значимые отличия между СН и СУ Аналогичный показатель стресс-неустойчивых животных был достоверно ниже и контрольных значений, и соответствующего показателя группы сравнения в течение 45 дней, что также было характерно для изолированного стресса. При этом на 45-й день индекс стабильности у СН крыс при введении даларгина составил 0,47 ± 0,003, тогда как при стрессе – 0,37 ± 0,01 (р0,01), а к 60-му дню инъекций даларгина данный показатель не имел достоверных отличий от контроля, но все же был ниже показателя СУ животных (р0,05). Нужно отметить, что цифры ПН в обеих группах наблюдения были стабильно высокими, как при стрессе, но введение аналога лей-энкефалина сглаживало межгрупповые отличия (таблица 5.1).
Так, превышение уровня статического ПН у пассивных крыс сохранялось по сравнению с активными только на 10-й и 45-й день: 35,28 ± 0,24 мН/м против 33,24 ± 0,17 мН/м (р0,01) и 34,6 ± 0,34 мН/м против 32,85 ± 0,28 мН/м (р0,01) соответственно. Показатели минимального и максимального ПН ни на одном из сроков наблюдения не имели межгрупповых отличий. Изменения фосфолипидов у стресс-устойчивых крыс в данной серии опытов (таблица 5.2) имели такую же направленность, как при изолированном стрессе - количество их увеличивалось. Таблица 5.2 - Фосфолипиды легочного сурфактанта при введении даларгина на фоне иммобилизационного стресса у стресс-устойчивых и стресс неустойчивых крыс Повышение уровня ОФЛ в данной группе животных наблюдалось на всем протяжении сочетанного воздействия, при этом прирост в содержании изучаемого показателя был выше, чем при стрессе: на 10-й день 69,16 ± 6,31 мкмоль/г против 48,86 ± 5,71 мкмоль/г (р0,05), на 20-й – 79,39 ± 5,24 мкмоль/г против 58,96 ± 5,55 мкмоль/г (р0,05), на 30-й день – 53,7 ± 6,86 мкмоль/г против 38,44 ± 5,25 мкмоль/г (р0,05). На последующих сроках увеличение количества ОФЛ по отношению к исходным цифрам было сопоставимым в сравниваемых сериях. У стресс-неустойчивых животных динамика данного показателя несколько отличалась от «чистого» стресса. Если при стрессе уровень фосфолипидов не претерпевал существенных изменений в течение 30 дней наблюдений, то при введении даларгина их количество увеличивалось к 30-му дню на 41% (р0,01) по отношению к контролю, сохранялось высоким на 45-е сутки (на 68%, р0,01) и к 60-му дню не имело достоверных отличий от контрольных величин. Нужно отметить также, что на 60-й день при иммобилизации в этой группе наблюдения отмечалось снижение уровня фосфолипидов, которое на фоне инъекций даларгина восстанавливалось. При этом на всех сроках эксперимента, за исключением 30-го дня, уровень фосфолипидов у активных животных был выше, чем у пассивных. Изменения фракционного состава альвеолярных фосфолипидов (рисунок 5.3, 5.4), вызванные стрессом, уменьшались при введении даларгина. Содержание основной фракции – фосфатидилхолина – восстанавливалось полностью у СУ крыс уже с 10-го дня сочетанного воздействия и составило 54% при 51% в контроле, в то время как при стрессе было равно лишь 21%. На протяжении всего периода наблюдений в этой опытной группе уровень фосфатидилхолина в процентном соотношении был в пределах контрольных значений, а в абсолютных цифрах за счет высокого содержания общих фосфолипидов превышал контрольные значения. У СН крыс также происходило восстановление данного показателя, но на всех сроках эксперимента его величина была меньше, чем в группе сравнения. Так, на 20-й день при сочетанном воздействии количество фосфатидилхолина составило 12,87 ± 1,59 мкмоль/г при 19,44 ± 1,67 мкмоль/г в контроле (р0,05) и 46,39 ± 3,22 мкмоль/г в группе СУ животных (р0,01), но по сравнению с изолированным стрессом было выше на 61% (р0,05). Аналогичные изменения были отмечены на 60-й день, а на сроках 10 и 30 дней исследуемый показатель не имел достоверных отличий от контроля. К 45-му дню абсолютная величина фосфатидилхолина у пассивных крыс была больше контрольной на 66% (р0,01).
Уровень лизофосфатидилхолина, в десятки раз повышавшийся при иммобилизации, на фоне инъекций аналога лей-энкефалина уменьшался. Если при стрессе в течение всего эксперимента уровень данной фракции был стабильно высоким, то при введении даларгина к 60-му дню постепенно снижался: у стресс-неустойчивых животных он составил 13% при 26% на фоне стресса (р0,01), у стресс-устойчивых - 9% при 24% без введения пептида (р0,001). Соотношение фосфатидилхолин/лизофосфатидилхолин при сочетанном воздействии частично восстанавливалось по сравнению со стрессом. Так, наименьшее его значение при иммобилизации было зафиксировано на 10-й и 60-й день, составив 0,74 ± 0,05 и 0,63 ± 0,05 у СН особей при 50,3 ± 1,64 в контроле (р0,001), у СУ крыс - 0,98 ± 0,13 и 0,82 ± 0,04 при 50,37 ± 0,87 в контроле (р0,001), в то время как на фоне инъекций даларгина эти значения достигли 2,85 ± 0,18 и 3,63 ± 0,24 (р0,01 к стрессу) у пассивных крыс, а у активных - 4,47 ± 0,37 и 5,94 ± 0,29 (р0,01 к стрессу) на 10-й и 60-й день.
Сурфактант легких при введении даларгина на фоне аллоксанового диабета у крыс с различной стресс-устойчивостью
Учитывая данные литературы об антиоксидантных свойствах даларгина, мы предприняли попытку изучить особенности его влияния на изменения поверхностной активности и биохимического состава сурфактанта, провоцируемые аллоксановым диабетом, который реализует свое действие запуском процессов образования свободных радикалов в клетках. При аллоксановом диабете на фоне многократных инъекций даларгина понижение поверхностно-активных свойств легких становилось менее выраженным (таблица 6.1). Так, у стресс-неустойчивых крыс (рисунок 6.1) на 10-й день минимальное ПН было равно 22,08 ± 0,22 мН/м, тогда как при диабете – 27,17 ± 0,47 мН/м (р0,01).
Индекс стабильности в этой группе при сочетанном воздействии был на уровне контрольных величин, тогда как при «чистом» диабете снижение составляло 13% (р0,05), при этом введение даларгина сглаживало и межгрупповые различия по данным показателям. У стресс-устойчивых крыс (рисунок 6.2) введение даларгина также снижало степень изменений поверхностной активности легочного сурфактанта. Провоцируемое аллоксановым диабетом повышение в структуре фосфолипидов сфингомиелина на фоне введения даларгина восстанавливалось – достоверных отличий от исходных цифр зафиксировано не было, при этом на сроке 30 и 60 дней содержание данной фракции у стресс-устойчивых животных (рисунок 6.4) было ниже по отношению к стресс-неустойчивым (р0,05). Однако, коэффициент фосфатидилхолин / сфингомиелин был ниже контроля на протяжении 30 дней наблюдения у СУ животных и 45 дней – у СН. Так, на 10-й день этот коэффициент у пассивных крыс составил 1,93 ± 0,18 против 3,45 ± 0,07 в контроле (р0,001), что также было ниже соответствующего значения активных животных – 2,6 ± 0,11(р0,05). На 20-й и 45-й день у СУ крыс изучаемый показатель был выше по сравнению с цифрами СН особей. К 60-му дню сочетанного воздействия данный показатель восстанавливался относительно контроля в обеих группах.
Уровень фосфатидилэтаноламина во все изучаемые сроки достоверно не отличался от контрольных значений, тогда как при диабете содержание его было повышено. Так, максимальный подъем данного показателя на фоне диабета у стресс-устойчивых крыс пришелся на 10-й день и составил 12,62 ± 0,83 мкмоль/г при 4,24 ± 0,44 мкмоль/г в контроле (р0,001), а при введении даларгина – 4,98 ± 0,38 мкмоль/г (р 0,05). У стресс-неустойчивых особей максимальные изменения в содержании фосфатидилэтаноламина были отмечены на 30-й день: 13,84 ± 1,0 мкмоль/г при 4,12 ± 0,55 мкмоль/г в контроле (р0,001), при сочетанном воздействии – 5,1± 0,39 мкмоль/г (р 0,05).
Состояние водного баланса легких (рисунок 6.5) при введении даларгина не претерпевало никаких изменений на протяжении 20 дней по отношению к контролю, в то время как при изолированном диабете у стресс-неустойчивых крыс было снижено кровенаполнение. Однако, сочетанное воздействие не устраняло вызываемое диабетом накопление общей и внеклеточной жидкости на последующих сроках у СН животных (таблица 6.3). Более того, у СУ особей при введении даларгина отмечалось увеличение общей жидкости легких в сочетании со снижением сухого остатка на 30-й и 45-й дни (р0,05), чего не наблюдалось при изолированном диабете. К 60-му дню у пассивных крыс сохранялось, как при диабете, увеличение общей жидкости (83,46 ± 0,37 при 80,91 ± 0,49 в контроле, р0,01), при этом оно было больше значения активных особей (80,75 ± 0,83, р0,01), у которых на данном сроке показатели водного баланса легких соответствовали исходным величинам.
Так, на 10-й день, когда изолированный диабет вызывал максимальный подъем уровня глюкозы в крови как у стресс-устойчивых (9,84 ± 0,36 ммоль/л против 5,65 ± 0,18 ммоль/л в контроле, р0,001), так и у стресс-неустойчивых крыс (9,38 ± 0,46 ммоль/л при 5,93 ± 0,99 ммоль/л в контроле, р0,001), сочетанное воздействие приводило к меньшей степени гипергликемии у СУ особей (7,51 ± 0,19 ммоль/л, р0,001 к диабету), что было также меньше значения СН крыс (8,66 ± 0,24 ммоль/л, р0,01). На 20-й день введения даларгина происходило снижение уровня глюкозы у пассивных крыс по сравнению с «чистым» диабетом – с 8,28 ± 0,08 ммоль/л до 6,81 ± 0,22 ммоль/л (р0,001). К 30-му дню содержание глюкозы в крови активных крыс под влиянием даларгина не имело достоверных различий с контролем и было ниже соответствующего значения при изолированном диабете (р0,05). На 45-й день введения даларгина у стресс-неустойчивых животных уровень гликемии был выше исходных величин на 21% (р0,001), но при этом ниже значений крыс с «чистым» диабетом на 28% (р0,01) и показателя стресс-устойчивых особей на 18% (р0,001). К 60-му дню содержание глюкозы у СН крыс оставалось несколько повышенным, но ввиду больших индивидуальных колебаний не имело достоверных отличий от контроля и от показателя СУ животных.
