Содержание к диссертации
Введение
Глава I Обзор литературы И
1.1 Современные аспекты механизма стресса 11
1.2 Окислительный стресс и центральная нервная система 12
1.3 Роль радикалообразования в жизнедеятельности клетки и система антиоксидантной зашиты 19
1.4 Физиологическая роль тиоловых соединений и участие глютатиона в обеспечении антиоксидантной защиты 19
1.5 Роль митохондриального глютатиона при окислительном стрессе 27
1.6 Антиоксиданты, потенцирующие действие глютатиона 32
ГЛАВА II Материалы и методы исследования 38
2.1 Изоляция митохондрий головного мозга крыс в модификации Lai, Clark (1979) 39
2.2 Измерение митохондриального коэффициента дыхательного контроля 41
2.3 Инкубация церебральных митохондрий с t-BuOOH (50- 500 мкмоль/мл) 42
2.4 Метод определения TSH, TSST, ESSF с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения 43
2.5 Измерение глютатион-белковых смешанных дисульфидов церебральных митохондрий по Livesey, Reed 45
2.6 Определение продуктов перекисного окисления липидов (малонового диальдегида) с помощью тиабарбитуровой кислоты по В.А.Костюк, А.И.Потапович 46
ГЛАВА III Собственные исследования изменения уровня глютатиона и формирование белково-связанной смешанно-дисульфидной формы глютатиона (essf) в результате окислительного стресса вызванного инкубацией церебральных митохондрий белых крыс линии fisher
3.1 Изменения уровня глютатиона церебральных митохондрий при окислительном стрессе in vitro 47
3.2 Формирование белково-связанной смешанно-дисульфидной формы глютатиона (ESSF) при окислительном стрессе, вызванном инкубацией церебральных митохондрий с t-BuOOH 54
3.3 Формирование продуктов перекисного окисления липидов (малонового диальдегида) церебральными митохондриями при окислительном стрессе, вызванном инкубацией с t-BuOOH 5 8
ГЛАВА IV Изменение уровня митохондриального глютатиона при окислительном стрессе ш vivo, поддерживающая роль аскорбиновой кислоты 61
4.1 Изменение концентрации глютатиона, продуктов ПОЛ митохондрий головного мозга крыс при введении BSO 61
4.2 Изменения концентрации глютатиона, интенсивности ПОЛ при введении аскорбиновой кислоты 65
4.3 Изменения концентрации глютатиона, интенсивности ПОЛ при BSO-индуцированном окислительном стрессе на фоне сочетанного использования аскорбиновой кислоты и витамина
Выводы 82
Практические рекомендации 84
Список использованных источников
- Современные аспекты механизма стресса
- Изоляция митохондрий головного мозга крыс в модификации Lai, Clark (1979)
- Изменения уровня глютатиона церебральных митохондрий при окислительном стрессе in vitro
- Изменение концентрации глютатиона, продуктов ПОЛ митохондрий головного мозга крыс при введении BSO
Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время стресс характеризуют, как генерализованную реакцию напряжения, возникающую в связи с действием факторов, которые угрожают жизнедеятельности организма и требуют интенсивной мобилизации его адаптационных возможностей со значительным превышением диапазона повседневных колебаний. (Selye Н., 1979; Тапбергенов CO., 1998). Одной из основных форм стрессорных реакций организма является окислительный стресс.
К числу причин, вызывающих окислительный стресс, относятся физические (радиация, ультрафиолетовое облучение, вибрация), химические (действие различных ксенобиотиков), биологические (нарушение метаболических реакций, гипоксия, аноксия, гипероксия) и другие факторы (Логинов А.С., Матюшин, Б.Н., 1991; Осипов А.И., Азизова О.А., Владимиров Ю.А., 1990; Bannister J.V., Bannister W. Н., НШ Н. О., 1982; Cadenas Е., 1989; Sies Н., 1986).
Однако остаются еще недостаточно выясненными источники и пусковые механизмы образования активных форм кислорода на клеточном и субклеточом уровне, а именно вовлечение структурных элементов, наиболее подверженных влиянию окисляющих агентов, и осуществление антиоксидантной защиты на клеточном уровне.
В настоящее время меняется подход к изучению проблемы окислительного метаболизма в связи с пониманием его дуалистического характера. Окислительные процессы являются факторами патогенеза многих заболеваний (гипертоническая болезнь, ишемическая болезнь сердца, онкологические заболевания, дегенеративные заболевания центральной нервной системы), в то же время непрерывная продукция активных форм кислорода является одним из важных побочных продуктов нормальных физиологических функций в организме (Биленко М. В., 1989; Зенков Н. К., Меньшикова Е. Б., 1993). Несмотря на успехи, достигнутые в последние годы в понимании сути этих вопросов, механизмы адаптации и защиты при окислительном стрессе остаются спорными. Усиленная выработка активных форм кислорода является опасной для организма человека и животных, однако, в условиях нормального метаболизма, действие окислительных агентов эндогенного происхождения не является фатальным в связи с существованием сложной многокомпонентной комплексной системы антирадикальной и антиперекисной защиты, составляющей в целом антиоксидантный статус организма.
В нормальных физиологических условиях, активные формы кислорода образуются в ряде процессов, среди которых в последнее время ведущую роль отводят электронно-транспортной цепи митохондрий. Установлено, что около 90 % всего кислорода поглощенного клетками организма, доставляется в митохондрии, где происходит четырехступенчатое восстановление молекулярного кислорода с образованием воды в дыхательной цепи, сопряженное с синтезом аденозинтрифос-фата (Chance et al, 1979; Cadenas, 1989). Остаются еще не достаточно изученными вопросы защитного действия митохондриальных антиок-сидантных систем в условиях нормогенеза и при окислительном стрессе (Reed etal, 1994).
Недостаточно изучены окислительные процессы в центральной нервной системе - ткани, богатой непредельными жирными кислотами, постоянно подвергающихся перекисному окислению; усиленно снабжаемой кислородом, имеющей ткани, богатые железом (substancia nigra); все эти факторы являются свидетельством наличия высокого уровня окислительного метаболизма (Handelman, Dratz, 1986).
Наше исследование направлено на изучение физиологических, компенсаторно-приспособительных реакций живой клетки при окислительном стрессе.
Все еще остается открытым вопрос о роли антиоксидантов в обеспечении поддержания защитной функции митохондриального глюта-тиона при окислительном стрессе in vivo.
Цель исследования:
Целью настоящего исследования явилось изучение влияния окислительного стресса на показатели тиолового гомеостаза митохондрий головного мозга экспериментальных животных и участия биологических антиоксидантов в обеспечении их функции.
Задачи исследования:
Изучить изменения общего, восстановленного и окисленного глюта-тиона, уровня глютатион-белковых смешанных дисульфидов, малонового диальдегида в митохондриях головного мозга экспериментальных животных при окислительном стрессе in vitro.
Сопоставить содержание общего, восстановленного и окисленного глготатиона в митохондриях головного мозга подопытных крыс при окислительном стрессе in vivo,
Дать оценку влияния биологических антиоксидантов в обеспечении защитной функции митохондриального глютатиона при окислительном стрессе.
Научная новизна:
Впервые изучено влияние окислительного стресса на митохондрии головного мозга при их инкубации с индуктором окислительного стресса трет-бутил гидропероксидом (t-BuOOH) и прослежен характер изменений общего, восстановленного, окисленного глютатиона при окислительном стрессе митохондрий головного мозга in vitro,
Прослежен характер изменений общего, восстановленного, окисленного глютатиона митохондрий головного мозга при окислительном стрессе in vivo.
Изучена роль аскорбиновой кислоты в поддержании защитной функции митохондриального глютатиона при окислительном стрессе in vivo.
Изучена роль сочетанного потенцирующего действия а-токоферола и аскорбиновой кислоты в поддержании уровня митохондриального глютатиона.
Практическая значимость
Разработана модель изучения окислительного стресса на митохондриях головного мозга при инкубации с индуктором окислительного стресса трет-бутил гидриопероксидом (t-BuOOH). Показана зависимость изменений митохондриального глютатиона от концентрации окисляющего агента (t-BuOOH) при окислительном стрессе in vitro.
Прослежен характер изменений митохондриального глютатиона при окислительном стрессе вызванном введением ингибитора синтеза глютатиона бутионин сульфоксимина (ВSO).
Доказана роль аскорбиновой кислоты в обеспечении защитной функции митохондриального глютатиона при окислительном стрессе in vivo. Выявлена наиболее оптимальная дозировка аскорбиновой кислоты, обеспечивающая наименьшее снижение митохондриального глютатиона при окислительном стрессе, вызванном BSO. Доказана необходимость сочетанного использования аскорбиновой кислоты и витамина Е для снижения последствий воздействия окислительного стресса на митохондриальный глютатион.
Основные положения, выносимые на защиту:
Инкубация митохондрий головного мозга с индуктором окислительного стресса трет-бутил гидр опер оксидом (t-BuOOH) показала необратимое снижение митохондрильного глютатиона при инкубации с 50 мкМ t-BuOOH, в отличие от митохондрий печеночной ткани» для которых доза t-BuOOH, вызвавшая необратимое снижение митохондриального глютатиона была в 40 раз выше (2 мМ). При инкубации митохондрий головного мозга с t-BuOOH не было обнаружено значительного повышения окисленного глютатиона даже при самой высокой концентрации t-BuOOH (50 мкМ), что, по-видимому, связано со сниженной концентрацией глютатион-пероксидазы и глютатион-редуктазы.
Большинство потерянного митохондриального глютатиона при инкубации с t-BuOOH было обнаружено в виде глютатион-белковых смешанных дисульфидов. Основная роль митохондриального глютатиона (TSH) это - поддержание внутримитохондриального тиоло-вого гомеостаза, восстановительное обезвреживание Н2О2 путем образования окисленного формы глюатиона (TSSr), с последующим переходом FSSF в восстановленную (FSH), однако быстрая потеря одновременно глютатиона и белковых тиоловых групп церебральными митохондриям после инкубации с t-BuOOH говорит о неадекватности данного пути в митохондриях головного мозга.
Роль аскорбата при окислительном стрессе вызванном дефицитом TSH в митохондриях состоит в поддержании уровня TSH путем обеспечения его восстановления из rSSF и также участии в реакции обезвреживания пероксида водорода. а-Токоферол участвует в регуляции митохондриального статуса Г8Н при окислительном стрессе путем восстановления аскорбиновой кислоты из ее окисленных продуктов, которые в дальнейшем участвуют в реакции обезвреживания пероксидов водорода; обеспечивает защиту мембраны митохондрий от окислительного разрушения.
Апробация диссертации
Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Современные методы диагностики» (Барнаул, 1999 г.), на научно-практической конференции молодых ученых «Новое в теоретической, экспериментальной и клинической медицине» (Алмати, 1999 г.), на конференции молодых ученых СГМА (1998 г.), на заседании научно-проблемной комиссии медико-биологических дисциплин «Движущие факторы общественного здоровья» (Семипалатинск, 1999 г.).
Публикации по теме диссертации
Основные положения диссертации освещены в 6 публикациях.
Практическое внедрение результатов работы
Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедрах нормальной физиологии и биохимии СГМА при изучении разделов «Физиология центральной нервной системы», «Окислительное повреждение и антиоксиданты». Экспериментальная модель оксидативного стресса используется в ЦНИЛ СГМА. БРИЗ СГМА утверждено рационализаторское предложение № 1974, 1998 г. «Способ оценки степени окислительного стресса на митохондрии головного мозга», выпущен информационный листок № 7-99 «Способ оценки степени окислительного стресса на митохондрии головного мозга». Получен предварительный патент на изобретение «Способ изучения влияния окислительного стресса на митохондрии головного мозга в эксперименте» (Решение о выдаче предварительного патента на изобретение №4056/2 от 3.08.1999).
Объем и структура диссертации:
Диссертация состоит из введения, 4 глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя использованных литературных источников, включающего 59 отечественных и 184 зарубежных автора. Объем диссертации составляет 100 страниц машинописного текста, 13 таблиц, 14 рисунков и диаграмм. Диссертация выполнена в рамках научной программы СГМА «Изучение механизмов и общих закономерностей влияния факторов окружающей среды на организм», №-госрегистрации 0198 РК 00514. Часть исследований была проведена в период научной стажировки в рамках программы «Болашак» в биохимической лаборатории профессора Donald J. Reed департамента биохимии и биофизики Орегонского Государственного университета, штат Орегон, США.
Современные аспекты механизма стресса
Понятие стресса, как неспецифической реакции организма на разнообразные воздействующие факторы, в последнее время подверглось существенному пересмотру. В настоящее время стресс характеризуют, как генерализованную реакцию напряжения, возникающую в связи с действием факторов, которые угрожают жизнедеятельности организма и требуют интенсивной мобилизации его адаптационных возможностей со значительным превышением диапазона повседневных колебаний. При этом, течение генерализованной реакции варьирует в зависимости от характера, силы и продолжительности стрессорного воздействия, конкретной стрессорной ситуации, исходного состояния организма и его функциональных резервов.
Сопоставление динамики изменений функции клеток, физиологических и биохимических процессов выявило однотипность первичных реакций на радиационные воздействия и на обычные,стрессорные факторы, хотя в более отдаленные сроки эти изменения не имеют сходства /2/.
Наблюдаемая при адаптации к повторным стрессовым воздействиям активация стресс-лимитирующих систем, в частности ГАМК-эргической, системы опиоидных пептидов, антиоксидантных систем, нростагландинов, существенно повышает резистентность организма к повреждающим фак торам /3/.
Гибкость стрессорных реакций зависит от функциональной взаимосвя зи различных звеньев нейроэндокринных регуляторных механизмов и биоэнергетических процессов.
Трансформированная из химической формы, энергия метаболизирую-щихся химических соединений в дальнейшем используется для осуществления всех функций клеток и органов, для обеспечения всех физиологических процессов организма, для обеспечения функционирования механизмов адаптации к стрессу.
Процессы, трансформирующие энергию в клетке, главным образом сосредоточены в митохондриях. Расположение митохондрий в клетке обуславливается их функциональным состоянием и органной специфично tll стью, но при этом все они сохраняют общие характерные морфологические и функциональные особенности.
Многообразие процессов, связанных с накоплением и освобождением энергии в митохондриях, тесно переплетающихся или исключающих друг друга, способных подчиняться малейшим изменениям внутренней и внешней среды и в то же время находящихся в динамическом постоянстве, бесконечно удивляет человеческое воображение. Митохондрии любой клетки быстро и очень экономно осуществляют процесс окисления разных субстратов путем отщепления атома водорода, разбивают его на протон и электрон и тем самым обеспечивают трансформацию химической энергии субстратов вначале в электрохимический потенциал градиента концентрации протонов на мембране /4/, затем на процесс окислительного фосфори-лирования, завершающийся синтезом АТФ.
При стрессе имеет место значительное истощение биоэнергетики клетки и, следовательно, возможности коррекции метаболических биоэнергетических процессов и восстановления измененных функций клеток и органов при стрессе, стимуляции адаптационных процессов может быть обеспечена естественными регуляторами энергетического обмена /5/.
Генерализованная реакция воздействия стресса на организм сопровождается усилением окислительных процессов, и как следствие, возникновением окислительного стресса.
Центральная нервная система наиболее подвержена влиянию окислительного стресса. Ткани головного мозга в сравнении с другими тканями организма характеризуются высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот, которые непрерывно подвергаются процессам окисления. Помимо этого, головной мозг имеет диспропорционально высокий уровень насыщения кислородом, что обуславливает скорость окислительного метаболизма /6/. Этому также способствует наличие регионов, характеризующихся повышенным содержанием железа (substantia nigra) /6, 7, 8/. Сетчатка подвержена влиянию интенсивного света, что также имеет протоксиче-ский эффект. Обилие митохондрий в сетчатке также обуславливает постоянную выработку АФК III.
Кроме этого, о наличии окислительного стресса в ЦНС свидетельствуют процессы метаболизма нейромедиаторов /9/. Так, метаболизм допамина сопровождается окислительным стрессом /10/. Допамин в условиях покоя нервной клетки хранится в специальных гранулах в инертном состоянии, но при выходе его в цитозоль, что происходит при возбуждении нейроци-тов, он подвергается расщеплению моноаминоксидазами или же самоокислению. Оба этих процесса в конечном итоге дают начало формированию пероксида водорода /8, 9, 10/. Эндогенный пероксид водорода, образованный в других тканях, кроме нервной, обычно расщепляется при участии каталазы или глютатионяероксидазы, но наличие его избытка в присутствии двухвалентного железа, концентрация которого высока в нервной ткани, и при наличии супероксида ведет к формированию более высокого уровня окислительного стресса и создает в дальнейшем условия для разрушения допаминэргических нейронов /10/. Механизм продукции нейро-меланина, образующегося в результате аутооксидации катехоламинов, также приводит к образованию АФК /11/. Этот согласуется с патогенетическими механизмами болезни Паркинсона, когда увеличение содержания меланина в нервных клетках коррелирует с потерей допаминэргических нейронов /8/. Алюминий также аккумулируется в гранулах нейромеланина /8/. Этот металл известен тем, что значительно усиливает Fe2+-индуцированное ПОЛ /12/.
Снижение поступления в нейроны молекулярного кислорода и повышение уровня восстановленности компонентов дыхательной цепи стимулируют восстановление кислорода по одноэлектронному пути с образованием свободных радикалов (супероксид-аниона, перекисного и гидро-ксильного радикалов), а также оксидантов нерадикальной природы (перок-сида водорода и аниона гипохлорита), поскольку Ог легко реагирует с промежуточными компонентами дыхательной цепи в восстановленном состоянии /13/. Высоко реакционноспособные радикалы кислорода вызывают окисление биомакромолекул, а также инициируют цепные процессы перекисного окисления в мембранных липидах /14/, прямое окислительное повреждение нуклеиновых кислот и белков /15/. Образующиеся в процессе ПОЛ гидроперекиси неустойчивы, их распад приводит к появлению разнообразных вторичных и конечных продуктов перекисного окисления липи-дов, представляющих собой высокотоксичные соединения (диеновые конъюгаты, шиффовы основания и др.), которые оказывают повреждающее действие на мембраны и клеточные структуры. Как следствие образуются сшивки биополимеров, определяются набухание митохондрий и разобщение окислительного фосфолирирования, инактивация тиоловых ферментов, участвующих в дыхании и гликолизе, дальнейшее разрушение липидной основы мембраны /16/.
Изоляция митохондрий головного мозга крыс в модификации Lai, Clark (1979)
Метод изоляции митохондрий головного мозга основан на принципе фракционного центрифугирования (рисунок 7).
В каждом эксперименте использовали по 4 единицы животных. Животных забивали путем одномоментной декалитации.
Приготовление гомогената головного мозга; после декапитации полушария головного мозга крыс помещали в ледяной изоляционный раствор содержащий (0,25 М сахарозы, 0,5 мМ K-EDTA, 10 мМ Tris-НС1, рН 7,4), тщательно измельчали ножницами и промывали несколько раз до очищения от кровяных сгустков, доводили до общего объема 30 мл и гомогенизированы вручную при помощи гомогенизатора до полного измельчения. Гомогенат разделяли на две пробирки и центрифугировали при 2000 g в течение 3 минут. Полученный су-пернатант центрифугировали при 12500 g в течение 8 минут для получения не очищенной митохондриальной фракции. Полученный ми-тохондриальный осадок растворяли в 6 мл 3 % раствора перкола содержащего 0 12 М маннитола, 30 мМ сахарозы, 25 мкМ K-EDTA, 5 mM Tris-HCl, рН 7.4, полученную суспензию наносили поверх 12 мл 6 % перкола (0,24 М маннитола, 60 мМ сахарозы, 50 мкМ K-EDTA, 10 mM Tris-HCl, рН 7,4) и центрифугировали при 11500 g в течение 40 минут.
Полученный осадок коричневого цвета растворяли в 2,5 мл исходного изоляционного раствора (не содержащего EDTA) и центрифугировали при 11500 g в течение 10 минут. Полученный осадок растворяли в малом объеме (1,5 мл) изоляционного раствора. Данный этап повторяли еще два раза. Полученные в результате митохондрии не теряли жизнеспособность в течение 3—5 часов после изоляции при
Устройство для измерения изменений концентраций кислорода в митохондриях состояло из реакционной камеры, магнитной мешалки, кислородного электрода Кларка, покрытого мембраной. Уровень кислорода в среде сводился до минимума до проведения исследования. Реакционная камера была снабжена устройством для поддержания постоянной оптимальной температуры (37С), все реагенты добавляли через герметизирующееся отверстие в плотно прилегающей крышке реакционной камеры. Электрод подвергали калибровке перед каждым измерением.
Митохондриальное дыхание исследовали полярографическим методом с использованием электрода Кларка с записывающим устройством. Реагирующая среда содержала около 0,1 мг митохондриального протеина в объеме 1,5 мл состоящего из 250 мМ сахарозы, 1,5 мМ фосфата калия и 10 мМ Tris, (рН 7,4), 5 мМ глютамата или же сукци-ната как субстратов для дыхания. Давление кислорода записывалось перед добавлением около 0,3 мМ АДФ для инициации митохондриального дыхания в стадии III. Добавление АДФ вело к увеличению скорости поглощения кислорода. Давление кислорода записывалось в течение 3-Ю минут непрерывно до полного поглощения АДФ (рисунок 8).
Коэффициент дыхательного контроля (КДК) по определению Chance (отношение скорости продукции кислорода в присутствии АДФ (В) к скорости продукции кислорода при полном поглощении АДФ (С) был рассчитан по методу Estabrok /223/. КДК мозговых митохондрий был равен 3-4 при добавлении сукцината и 6 - 8 при добавлении глютамата, как субстратов для дыхания (рисунок 8).
Концентрация митохондриального белка была доведена до 1 мг/мл в среде, содержащей 10 мМ Tris-HCl, 5 мМ сукцината, 70 мМ сахарозы и 210 мМ маннитола (рН 7,4). Митохондриальные суспензии (5 мл) инкубировали при 30С в пробирке при атмосферном давлении 02 95% в течение 60 минут. t-BuOOH необходимой концентрации- (50-500 мкМ) готовили заранее и добавляли сразу после нулевой временной точки. В каждой временной точке (10, 30, 45, 60 минут) 0,5 мл митохондриальной суспензии извлекали из инкубационной среды и подвергали центрифугированию в течение 1 минуты при 13000 gc0,lMnl0% раствора ледяной хлорной кислоты (ХК), что вело к выходу митохондриального содержимого в кислую среду. Эта порция, растворенная в кислоте, была исследована на предмет содержания внутримитохондриального глютатиона.
Изменения уровня глютатиона церебральных митохондрий при окислительном стрессе in vitro
Уровень восстановленного глютатиона митохондрий головного мозга крыс линии Fisher 344, составил 4,755±0,08 нМ/мг мито-хондриального белка, ято составляет 15% от уровня ГЗН (1,6 мкМ) присутствующего в тканях головного мозга.
Содержание окисленного глютатона (ГБЭГ) в интактных церебральных митохондриях составило 0,07±0,012 нМ/мг митохон-дриального белка; что составляет 1,1% общего митохондриально-го глютатитона.
Как видно из рисунка 10, при инкубации церебральных митохондрий с t-BuOOH (50-500 мкМ) наблюдается снижение восстановленного глютатиона в зависимости от концентрации t-BuOOH в инкубационной среде начиная с 10 минуты инкубации.
При дозе t-BuOOH 0,5 мМ уровень восстановленного FSH снизился на 65% в сравнении с контролем и продолжал снижаться в течении всего времени инкубации до 80% снижения к 60 минуте инкубации. При этом восполнения исходного уровня TSH не наблюдалось в течение I часа инкубации, что свидетельствует о необратимости потери восстановленного глютатиона (таблица 1),
При дозе t-BuOOH 100 мкМ произошло 65% снижение уровня внутримитохондриального TSH к концу первого часа инкубации (таблица 2).
При дозе t-BuOOH 50 мкМ наблюдалось снижение концентрации восстановленного глютатиона на 15% от интактного контроля начиная с 10 минуты инкубации, которое нарастало до 50%, а к 60 минуте произошло 10% повышение в сравнении наименьшим достигнутым уровнем восстановленного глютатиона (таблица 3).
Таким образом, полного восстановления исходного уровня восстановленного глютатиона не наблюдалось до конца всего периода инкубации.
Хотя наблюдалось более чем 60% снижение TSH в течение 1 часа инкубации, уровень окисленного глютатиона, измеренный в митохондриях после инкубации, не превысил 5% общего TSH, то есть уровень rSSF при инкубации не зависел от дозы t-BuOOH в инкубационной среде (таблица 4).
Полученные данные свидетельствуют о том, что церебральные митохондрии по иному реагируют на окислительный стресс, чем митохондрии печеночной ткани /150/, которые отвечают повышением уровня TSSr на окислительный стресс, вызванный t-BuOOH и дальнейшим снижением соотношения rSH/rSSr. Как отмечает /150/, при низких дозах t-BuOOH (2мМ) FSSF, сформированный в результате окислительного стресса постепенно восстанавливается в TSH, что позволяет обеспечить поддерживание внутримитохондриального тиолового гомеостаза.
Церебральные митохондрии показали иной способ реагирования на аналогичный вид окислительного стресса. Во-первых, восстановления исходного уровня TSH не наблюдалось даже при самой низкой концентрации t-BuOOH (50 мкМ, что в 40 раз ниже концентрации трет-бутил гидропероксида, использованной в печеночных митохондриях - 2мМ, при которой наблюдалось восстановление исходного уровня TSH /150/). Эти данные коррелируют с данными /229/, отмечающего общий низкий уровень ферментов ГЗН-пероксидазы и rSH-редуктазы в мозговых митохондриях подопытных крыс.
Падение уровня глютатиона в церебральных митохондриях согласуется с нарушением процессов его восстановления вследствие снижения активности глютатионредуктазы, что наблюдается при окислительном стрессе. Так как субстратом этого энзима помимо TSSr является и белковосвязанный глютатион, увеличение его перехода в смешанно-дисульфидную форму с белком наблюдается наряду с нарушением редукции окисленного глютатиона.
Не исключено и параллельное уменьшение биосинтеза глютатиона в связи с дезактивацией ферментов, вызванной действием окислительного стресса, нарушением круговорота TSH вследствие нарушения проницаемости митохондриальной мембраны /79/. Снижению уровня митохондриального глютатиона может также способствовать накопление продуктов перекисного окисления /ПО/.
На долю глютатиона приходится основная часть свободных SH-rpynn /51, 66, 79, 80, 130/. Установлено, что одной из важных его функций является зашита белковых структур клеток от окислительной деструкции /79/. Поэтому можно с читать очевидным, что при действии окислительного стресса происходит снижение содержания всех форм глютатиона. Уменьшение содержания глютатиона и в последующем накопление указанных выше сдвигов лежит в основе нарушения транспорта кислорода в организме в целом и, как следствие, энергетического дефицита.
Таким образом, результаты исследований и их анализ дают основание предположить, что снижение концентрации глютатиона в митохондриях головного мозга является следствием окислительного стресса. Можно утверждать, что аналогичные изменения, носящие адаптационный характер, происходят в митохондриях клеток головного мозга экспериментальных животных при окислительном стрессе in vivo.
Как показано в предыдущей главе, снижение восстановленного TSH при инкубации митохондрий головного мозга крыс с t-BuOOH зависело от концентрации t-BuOOH в инкубационной среде. Однако перехода восстановленного глютатиона в окисленный FSSr, вызванного окислительным стрессом, не наблюдалось. Большая часть потерянного TSH при окислительном стрессе, вызванном инкубацией церебральных митохондрий с t-BuOOH, было обнаружено в кислотном преципитате в виде смешанных глютатион-белковых дисульфидов (BSSr) (рисунок 11). При дозе t-BuOOH 500 мкМ наблюдалось почти 50% восстановление потерянного восстановленного глютатиона в виде BSSr.
При инкубацией церебральных митохондрий с t-BuOOH в дозе 100 мкМ 35% митохондриального глютатиона было восстановлено в виде BSSr.
КГак показывают данные таблицы 5, при инкубации митохондрий головного мозга белых крыс с t-BuOOH в концентрации 50 мкМ, 30% потерянного восстановленного TSH обнаружено в кислотном преципитате в виде белково-связанных дисульфидов.
Полученные данные показывают прямую зависимость уровня белково-связанных дисульфидов в митохондриях головного мозга от дозы t-BuOOH в инкубационной среде, т.е., чем выше была доза t-BuOOH, и чем выше, таким образом, уровень окислительного стресса, действующего на митохондрии, тем большее количество потерянного TSH было получено виде BSSr.
Полученные данные о состоянии тиолового гомеостаза митохондрий головного мозга крыс при окислительном стрессе свидетельствуют о падении уровня восстановленного глютатиона, об увеличении окисленного глютатиона, смешанных глютатион-дисульфидов. Эти результаты согласуются с данными /229/, констатирующего низкую концентрацию глютатион-пероксидазы и глютатион-редуктазы в церебральных митохондриях.
Основная роль митохондриального TSH - это поддержание внутримитохондриального окислительно-восстановительного гомеостаза и стабильности митохондриальной мембраны /76, 97/. Восстановление гидропероксидов TSH с образованием ГЭЗГ и последующим восстановлением Г5БГ обратно в Г8Н при участии глютатион-редуктазы является наиболее эффективным способом предотвращения окислительного разрушения. Однако, одновременная быстрая потеря FSH и свободных сулъфгидрильных групп церебральными митохондриями после инкубации с t-BuOOH говорит о неадекватности данного пути в митохондриях головного мозга.
Изменение концентрации глютатиона, продуктов ПОЛ митохондрий головного мозга крыс при введении BSO
Дефицит восстановленного глютатиона, и как следствие окислительный стресс, был индуцирован у взрослых крыс линии Fisher 344 (12,5 месяца) путем интраперитонеального назначения BSO (3 мМ/кг веса) дважды в сутки в течение 12 дней. Как видно из таблицы 7, назначение BSO сопровождалось значительным, 70 % снижением концентрации внутримитохондриального глютатиона в сравнении с контролем (р 0,05).
В условиях назначения BSO наблюдается значительное снижение концентрации общего, восстановленного глютатиона без значительного изменения уровня окисленного глютатиона (таблица 7) в митохондриях головного мозга экспериментальных животных.
Таким образом, из полученных данных следует, что назначение BSO (3 мМ/кг) дважды в сутки сопровождается явлениями окислительного стресса, индикатором которого является снижение внутримитохондриального глютатиона и повышение ПОЛ.
Наши результаты согласуются с описанными в литературе данными экспериментального окислительного стресса, вызванного введение BSO/231, 232, 233, 234, 235/. В данной модели использовался В SO, инактиватор у-глютамилцистеинсинтетазы, энзима, который катализирует первую реакцию в цепи синтеза глютатиона /231, 232/. Ингибирование данного фермента ведет к значительному снижению тканевой концентрации глютатиона и, как следствие, к окислительному разрушению тканей. Это служит показателем интенсивности нормального физиологического формирования активных форм кислорода, разрушающихся в реакциях с участием глютатиона.
Данная модель окислительного стресса во многом отличается от экзогенной модели, и поэтому может являться аналогом окислительных процессов, происходящих при воздействии на организм различных патогенных факторов и дегенеративных процессах.
Согласно литературным данным /74/, при экспериментальном дефиците глютатиона многие ткани, в частности, головной мозг подвергаются разрушению, связанному прежде всего с усилением дегенерационных процессов в митохондриях /236/. Митохондрии, обычно получающие глютатион путем его транспортировки из цитоплазмы /237/, производят большое количество перок-сида водорода /237/, аккумуляция которого сопровождает дефицит глютатиона и в конечном итоге ведет к повреждению мито-хондриальных и других клеточных функций.
Согласно данным /233/ дефицит глютатиона может быть предотвращен путем введения препаратов-производных глютатиона, но ни в коем случае самого глютатиона. Это связано в первую очередь с тем, что глютатион обычно плохо транспортируется вне клеток, так как подвергается экстрацеллюлярному распаду /238, 239/.
Усиление продукции МДА митохондриями головного мозга, выявленное при назначении В SO экспериментальным животным, также согласуется с данными литературы /79/. Интенсификация продукции МДА митохондриями свидетельствует о разрушении митохондриальных мембран под действием АФК вследствие недостаточного их обезвреживания на фоне дефицита глютатиона.
На основании полученных данных и их интерпретации можно констатировать, что назначение В SO экспериментальным животным ведет к снижению концентрации внутримитохондриального глютатиона, увеличению продукции АФК, ПОЛ, и, как следствие, формирование эндогенного окислительного стресса. Данные исследования подтверждают важность поддержания концентрации внутримитохондриального глютатиона для обеспечения адекватной антиоксидантной защиты в условиях нормы и адаптации.
Выявленный характер влияния BSO-индуцированного окислительного стресса на митохондрии головного мозга экспериментальных животных поставил вопрос о необходимости изучения взаимодействия биологических антиоксидантов в обеспечении защиты клеток и тканей организма от разрушающего действия митохондриальных АФК. В связи с этим мы исследовали влияние различных дозировок аскорбиновой кислоты (2 мМ/кг, 1 мМ/кг, 0,4 мМ/кг) на изменения содержания внутримитохондриального глютатиона и интенсивности ПОЛ на фоне BSO-индуцированного окислительного стресса.
Данные о влиянии различных дозировок аскорбиновой кислоты на уровень внутримитохондриального гліотатиона на фоне BSO-индуцированного окислительного стресса представлены в таблицах 9, 10 и на рисунке 13. Сравнительный анализ изменений концентрации митохондриального глютатиона при BSO-индуцированном окислительном стрессе на фоне назначения аскорбиновой кислоты (I мМ/кг, 2 мМ/кг и 0,4 мМ/кг) показал, что уровень глютатиона снизился на 50% в сравнении с контролем (р 0,05), тогда как при отсутствии аскорбиновой кислоты TSH снизился более значительно (на 70%), разница достоверна (р 0,05). Однако сколь-нибудь существенной разницы между концентрациями глютатиона в зависимости от дозы аскорбиновой кислоты не выявлено (таблица 9).
Как следует из данных, приведенных в предыдущей главе, введение BSO экспериментальным животным приводит к истощению как общеклеточного, так и внутримитохондриального глютатиона, а сочетанное введение аскорбиновой кислоты оказывает положительное воздействие на поддержание его концентрации и, как следствие, снижает степень окислительного стресса.
Параллельно с этим отмечается достоверное снижение интенсивности формирования продуктов ПОЛ в виде МДА митохондриями головного мозга при введении аскорбиновой кислоты на фоне BSO-индуцированного окислительного стресса (таблица 11).
Как видно из таблицы 11 сочетанное введение В SO и аскорбиновой кислоты давало достоверно меньшее повышение уровня малонового диальдегида относительно введения В SO (Р 0,05).
Анализ полученных данных показывает, что назначение аскорбиновой кислоты существенно снижает повреждающее влияние активных форм кислорода при окислительном стрессе. Эти данные согласуются с выводами других исследователей /231, 232, 233/, которые установили, что глютатион является необходимым компонентом функциональной активности аскорбиновой кислоты in vivo.
Глютатион, являясь одним из основных биологических антиоксид антов, впрямую участвует в обезвреживании свободных радикалов и поддержании концентрации редуцированных форм аскорбиновой кислоты, также обладающих антиоксидантнои активностью /235/.
