Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ. 4.
ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. 8.
Активные формы кислорода. 8.
Действие АФК.
Образование и превращения АФК.
Участки образования АФК в митохондриях.
Защита от активных форм кислорода.
Ферменты.
Низкомолекулярные антиоксиданти. Эшелоны защиты от АФК. Краткие выводы по разделу «активные формы кислорода».
Некоторые методы регистрации активных форм кислорода. 20.
Регистрация супероксида.
Регистрация НгОг-
Регистрация ОН" и ]02-
Измерение Н2О2 с помощью скополетина и пероксидазы хрена.
Цитохромс. 27.
Структура цитохрома с.
Электрон-транспортная функция цитохрома с. Участие цитохрома с в апоптозе. Цитохром с и активные формы кислорода.
Пероксидаза хрена. 34.
Общая информация. Механизм катализируемых реакций. Характеристика соединений пероксидазы хрена. Взаимодействие пероксидазы хрена и цитохрома с.
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 39.
Выделение митохондрий из сердца крыс 39.
Выделение субмитохондриальных частиц из митохондрий 40.
сердца быка.
Приготовление липосом. 42.
Приготовление липосом со встроенной цитохромоксидазой. 42.
Измерение скорости восстановления цитохрома с супероксидом. 43.
Наблюдение реакции обратного транспорта электронов. 43.
Измерение скорости образования Н2О2 митохондриями. 44.
Измерение скорости образования О2 * субмитохондриальными 44.
частицами.
Измерение потенциала на мембране липосом. 44.
Обработка результатов эксперимента. 44.
Реактивы. 45.
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ. 46.
Восстановление цитохрома с супероксидом в присутствии 46.
азолектиновых липосом.
Генерация потенциала на мембране протеолипосом с 47.
цитохромоксидазой при окислении цитохрома с, восстанавливаемого супероксидом.
Генерация Н2О2 митохондриями сердца крыс. 52.
Генерация Ог" субмитохондриальными частицами из 53.
митохондрий сердца быка.
Окисление цитохрома с перекисью водорода, катализируемое 57.
пероксидазой хрена.
Влияние цитохромов с на генерацию Н2О2 митохондриями. 60.
ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. 69.
Восстановление цитохрома с супероксидом в присутствии 69.
азолектиновых липосом.
Генерация потенциала на мембране протеолипосом с 69.
цитохромоксидазой при окислении цитохрома с, восстанавливаемого супероксидом.
Генерация Н2О2 митохондриями сердца крыс. 73.
Генерация Ог'* субмитохондриальными частицами из 74.
митохондрий сердца быка.
Влияние цитохромов с на генерацию Н2О2 митохондриями. 76.
Окисление цитохрома с перекисью водорода, катализируемое 79.
пероксидазой хрена.
Влияние мутированных цитохромов с на генерацию Н202 80.
митохондриями.
*
ВЫВОДЫ. 84.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ. 85.
БЛАГОДАРНОСТИ. 88.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 89.
Введение к работе
Одним из наиболее эффективных путей запасания энергии аэробными организмами является путь, где в качестве конечного акцептора электронов служит кислород. Однако, кислород является источником токсичных молекул, называемых активными формами кислорода (АФК). К ним причисляют супероксид, перекись водорода, синглетный кислород и гидроксил-радикал. Основным источником активного кислорода в клетке принято считать клеточные органеллы- митохондрии [6]. АФК вызывают окислительные повреждения биомолекул, в том числе ДНК, что является причиной многих заболеваний [1,2,3]. Повышенное образование АФК в клетке запускает программу клеточной смерти (апоптоз) [4] и наоборот, индукция апоптоза ведёт к повышению образования АФК [5]. Считается, что действие АФК является причиной раковых заболеваний, патологий сердечно-сосудистой системы, старения организма [2,26]. Все эти факты обуславливают актуальность и необходимость изучения механизмов генерации АФК и путей предотвращения и снижения токсичного действия АФК на клетки организма.
Цитохром с (цит с)- белок межмембранного пространства митохондрий, основной функцией которого является перенос электронов от убихинол-цитохром оксидоредуктазы (комплекс Ш) на цитохромоксидазу (комплекс IV). Кроме того, цит с способен окислять супероксид с константой скорости реакции около 2-Ю6 M'V1. Долгое время реакция восстановления цит с супероксидом использовалась в качестве метода определения концентрации О2" [7]. В 1997 году Форман и Ацци предположили, что концентрация цит с в межмембранном пространстве так высока, что весь супероксид, образуемый митохондриальной дыхательной цепью и высвобождаемый в межмембранное пространство, должен быть окислен цитохромом с до Ог [8]. В работе В. Скулачева [17] цит с также рассмотрен в качестве эффективного перехватчика Ог" в межмембранном пространстве митохондрий. Вообще, есть основания полагать, что цит с может является основным перехватчиком Ог" в межмембранном пространстве, если учесть, что супероксид дисмутаза (СОД) обнаруживается в межмембранном пространстве митохондрий лишь некоторых видов тканей и организмов [49,109]. По данным Дж. Формана и А. Ацци концентрация цит с в межмембранном пространстве колеблется в пределах 0.5н-5 мМ. Однако, несмотря на высокие концентрации цит с в межмембранном пространстве, генерируемый дыхательной цепью митохондрий супероксид успевает не только дисмутировать до НгСЬ, но и проникнуть за пределы внешней митохондриальной мембраны, как показано, например, в работе Хана и соавторов [57]. В то же время, Ради и др. [82] было показано наличие прооксидантного действия цит с. Таким образом, в настоящее время нет чёткого понимания, какую именно роль играет цит с межмембранного пространства митохондрий в утилизации АФК, генерируемых митохондриями. Каким образом взаимодействует цит с, расположенный снаружи митохондрий (высвобожденный из межмембранного пространства в результате апоптоза) с АФК, генерируемыми митохондриями, также неизвестно.
Целью настоящей работы было определение роли цит с в системе антиоксидантной защиты митохондрий. Была поставлена задача исследовать характеристики взаимодействия цит с и АФК в межмембранном пространстве и снаружи митохондрий. Также было запланировано провести исследование новых мутированных типов цитохромов с (не вызывающих апоптоз) по способности воздействовать на генерируемые митохондриями АФК с целью установить связь между способностью цит с вызывать апоптоз и характеристиками его действия на АФК. Определение степени вовлечённости цит с в процессы утилизации АФК, генерируемых митохондриями, позволит лучше понять причины проявления токсичного действия АФК и пути предотвращения этого действия.
Для описания характеристик взаимодействия цит с и супероксида в мемжмембранном пространстве митохондрий мы выбрали модель азолектиновых липосом. Была поставлена задача ответить на два вопроса: способен ли цит с, связанный с липидной мембраной, окислять супероксид и происходит ли генерация потенциала на липидной мембране протеолипосом при окислении цитохромоксидазой этих протеолипосом цитохрома с, восстанавливаемого супероксидом.
В межмембранном пространстве митохондрий цит с может находиться в двух состояниях: связанном с внутренней мембраной и растворённом в воде межмембранного пространства. Ог*" является гидрофильным ионом, а гем цит с, сорбированного на мембране, обращен в сторону липидного бислоя [71], поэтому вероятно, что только растворённый в воде, но не связанный на мембране цит с, способен окислять супероксид. Нами было показано, что связанный на мембране цит с, в отличие от растворённого в воде, не способен окислять супероксид. Этот вывод является одним из результатов настоящей работы. Таким образом, становится ясно, что не только общая концентрация цит с в межмембранном пространстве, но и состояние цит с (связан на мембране или растворён в воде), должно определять его способность утилизировать генерируемый митохондриями супероксид.
Образуется ли в результате окисления митохондриальной цитохромоксидазой восстановленного супероксидом цитохрома с достаточный для поддержания синтеза АТФ трансмембранный потенциал или скорость электронного переноса в этом случае слишком мала, чтобы компенсировать утечку ЇҐ через внутреннюю митохондриальную мембрану? Такая утечка может быть вызвана самим Ог"~ за счёт Ог*7 НОг* антипорта [1], активации разобщающих белков [11] или повреждения мембранных липидов и белков [12]. К. Майлер в 1990 году экспериментально продемонстрировала синтез АТФ митохондриями сердца крыс, запускаемый добавкой ксантина и ксантиноксидазы [13]. Однако, некоторые факты из исследования Майлер не позволяли однозначно утверждать, что синтез АТФ осуществляется именно в результате переноса электронов от Ог'" на цит с и последующего окисления цит с цитохромоксидазой с генерацией A|V . Поэтому для ответа на поставленный вопрос требовалось проведение дополнительных экспериментов. Проведённое нами в данной работе исследование с использованием простейшей модельной системы, а именно протеолипосом со встроенной цитохромоксидазой, показало, что система цит с и Ог может служить донором электронов для цитохромоксидазы и поддерживать генерацию Лц.я+ [14].
При исследованиях действия внемитохондриального цит с на генерируемые митохондриями АФК мы показали, что добавляемый к митохондриям цит с в субмикромолярных концентрациях ингибирует генерацию НгОг, связанную реакцией обратного транспорта электронов [15]. Кроме того, нами было проведено изучение механизмов такой ингибирующей активности цит с на генерацию Н2О2 митохондриями сердца крысы.
В нашей работе исследование взаимосвязанности способностей цит с вызывать апоптоз и взаимодействовать с АФК проводилось на мутированных цит с, имеющих замены в аминокислотном составе. В ходе совместных исследований предполагалось определить среди синтезированных в группе Кирпичникова мутантов цит с, не активных при индукции апоптоза, те, которые обладают наиболее близкими к животному цитохрому с характеристиками по активации дыхания митопластов и ингибированию генерации Н2О2. С помощью замены гена цитохрома с на ген, кодирующий цитохром с, лишённый апоптотической активности, но сохранивший другие функции, можно сравнить вклады цит с-зависимых и независимых путей апоптоза.
В институте биоорганической химии им. Шемякина и Овчинникова группой Кирпичникова был синтезирован ряд мутантов цитохромов с из дрожжей и из сердца лошади, причём, мутанты цит с Др были лишены способности вызывать апоптоз. В лаборатории Скулачева были проведены исследования по определению активности этих цитохромов с в дыхательной цепи (на модели митопластов) и по подавлению генерации Н2О2 митохондриями сердца крысы [23]. Было показано, что мутации в аминокислотной последовательности цит с Л приводят к снижению активности этого белка по ингибированию генерации Н2О2 митохондриями, и напротив, мутации в составе цит с Др позволяют повысить его активность по ингибированию этой генерации [23].
