Роль процессов свободного окисления дыхательных субстратов в метаболизации жирных кислот и защите от активных форм кислорода Попов Василий Николаевич

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Активные формы кислорода и биохимическая адаптацияокислительных процессов у растений и животных 17

1.1. Стресс, как совокупность ответных реакций организма на изменения условий окружающей среды 17

1.2. Окислительный стресс, генерация активных форм кислорода и «свободное окисление» как способ защиты от них 19

1.3. Возникновение гипоксических состояний при прорастании семян имеханизмы адаптации к дефициту кислорода 29

1.4. Изменение температуры окружающей среды как фактор, регулирующий окислительные процессы 34

Глава 2. Биохимические механизмы свободного окисления дыхательных субстратов 40

2.1. Пути несопряженного транспорта электронов в митохондриях 40

2.1.1. Общая характеристика сукцинатдегидрогеназной системы 40

2.1.1.1. Регуляция активности СДГ 48

2.1.1.2. Экспрессия и репрессия генов СДГ 52

2.1.2. Несопряженное окисление в ЭТЦ растительных митохондрий при различных физиологических состояниях клетки 54

2.1.2.1. Альтернативная оксидаза 55

2.1.2.2. Ротенон-нечувствительные НАДН и НАДФН дегидрогеназы 59

2.1.2.3. Явление монополизации ЭТЦ 61

2.1.3. Электронный транспорт, несопряженный с запасанием энергии, у бактерий. 62

2.2. Механизмы увеличения протонной проводимости внутренней мембраны митохондрий эндогенными и искусственными разобщителями 67

2.3. Пероксисомы - органоиды, совмещающие несопряженное окисление и детоксикацию активных форм кислорода 73

2.3.1. Микротельца и их метаболическая функция 73

2.3.2. Трансформации жиров в углеводы и ее связь с пероксисомами 78

2.3.3. Глиоксилатный цикл как промежуточный этап глюконеогенеза 82

2.3.3.1. Распространение и локализация глиоксилатного цикла 84

2.3.3.2. Экспрессия и регуляция работы глиоксилатного цикла 86

2.3.3.3. Глиоксилатный цикл в тканях животных 90

Глава 3. Использованные материалы и методы 98

3.1. Объекты исследования 98

3.2. Выделение клеточных органелл 99

3.3. Определение активности ферментов 100

3.4. Выделение и очистка ферментов 103

3.4.1. Экстракция 103

3.4.2. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония 103

3.4.3. Гель-фильтрация 104

3.4.4. Ионообменная хроматография 105

3.5. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов 105

3.6. Радиоизотопные исследования 105

3.7. Аналитический электрофорез 107

3.8. Определение молекулярной массы 109

3.9. Анализ интенсивности дыхания митохондрий, мембранного потенциала, уровня восстановленности хинонов и скорости генерации активных форм кислорода 109

3.10. Блотинг-анализ 112

3.11. Определение количества белка 114

3.12. Определение содержания хлорофилла 114

3.13. Статистическая обработка экспериментальных данных 115

Глава 4. Индукция ферментов глиоксилатного цикла в животных тканях при голодании и индуцированном диабете как биохимический механизм ускоренной мобилизации запасных липидов 116

4.1. Обнаружение индукции глиоксилатного цикла в печени крыс при голодании 116

4.2. Обнаружение индукции глиоксилатного цикла в печени крыс при экспериментальном диабете 120

4.2.1. Разработка модели экспериментального диабета 120

4.2.2. Индукция ферментов глиоксилатного цикла при экспериментальном диабете 122

4.3. Изучение субклеточной локализации глиоксилатного цикла в животных тканях 123

4.4. Очистка изоцитратлиазы из печени крыс и изучение ее свойств 129

4.5. Изучение малатсинтазы из печени голодающих крыс 139

4.6. Индукция изоформ малатдегидрогеназы в печени крыс при пищевой депривации 140

4.7. Индукция аконитатгидратазы в гепатоцитах голодающих крыс 152

Глава 5. Альтернативный путь окисления сукцината в глиоксисомах жирозапасающих растений индуцируется при прорастании 166

5.1. Влияние ингибиторов метаболизма на декарбоксилирование меченого сукцината 166

5.2. Метаболизм 2,3-14С-сукцината щитками кукурузы 167

5.3. Окисление сукцината изолироваными глиоксисомами 170

5.4. Влияние сукцината на интенсивность гашения супероксидных радикалов 175

5.5. Характеристика глиоксисомальной сукцинатоксидазы из щитка злаковых 177

Глава 6. Влияние индукции несопряженного и разобщенного окисления в митохондриях на образование активных форм кислорода 183

6.1.Холод как фактор, регулирующий несопряженное и разобщенное окисление в растительных митохондриях 183

6.1.1 Инкубация растений при пониженных температурах приводит к ускорению дыхания митохондрий и индукции альтернативной оксидазы 183

6.1.2. Разобщенное дыхание митохондрий как механизм адаптации к холоду в митохондриях из клубней картофеля 194

6.2. Роль процессов "свободного окисления" в адаптации растений к атмосфере с повышенным содержанием кислорода и регуляции образования активных форм кислорода 209

6.2.1. Гипероксидная атмосфера индуцирует несопряженное окисление сукцината с помощью альтернативной оксидазы 209

6.2.2. Ингибирование альтернативной оксидазы приводит к ускорению генерации активных форм кислорода в растительных митохондриях 211

6.3. Влияние светового режима на окислительные процессы в растительных

митохондриях. 235

6.3.1. Влияние света на активность ферментов цикла Кребса, фото дыхания и функционирование ЭТЦ митохондрий в высших растениях 235

6.3.2. Красный свет как регулятор активности сукцинатдегидрогеназы 245

6.4 Роль реакции переаминирования в превращении сукцината в эндосперме клещевины при прорастании 256

IV. Заключение 272

Выводы 277

Список использованной литературы 280

• Окислительный стресс, генерация активных форм кислорода и «свободное окисление» как способ защиты от них
• Ротенон-нечувствительные НАДН и НАДФН дегидрогеназы
• Анализ интенсивности дыхания митохондрий, мембранного потенциала, уровня восстановленности хинонов и скорости генерации активных форм кислорода
• Обнаружение индукции глиоксилатного цикла в печени крыс при голодании

Введение к работе

Актуальность проблемы. Существование множественных метаболических путей, обеспечивающих сходные процессы, имеет теоретическое и практическое значение, так как позволяет приблизиться к пониманию механизмов функционирования организма, как целостной системы и, благодаря этому, создает условия для решения проблем, связанных с повышением устойчивости живых организмов к неблагоприятным факторам. И в этой связи одним из важнейших направлении является изучение клеточного дыхания, которое может обеспечивать клетку энергией, а может быть не сопряженно с запасанием энергии, и его координация с метаболизмом различных классов органических соединений. Это относится и к окислительному метаболизму митохондрий и пероксисом в период интенсивного функционирования глиоксилатного цикла, так как организация метаболизма жирных кислот представляет особый интерес. Нейтральные липиды являются основной запасной формой органического вещества и от возможности их у быстрой утилизации зависит скорость адаптации организма. Р-окисление жирных кислот может протекать как в митохондриях, обеспечивая энергетические потребности клетки, так и в пероксисомах (Lazarow, 1978). Органеллы эти интересны тем, что протекающие здесь окислительные процессы не связаны с запасанием АТР. Образующиеся в пероксисомах NADH и FADH₂ окисляются там же кислородом с образованием супероксидрадикала и перекиси водорода (Luster, Donaldson, 1987; Lopez-Huertas et al., 1999). Пероксисомы изолированы мембраной от цитоплазмы и образующиеся там активные формы кислорода немедленно детоксицируются присутствующими в избытке супероксиддисмутазой, каталазой, пероксидазой. Основными субстратами, окисляемыми в пероксисомах, являются жирные кислоты, особенно в период интенсивного использования запасных липидов для глюконеогенеза. Процесс мобилизации запасных жиров для синтеза углеводов, по-видимому, протекает во всех живых организмах. Однако, для тканей высших животных биохимический механизм данного процесса остается невыясненным (Лебкова, 2000). Считается, что окисление липидов может приводить к образованию кетоновых тел и их последующему вовлечению в энергетический обмен. Наличие ферментов Р-окисления жирных кислот в животных пероксисомах (Lazarow, 1978) и феномена ресинтеза гликогена в печени крыс при глубоком голодании (Лебкова, 1984) позволяет предположить возможность индукции ферментов глиоксилатного цикла, позволяющих конденсировать две молекулы ацетил-КоА, образующегося при р -окислении, в сукцинат как это происходит в растительной и бактериальной клетках.

Принято считать, что сукцинат, интенсивно образующийся в глиоксилатном цикле, при прорастании жирозапасающих семян далее окисляется в отрезке цикла Кребса до оксалоацетата и последний вступает в глюконеогенез. Однако нет данных о том, сбалансирована ли скорость глиоксисомальных и митохондриальных процессов, особенно в период максимальной активности глиоксилатного цикла. Кроме того, известно, что для функционирования глюконеогенетического пути необходимо высокое содержание в клетке восстановленных пиридиннуклеотидов и АТФ, тормозящее работу электронтранспортной цепи митохондрий, в частности, сукцинатдегид-рогеназного комплекса (Affourtit et al., 2001). Таким образом, есть основание предполагать наличие альтернативных путей окисления сукцината в период прорастания масличных семян.

Кроме того, функционирование митохондрий в условиях высокого соотношения НАДН/НАД* и АТФ/АДФ и высокого мембранного потенциала, а так же при повышенных концентрациях кислорода, при пониженных температурах, засухе, поранениях может приводить к генерации активных форм кислорода (супероксид-радикала, перекиси водорода, гидроксил-радикала), способных повреждать митохондриальную ДНК (Skulachev, 1996). Ранее было показано, что клеточное дыхание in vivo в норме происходит не только сопряженно с запасанием энергии, но и без такого сопряжения. Второй тип дыхания был назван свободным. Было высказано предположение, что свободное окисление участвует в терморегуляторном термогенезе, в образовании или разрушении метаболитов, детоксикации ксенобиотиков и даже (косвенно) в запасании энергии (Скулачев, 1989), и было предположено, что понижение внутриклеточной концентрации 0₂, приводящее к ограничению образования АФК, также является специфичной функцией дыхательной системы клетки (Скулачев, 1994). Этот процесс и наличие защитных механизмов активно изучались для животных тканей и микроорганизмов, но остаются относительно малоисследованными для растительных митохондрий. Так, в частности, было показано участие так называемого «мягкого» разобщения у животных и дыхательной защиты у Azotobacter vinelandi в регуляции скорости образования активных форм кислорода. Растительные митохондрии обладают широким спектром путей свободного окисления, роль которых возрастает при адаптации к повышенным или пониженным температурам, изменению состава атмосферы и светового режима. Наличие в растительных митохондриях альтернативной оксидазы, работа которой не связана с образованием АТФ и генерацией протонного потенциала, определяет возможность либо сопряженного окисления убихинола через цитохромный путь, либо быстрое несопряженное окисление через альтернативную оксидазу, вызывающее термогенез (Wagner, Moore, 1997).

В этой связи ключевым является вопрос об участии путей несопряженного и разобщенного окисления в регуляции образования активных форм кислорода.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось изучение роли процессов свободного окисления в мобилизации запасных липидов и защите организма от избыточной генерации активных форм кислорода.

Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:

Исследовать влияние факторов, индуцирующих липолиз и р-окисление жирных кислот (голодание, экспериментальный диабет, пониженные температуры, прорастание жирозапасающих семян), на функционирование глиоксилатного цикла и окислительных процессов в пероксисомах.

Определить возможность функционирования глиоксилатного цикла в тканях млекопитающих в условиях, вызывающих мобилизацию запасных жиров, выявить субклеточную локализацию данного процесса.

Выделить отдельные ферменты, обеспечивающие функционирование глиоксилатного цикла, изучить их физико-химические, каталитические характеристики и регуляцию.

4. Исследовать возможность функционирования альтернативных путей окисления сукцината в условиях его интенсивного образования из запасных липидов в глиоксилатном цикле.

5. Выявить механизмы генерации активных форм кислорода в растительных митохондриях и роль процессов свободного окисления в регуляции этого процесса.

6. Изучить возможность индукции путей несопряженного транспорта электронов (на примере альтернативной оксидазы) факторами, вызывающими интенсивное образование активных форм кислорода.

7. Исследовать возможные механизмы разобщения дыхания и окислительного фосфорилирования при накоплении свободных жирных кислот и влияние этого процесса на генерацию активных форм кислорода.

Научная новизна работы. Исследование влияния факторов, индуцирующих липолиз и р-окисление жирных кислот (голодание, экспериментальный диабет, пониженные температуры, прорастание жирозапасающих семян), на пероксисомальный метаболизм показало, что мобилизация запасных липидов связана с несопряженным окислением в пероксисомах и работой глиоксилатного цикла как в растительных, так и в животных тканях. Впервые для тканей млекопитающих (для печени и почек крыс) показана индукция ферментов глиоксилатного цикла, позволяющая мобилизовывать жиры и через сукцинат направлять их на глюконеогенез или поддержание энергетического баланса клетки. Установлено, что ключевые ферменты глиоксилатного цикла - изоцитратлиаза и малатсинтаза локализованы в микротельцах животных тканей. Наличие в этих органоидах ферментов р -окисления жирных кислот позволяет считать их полноценными глиоксисомами. Впервые получен гомогенный препарат изоцитратлиазы из животной ткани, изучены его физико-химические свойства и показана регуляция активности данного фермента сахарофосфатами.

Установлено, что интенсивное образование янтарной кислоты в глиоксилатном цикле приводит к значительным изменениям метаболических путей, связанных с ее утилизацией. Так, при прорастании семян злаковых обнаруживается глиоксисомальная сукцинатоксидаза, основной функцией которой является быстрое, не связанное с запасанием энергии окисление сук-цината непосредственно в глиоксисомах, позволяющее снять аденилатный контроль электронтранспортной цепи митохондрий. В эндосперме клещевины в период интенсивной работы глиоксилатного цикла при прорастании происходит шунтирование цикла Кребса через аминотрансферазные реакции, что позволяет обойти лимитирующие этапы и также способствует интенсивной метаболизации сукцината.

Показано, что пониженная температура, атмосфера с повышенным содержанием кислорода и увеличение интенсивности света - факторы, активирующие образование активных форм кислорода (Mcintosh, 1999), интенсифицируют процессы свободного окисления. В частности, показана активация цианидрезистентной альтернативной оксидазы и разобщения дыхания и окислительного фосфорилирования свободными жирными кислотами посредством ATP/ADP антипортера. Обнаружено, что ингибирование альтернативной оксидазы приводит к значительному увеличению интенсивности генерации перекиси водорода митохондриальной электронтранспортной цепью, и что скорость продукции АФК коррелирует с активностью альтернативной оксидазы. То есть альтернативная оксидаза может выступать защитным механизмом, снижающим образование активных форм кислорода, а индукция "свободного окисления", по-видимому, представляет собой универсальную стратегию защиты от стрессоров различной природы, вызывающих генерацию активных форм кислорода.

Практическая значимость исследования. Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о биохимических механизмах участия митохондриальных и пероксисомальных процессов в адаптации растительной и животной клеток. Показанное разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях растений, подвергшихся воздействию пониженных температур, является объяснением снижения продуктивности сельскохозяйственных растений.

Представленные данные важны для получения новых сортов растений, обладающих повышенной экспрессией механизмов устойчивости к холоду.

Изучение механизмов продукции активных форм кислорода в растительных митохондриях также важно для понимания механизмов адаптации растений к стрессорам различной природы, так как ранее было показано, что в этих условиях наблюдается окислительный взрыв, когда происходит резкое увеличение продукции супероксидрадикала и перекиси водорода

Разработанная схема выделения электрофоретически гомогенных препаратов изоцитратлиазы, аконитазы и малатдегидрогеназы может быть использована для получения коммерческих препаратов ферментов. Найденный метод стабилизации ферментов позволяет сохранять их активность в течение длительного времени, что обеспечивает возможность использования препарата для медицинской диагностики и в биохимических исследованиях для количественного определения малата, цитрата, изоцитрата.

Обнаружение феномена индукции глиоксилатного цикла при голодании в печени высших животных может служить основой для разработки тест-систем обнаружения нарушений обмена веществ, связанных с мобилизацией запасных жиров. На основе полученных данных о существовании альтернативной глиоксисомальной сукцинатоксидазы, специфичной для растений семейства злаковых, возможна разработка гербицидов, частично ингибирующих основной путь окисления сукцината - сукцинатдегидрогеназу и подавляющих развитие растений, не обладающих альтернативной системой окисления янтарной кислоты.

Материалы работы используются в учебном процессе на биолого- почвенном факультете Воронежского госуниверситета. Результаты исследований вошли в курсы лекций по «Биохимии и молекулярной биологии», «Биоэнергетике», «Физиологии растений» и «Дыханию растений».

Апробация работы. Материалы работы были представлены и обсуждались на IX (Брно, Чехия, 1994 г.), X (Флоренция, Италия, 1996) и XI (Варна, Болгария, 1998) Конгрессах Федерации европейских обществ физиологов растений; 12-ой Европейской биоэнергетической конференции (Аркашон, Франция, 2002); 2-ой (Вена, Австрия, 1996) и 5-ой (Ницца, Франция, 2001) конференции «Кислород, свободные радикалы и окислительный стресс»; школе ФЕБО «Митохондрии в жизни и смерти клетки» (Москва, 2001); Всероссийском совещании «Митохондрии в патологии» (Пущино, 2001); 4 съезде Общества физиологов растений (Москва, 1999); Съезде Русского ботанического общества (Санкт Петербург, 1998); Международном совещании "Дыхание растений: физиологические и экологические аспекты" (Сыктывкар, 1995); ежегодных научных сессиях Воронежского государственного университета (1996-2002) и биоэнергетическом семинире НИИФХБ им. А.Н.Белозерского МГУ (2002-2003). Результаты, представленные в работе удостоены Премии Европейской академии для молодых ученых СНГ за 1997 и Государственной Премии Российской Федерации за выдающиеся достижения в области науки и техники для молодых ученых за 1998 год.

Структура диссертации. Диссертационная работа включает 6 глав, 312 страниц, 64 рисунка, 35 таблиц. В работе использовано 465 литературных источников.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Глава 1. АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА И БИОХИМИЧЕСКАЯ АДАПТАЦИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ У РАСТЕНИЙ И

ЖИВОТНЫХ /./. Стресс, как совокупность ответных реакций организма на изменения условий окружающей среды

Устойчивость живых организмов - это их способность сохранять относительное постоянство внутренней среды, то есть гомеостаз в определенном диапазоне внешних воздействий. Она определяется степенью выживаемости организмов в неблагоприятных условиях обитания.

Устойчивость организма обеспечивается совокупностью механизмов: специфических, зависящих от особенностей фактора среды, и общих, неспецифических, характерных для отдельных воздействий и отражающих свойства самой реагирующей системы. Комплекс неспецифических изменений, возникающих при действии любых неблагоприятных факторов среды, называется стрессом, а сами факторы именуются стрессорами (Чиркова, 2002).

Термин «стресс» был введен в 1936 г. канадским физиологом Гансом Селье для обозначения совокупности первичных неспецифических изменений животного организма под влиянием любых внешних воздействий. Исследуя гипофизарно-адренокортикотропную систему у животных, он открыл «синдром болезни» как таковой, то есть неспецифический ответ организма на любое повреждение, вызванное бактериальной инфекцией, интоксикацией в связи с действием фармакологических и химических веществ, травмами, переохлаждением или ожогами, нервными потрясениями и т. д.

Селье обратил внимание на то, что изменения защитных сил животного (и человека) при различных заболеваниях обычно сопровождаются увеличением содержания в крови кортикостероидных гормонов, мобилизующих обмен веществ. При этом организм, несмотря на изменение своего состояния, приобретает способность сохранять относительную стабильность внутренней среды. Эта реакция была оценена им как адаптивная, то есть приспособительная реакция целостного организма, и названа генерализованным адаптационным синдромом. Согласно Селье, способность к адаптации является наиболее характерной чертой жизни, и приспособление всегда возникает в результате концентрации усилий (или напряжения). Отсюда и название «стресс» (англ. stress — напряжение). Подчеркнем, что Г. Селье увидел между неспецифическими признаками определенную связь, отражающую характер защитных реакций организма на воздействие, и понял, что это важнейший биологический феномен, присущий всем живым существам. По Селье, кривая ответных реакций на воздействие включает три фазы («триада Селье»): тревоги, адаптации и истощения. На протяжении триады формируется неспецифическая резистентность, но при увеличении силы эффекта и исчерпании защитных возможностей организма наступает его гибель (Селье, 1972).

Биохимическая адаптация у растений изучена также значительно хуже по сравнению с молекулярными механизмами приспособления животных к разнообразным условиям среды, тем не менее, имеющиеся данные свидетельствуют о глубоких и значительных изменениях в растительном организме, затрагивающих клеточный уровень. Под действием стрессоров у живых организмов имеет место ускоренный расход макроэргических соединений: происходит активация и синтез стрессовых белков, изменения затрагивают также гормональный баланс, проницаемость мембран, кислотность и вязкость цитоплазмы и т.д., что, в конечном итоге, приводит к торможению роста и угнетению физиологических процессов (Хочачка, Сомеро, 1977). В настоящее время для полной расшифровки механизмов стресса на молекулярном и клеточном уровнях необходимо изучение роли ферментных систем в ходе физиолого-биохимической адаптации к стрессовым факторам. Очевидно, что, в первую очередь, внимание должно быть обращено на особенности функционирования ферментов центральных метаболических путей, определяющих продуктивность растений. Однако многие аспекты данной проблемы остаются до настоящего времени мало изученными и не вполне ясными. Так, практически отсутствуют данные об особенностях каталитического действия и регуляции активности ферментов ЦТК в ходе развития метаболической реакции растения на стресс. Хотя имеющиеся данные позволяют заключить, что ЦТК в стрессовых условиях (в частности, при дефиците 0₂) подвергается существенной реорганизации (Чиркова, 2002). Возможно, происходит обращение дикарбоновой части цикла; шунтирование его дополнительными ферментативными реакциями, приводящими к накоплению, так называемых "стрессовых" аминокислот и органических кислот (гамма-аминомасляной кислоты, сукцината) (Bown, Shelp, 1989). Однако физиологическое значение данных процессов, регуляция их на ферментативном уровне остаются неясными.

1.2. Окислительный стресс, генерация активных форм кислорода и «свободное окисление» как способ защиты от них

Обогащение атмосферы Земли кислородом произошло на заре эволюции. Это событие положило начало развитию нового, бесконечно разнообразного мира аэробных организмов, в метаболизме которых кислород занимает главное место, обеспечивая их энергией за счет окисления питательных веществ в процессе дыхания.

Ансамбли дыхательных ферментов, расположенные во внутренней мембране митохондрий растительных и животных клеток (а у бактерий - в плазматической мембране) обеспечивают перенос электронов на кислород, служащий конечным акцептором. Транспорт электронов осуществляется по градиенту окислительно-восстановительного потенциала этих ферментов, а выделяющаяся энергия конвертируется в электрохимический трансмембранный потенциал, который далее может быть использован для совершения работы, например, синтеза АТР или транспорта ионов (подробнее смотри Скулачев, 1989).

Терминальные оксидазы дыхательных цепей восстанавливают молекулярный кислород четырьмя электронами, при этом образуется молекула воды. Окислительно-восстановительный потенциал пары кислород/вода (+0.815 В) намного более положителен, чем потенциалы большинства других веществ биологического происхождения, поэтому перенос электронов с этих молекул на кислород сопровождается выделением значительных количеств свободной энергии. Именно поэтому аэробная энергетика гораздо более эффективна, чем анаэробное брожение. Парадоксально, но та же самая великолепная окислительная способность кислорода создает и постоянную опасность для дышащих организмов. Спонтанное окисление практически любого компонента клетки кислородом термодинамически выгодно, и если бы не высокие активационные барьеры для большинства реакций такого типа, то существование жизни было бы невозможно.

Однако в любых клетках есть молекулы, для которых эти барьеры относительно невысоки. Это, прежде всего, переносчики электронов дыхательной цепи митохондрий, такие как восстановленные флавиновые коферменты и негемовые железосодержащие белки, а также некоторые другие компоненты клеток. Такие молекулы могут восстанавливать кислород, передавая ему только один электрон, а не четыре, при этом образуется анион-радикал _ш кислорода 0₂"', или супероксидрадикал. В такой «активированной» форме кислород более реакционноспособен и может представлять опасность для клетки, вступая в реакции неспецифического окисления. Но более серьезную опасность представляют другие формы активного кислорода, например, гидроксил-радикал ОН. Реакционная способность ОН чрезвычайно высока, он способен окислить почти любые компоненты клетки. Супероксид и различные * его производные, такие как перекись водорода, гидроксил радикал и т.п., | получили общее название активные формы кислорода, АФК. Их свойства, функции и пути возникновения в биологических системах хорошо описаны в литературе (Halliwell, Gutteridge, 1989; Liochev, Fridovich, 1984; Skulachev, 1996). Важно отметить, что генерация АФК является «врожденным» свойством аэробного метаболизма. Супероксид как побочный продукт постоянно продуцируется митохондриями при окислении субстратов дыхания (Chance et щ al., 1979). Только за счет этого, неразрывно связанного с жизнью процесса, в теле человека ежедневно генерируется около 10 грамм супероксида (Halliwell, 1994). Ежедневно и ежечасно пероксисомы, имеющиеся почти во всех эукариотических клетках, производят перекись водорода как побочный продукт окисления жирных кислот и других органических соединений. При инактивации различных токсических веществ цитохромом Р450 также генерируются АФК. j Фагоциты выделяют во внеклеточную среду смесь различных АФК как «химическое оружие» против микроорганизмов (Babior, Woodman, 1990). Кроме того свой вклад в образование АФК вносят неферментативные процессы. Например, ионы железа и меди катализируют спонтанное формирование АФК под действием даже слабой радиации.

Возникновение АФК есть прямое следствие наличия довольно высоких концентраций молекулярного кислорода в окружающей среде. В то же время, они представляют постоянную угрозу для живого организма в силу своей способности неспецифически реагировать с компонентами клеток, внося хаос в упорядоченную систему метаболизма. Очевидно, что любые живые организмы, существующие в кислород-содержащей среде, должны были в ходе эволюции выработать в себе специализированные системы защиты от АФК и последствий их реакций с молекулами клеток. Действительно, такие системы имеются у представителей практически всех таксономических групп живых организмов. Специальные молекулы-антиоксиданты, такие как а-токоферол, витамин С, каротиноиды, карнозин, ансерин, глутатион, защищают клетки путем неферментативных реакций с АФК. Ферменты, обнаруженные во всех аэробных клетках, такие как супероксиддисмутаза, глутатион-пероксидаза, каталаза, призваны снижать общую концентрацию АФК за счет избирательных реакций с отдельными их видами. Во многих клетках также существуют специальные белки, особым образом связывающие ионы меди и железа, делая их недоступными для реакций с кислородом и генерации АФК. Помимо этого, практически любые клетки имеют разнообразные ферменты, репарирующие повреждения, вызванные АФК (Halliwell, 1994; Skulachev, 1996).

Однако эффективность действия всех этих защитных систем не стопроцентна. Довольно часто возникают ситуации, когда в клетках по различным причинам возникают слишком высокие концентрации АФК, такие, что антиоксидантные и репарационные системы клеток не в состоянии справиться с вызываемыми АФК повреждениями. Такие ситуации получили обобщенное название окислительного стресса.

Обычно, понятие окислительного стресса рассматривается в связи с различными патологиями, особенно в медицинской литературе. С окислительным стрессом связывают возникновение и развитие многих заболеваний, таких как рак, сердечные заболевания, различные нарушения работы иммунной системы. Аккумуляция повреждений, вызванных АФК, рассматривается как одна из причин старения организма. Причины возникновения окислительных стрессов так же весьма разнообразны, от генетически детерминированных или инициированных чем-либо нарушений окислительного метаболизма до дефицита витаминов и микроэлементов в повседневном рационе. Однако, в более общем плане, причиной окислительного стресса является ни что иное, как возникновение дисбаланса между уровнем кислорода в клетке и потребностью в нем для нормального протекания реакций аэробного метаболизма. Превышение внутриклеточной концентрации кислорода сверх уровня, необходимого для нормальной работы терминальных оксидаз дыхательных цепей, приводит к накоплению АФК и росту вызванных ими повреждений. Эти соотношения подробно рассмотрены в работе В.П.Скулачева (Skulachev, 1996). В частности, автор пишет, что фермент цитохромоксидаза и другие конечные оксидазы запасающих энергию дыхательных цепей имеют чрезвычайно высокое сродство к кислороду (полумаксимальная скорость наблюдается при концентрации 0₂ менее 1x10"⁶ М). В то же время, "паразитные" процессы образования 0{ представляют собой по существу неферментативные химические реакции, протекающие без специфического связывания 0₂. Вот почему скорость "паразитных" реакций линейно снижается с уменьшением концентрации кислорода в широком ее диапазоне." Эти соотношения удачно иллюстрирует Рис.1 из той же работы (видоизменен, с разрешения автора). Как показано на рисунке, существует диапазон концентраций кислорода (область Б,

Рис.), оптимальный для аэробной жизни. Возрастание концентрации кислорода выше этого уровня способствует возникновению условий окислительного стресса, а снижение внутриклеточной концентрации 0₂ должно защищать клетку от окислительных повреждений. Это положение более подробно рассматривается в последующих разделах нашей работы. to^b[oJ,M

Рис.1. Выделены три области концентраций кислорода. Область А, кислорода недостаточно для насыщения оксидазы. Область Б, оксидаза уже насыщена кислородом, но образование АФК идет с небольшой скоростью. Область В, концентрация 0₂ достаточно высока, и АФК накапливаются.

Очевидно, что наиболее кардинальным решением проблемы защиты клеток от АФК был бы механизм, предотвращающий увеличение внутриклеточной концентрации кислорода сверх уровня оптимальной работы терминальных оксидаз дыхательных цепей.

У животных снижение вентиляции легких и сужение кровеносных сосудов при переходе от состояния активности к покою можно рассматривать как физиологический ответ, предотвращающий нежелательное повышение уровня 0₂ В состоянии покоя концентрации АДФ и фосфата падают и, как следствие, тормозится потребление 0₂. Чтобы предотвратить повышение уровня 0₂ в клетках, сужаются капилляры и замедляется доставка 0₂. Однако такого рода макроскопические механизмы имеют весьма существенное ограничение. Так, сужение капилляра должно привести к появлению в ткани кислородного градиента: концентрация 0₂ будет понижаться по мере удаления от капилляра. В результате клетки, расположенные вблизи капилляра, будут по-прежнему насыщены кислородом, а удаленные от него попадут в анаэробные условия, чтобы избежать такой неблагоприятной ситуации, было бы желательно дополнить упомянутые выше надклеточные физиологические механизмы какими-то внутриклеточными, биохимическими. Одним из них может быть ослабление сопряженности между дыханием и синтезом АТФ в условиях покоя.

Окисление дыхательных субстратов через цитохромный путь требует присутствия ADP, необходимого для протекания процесса окислительного фосфорилирования. В состоянии, когда энергетические потребности клетки низки, происходит уменьшение концентрации ADP, и цитохромный путь ингибируется. Вследствие этого процесса может происходить увеличение концентрации убисемихинона, способного к паразитическому одноэлектронному процессу образования анион-радикала кислорода (0₂") (Ksenzenko et al., 1983; Ksenzenko et al., 1984). Под действием супероксиддисмутазы 0₂' быстро превращается в перекись водорода. Механизмом защиты от данного процесса может быть снижение внутримитохондриальной концентрации кислорода или уменьшение срока жизни убисемихинона (Скулачев 1995; Skulachev 1996). Ранее было показано, что образование супероксидрадикалов незначительно при низком трансмембранном потенциале и экспоненциально возрастает с увеличением Дц/ (дельта пси). Также было обнаружено, что скорость 0₂"'-генерации коррелирует со степенью восстановленности цитохрома Ъ₅₆в (bj) (Liu, Huang 1996; Lui, 1999).

Образование H₂0₂ животными митохондриями in vitro становится практически неизмеримым при добавлении АДФ. Поскольку сравнительно небольшое снижение Ад Н+ при добавлении АДФ оказывается достаточным, чтобы прекратилось накопление Н202 , можно принять, что такой эффект будет достигаться уже при небольшом увеличении утечки ионов Н+ , не сопряженной с синтезом АТФ. В.П.Скулачев предположил (Skulachev, 1996), что митохондрии располагают специальным механизмом увеличения утечки в состоянии покоя. Этот механизм мог бы предотвратить полное торможение дыхания и сильное восстановление дыхательных ферментов и коферментов. Он должен включаться, когда АДФ исчерпывается, и выключаться, когда АДФ появляется вновь. В Ш отличие от сужения капилляров, механизм утечки должен действовать на внутриклеточном, а не надклеточном уровне. Существование такого механизма, обеспечивающего не сопряженное с запасанием энергии, свободное окисление субстратов, позволило бы митохондриям эффективно регулировать внутриклеточный уровень кислорода. Кроме того, такой механизм защищал бы и сами митохондрии, снижая уровень кислорода (и вероятность появления АФК) в непосредственной близости от митохондриальной ДНК, находящейся в митохондриальном матриксе. Такой способ регулирования степени сопряжения получил название "мягкое разобщение" (Skulachev, 1996). При этом предполагается, что "мягкое разобщение" обеспечивается некими митохондриальными мембранными белками (Starkov et al, 1997).

Мысль о том, что дыхательная система может быть специализирована на снижении внутриклеточной [0₂], первоначально обсуждалась применительно к двум проблемам, а именно биологической эволюции и фиксации азота. В первом случае предполагалось, что первичные дыхательные ферменты, возникшие в ответ на повышение количества 0₂ в атмосфере, имели своей функцией уборку 0₂, продуцируемого фотосинтезом. В современных клетках функция снижения уровня 0₂ несомненно присуща одной из дыхательных систем N₂ -восстанавливающих бактерий. Этот феномен был назван "дыхательным предохранением". Показано, что у таких бактерий поглощение 0₂ в процессе дыхания поддерживает концентрацию 0₂ на достаточно низком уровне, безопасном для нитрогеназы - фермента, восстанавливающего N₂ и чувствительного к кислороду. Интересны результаты опытов на бактерии Azotobacter vinelandii. Эта бактерия характеризуется необычно высокой скоростью потребления кислорода. Дыхание сопровождается рассеянием столь больших порций энергии, что происходит быстрый разогрев ростовой среды. A.vinelandii обладает двумя конечными оксидазами типов о и d. Делеция в гене оксидазы о не влияет на аэробную фиксацию N₂ , в то время как делеция в гене оксидазы d делает фиксацию N₂ невозможной, если не понизить количество 0₂ до 1,5 объемных процентов. На основе этих фактов было сделано заключение, что оксидаза типа d специфически ответственна за дыхательное предохранение у A.vinelandii при нормальном парциальном давлении кислорода.

Механизм участия дыхания в снижении внутриклеточной концентрации кислорода наиболее ярко выражен у азотредуцирующих бактерий, в частности, у Azotobacter vinelandi. Эта бактерия характеризуется необычно высокой скоростью потребления кислорода. Дыхание сопровождается рассеиванием столь больших порций энергии, что происходит быстрый разогрев ростовой среды. Azotobacter vinelandi обладает двумя терминальными оксидазами о и d типа и двумя NADH дегидрогеназами, причем при увеличении в среде концентрации кислорода происходит переключение на несопряженное дыхание (Bertcova et al., 1997).

Проблема кислородной опасности стоит еще более остро у зеленых растений, клетки которых не только поглощают, но и образуют 0₂. Согласно предположению В.П.Скулачева, именно защитой от кислорода объясняются многочисленные случаи так называемого несопряженного дыхания в растительных клетках (Skulachev, 1996).

В этой связи интересно отметить, что растения обладают сложной системой путей несопряженного транспорта электронов, обходящих генераторы АцН⁺ электронтранспортной цепи. Так для митохондрий высших растений было показано, что окисление NADH осуществляется помимо комплекса I ЭТЦ системой несопряженных NADH-дегидрогеназ, локализованных во внутренней и внешней мембране митохондрий (Moller, 2002), а цианид-устойчивая оксидаза (альтернативная оксидаза) - одна из наиболее хорошо изученных систем несопряженного дыхания в растениях (Skulachev, 1996; Wagner, Moore, 1997). Этот фермент локализован во внутренней мембране митохондрий и катализирует четырехэлектронное восстановление кислорода за счет окисления убихинола. В данном процессе не происходит запасания энергии в виде ДиН*. Интересно, что несопряженная альтернативная оксидаза функционирует при более высоких соотношениях CoQH₂/CoQ, чем цитохромоксидаза (Van den Bergen, 1994). Это отношение обычно увеличивается при переходе из состояния 3 в состояние 4, когда риск паразитических реакций одноэлектронного восстановления кислорода увеличивается (Liu, Huang 1996). Сродство альтернативной оксидазы к кислороду значительно ниже, чем у цитохромоксидазы (Millar et al., 1994; Wagner Moore, 1997) и, по-видимому, альтернативный транспорт электронов в растительных митохондриях активируется, когда концентрация кислорода становится выше оптимальной для протекания энергозапасающих процессов. Было предположено (Skulachev, 1996), что одной из функций несопряженного окисления является поддержание концентрации кислорода на относительно невысоком уровне, что является одним из защитных механизмов, предотвращающих избыточную генерацию восстановленных форм кислорода. В этой связи чрезвычайно важными представляются данные об участии восстановленных форм кислорода в индукции альтернативной оксидазы (Wagner, 1995).

Помимо механизмов, ограничивающих продукцию АФК, в клетках существует сложноорганизованная система их детоксикации. Она включает в себя как ферментативные (супероксидоксидаза, каталаза, пероксидаза), так и неферментативные (аскорбат, глутатион, токофероллы, карнозин, ансерин) механизмы уборки супероксидрадикала и перекиси водорода. Однако эффективность действия всех этих защитных систем не стопроцентна, и в тканях довольно часто по разным причинам возникают слишком высокие концентрации АФК, такие, что антиоксидантные и репарационные системы клеток не в состоянии справиться с вызываемыми АФК повреждениями. Такие ситуации получили обобщенное название окислительного стресса. Причиной окислительного стресса может являться превышение внутриклеточной концентрации кислорода сверх уровня, необходимого для нормальной работы терминальных оксидаз. (Skulachev, 1996).

1.3. Возникновение гипоксических состояний при прорастании семян и механизмы адаптации к дефициту кислорода

Способность организмов переносить условия гипо- или аноксии, то есть временный дефицит или отсутствие кислорода, широко распространена в природе и наиболее хорошо исследована для животных тканей, особенно для ишемических состояний (для обзора см. Kirino, 2002; Schumacker, 2002). Однако больший интерес представляет адаптивная реакция некоторых растений (например, риса) способных переживать длительные периоды в условиях пониженного содержания кислорода в тканях. Явление гипоксии является нормальным сотоянием проростков, интенсивно метаболизирующих запасные питательные вещества (Вартапетян, 1985).

Было показано, что при усилении кислородного дефицита активируется окислительный пентозофосфатный путь, возможно также взаимодействие основных дыхательных путей. При увеличении доли и интенсивности гликолиза траты углеводов (моносахаров) на дыхание должны усиливаться. Болотные растения, особенно их корневища, которые могут все зимние месяцы находиться в условиях кислородной недостаточности, содержат обычно значительное количество углеводов, главным образом крахмала (до 50% сухой массы). Вместе с тем для приспособленных растений получены данные о меньшем расходе моносахаров по сравнению с неустойчивыми объектами. Быстрая же гибель последних в бескислородной среде обусловлена не углеводным, а кислородным голоданием, поскольку такие растения не могут использовать имеющиеся в клетках сахара вследствие нарушения систем их метаболизации (Чиркова, 1988).

Обычный ход реакций цикла Кребса при аноксии тормозится, однако у одного из наиболее устойчивых растений — ежовника, торможение незначительно. Окисление NADH, необходимое для работы цикла, связывают с сопряжением его с процессами синтеза липидов и со своеобразием у этого растения ЭТЦ митохондрий, которое будет рассмотрено ниже (Чиркова, 2002).

Для большинства живых организмов поддержание высокой скорости гликолиза требует непрерывного реокисления восстанавливающихся в ходе его коферментов, которое при отключении в случае аноксии ЭТЦ митохондрий может происходить в конечных реакциях спиртового и, в меньшей мере для растений, молочнокислого брожения (Altman, Robin, 1969). В этом случае следует ожидать накопления конечных продуктов брожения, прежде всего этанола. Последний, действительно, накапливается при аноксии, однако динамика и предельный уровень этого процесса у растений, контрастных по устойчивости к гипоксии, имеют существенные отличия.

Одним из вспомогательных путей окисления восстановленных коферментов может быть обращение дикарбоновой части цикла Кребса, хорошо доказанное для микроорганизмов и животных (Hohl et al., 1987; Wiesner et al., 1988). При этом происходит окисление NADH в МДГ- и СДГ-реакциях (Grivennikova et al., 1993). Такой комплекс реакций под влиянием кислородной недостаточности включается и у некоторых растений, в частности, у зеленых водорослей (Selenastrum minimum) (Gred et al., 1990).

Считают, что в процессе эволюции цикл Кребса складывался при встречном развитии двух его составляющих, причем дикарбоновая часть реакций в обратном восстановительном направлении более древняя, чем трикарбоновая, и ее формирование относится к анаэробному периоду в развитии планеты. У сине-зеленых водорослей, а также у ряда пурпурных и зеленых серобактерий обе половины цикла трикарбоновых кислот не соединены друг с другом на уровне 2-оксоглутарата. Таким образом, обращение дикарбоновой части цикла Кребса и накопление сукцината, по-видимому, можно отнести к приспособлениям в условиях дефицита кислорода. Способность к окислению янтарной кислоты, то есть включение трикарбоновой части цикла, связывают с увеличением содержания кислорода в биосфере. Из этого следует, что древнейшие механизмы энергообмена (гликолиз, обращение дикарбоновой части цикла Кребса) оказываются важными для адаптации организмов к временному отсутствию кислорода в современных условиях обитания (Чиркова, 2002).

В пользу указанных предположений свидетельствуют экспериментальные доказательства принадлежности ди- и трикарбоновой частей ЦТК к разным метаболонам (ферментным комплексам, связанным со структурами клетки), а также возможности их несинхронного и независимого друг от друга функционирования. Вместе с тем нельзя отрицать и вероятности оттока метаболитов цикла Кребса в цитоплазму и использования их в анаплеротических реакциях окисления NADH, в том числе и в МДГ-реакцию (Пинеру и др., 1991).

При гипо- и аноксии происходит накопление не только малата и сукцината, но и других метаболитов (прежде всего аланина, а также шикимата, глицерина, аспартата), сопряженное с окислением восстановленных коферментов. Такие реакции, в большей мере характерные для устойчивых растений, не заменяют гликолиз, но дополняют его, обеспечивая не только окисление NAD(0)H, но и образование нетоксичных интермедиатов (Freminet et al., 1980).

При аноксии наиболее ранние и сильные изменения характерны для компонентов ЭТЦ митохондрий, что связано с высокой чувствительностью энергетических и транспортных процессов в митохондриях к кислороду. У факультативных анаэробов животных ЭТЦ митохондрий имеет определенные особенности: поток электронов от NADH и сукцината направляется на витамин К, а далее разветвляется на две цитохромные цепочки - классическую (Ь, с, a, aj и специфическую (Ь₅₅₂, Ь₅₅₆). Цитохромы Ь₅₅2 и Ь₅₅₆ могут использовать в качестве конечного акцептора электронов и протонов не только кислород, но и фумарат. В строго анаэробных условиях цитохромоксидаза не функционирует и основной поток электронов идет на фумарат. Восстановление фумарата в сукцинат осуществляется фумаратредуктазой при участии NADH, окисляющегося до NAD⁺. У микроорганизмов, гельминтов и других облигатных анаэробов при анаэробной передаче электронов на фумарат происходит генерация АТР (ИТФ). Возможность синтеза АТР при образовании сукцината обнаружена и у водорослей (Selenastrum minimum) (Gred et al., 1990). Среди растений своеобразием ЭТЦ выделяется ежовник. У него в состав ЭТЦ входит цитохром d₆₂9, который обнаружен и у бактерий. При действии ингибиторов основного и альтернативного путей митохондриальное дыхание ежовника подавляется на 60-70%, тогда как у большинства растений на 80-90%. Возможно, у ежовника имеется дополнительная терминальная оксидаза, включающая цитохром d, нечувствительная ни к цианиду, ни к SHAM. В таком необычном пути транспорта электронов альтернативным акцептором электронов могут быть нитраты (Чиркова, 2002).

В целом же вопрос о возможности перехода электронов после воздействия аноксии на альтернативный цитохромоксидазе CN-устойчивый путь исследован недостаточно. С одной стороны, известно, что кислород необходим для переключения электронов на альтернативный путь, а с другой — получены данные об активации этого пути в результате анаэробного воздействия. Развитию цианид-устойчивого пути способствуют также вещества, образующиеся при гипо- или аноксии: ацетальдегид, этанол, этилен. Кроме того, важно отметить, что при возобновлении доступа кислорода в тканях резко возрастает продукция АФК (Ruuge et al., 1991) и самым действенным регуляторным механизмом для образования АФК было бы плавное повышение концентрации кислорода в тканях. Физиологическая роль усиления альтерна- тивного пути после анаэробных условий состоит, вероятно, в необходимости окисления избытка накопленных восстановленных пиридиновых нуклеотидов и в регуляции рН.

1.4. Изменение температуры окружающей среды как фактор, регулирующий окислительные процессы

Высокие температуры переносятся живыми организмами гораздо хуже, чем низкие. Лишь небольшая группа микроорганизмов относится к термофилам, температурный оптимум для которых лежит в интервале 50-70С (Готтшалк, 1982). Снижение температуры зимой растения и животные могут переживать в течение нескольких месяцев, тогда как перегрев вызывает гибель, у большинства эукариотических организмов через несколько часов (Хочачка, Сомеро, 1986). Истинных термофилов среди эукариотов почти нет, хотя некоторые суккуленты, например Opuntia, приспособленные к условиям жаркого климата, выдерживают температуру 60-65 С. В основном термофилы — это различные бактерии, некоторые водоросли, живущие в термальных источниках или в кратерах вулканов и выдерживающие температуры 60-90 С (Чиркова, 2002).

При высоких температурах в первую очередь повреждаются мембраны, увеличивается их проницаемость. Наступает временная активация дыхания, которая быстро сменяется инактивацией. Увеличивается доля альтернативного пути дыхания, в котором энергия окисления рассеивается в виде тепла. Правда, известны данные и об отсутствии активации альтернативного пути при повышенной температуре. Усиливается микросомальное окисление, особенно растет ПОЛ. В результате происходит расточительное расходование субстратов, еще большее нарушение целостности мембран, что в совокупности с активацией альтернативного пути дыхания усугубляет деструктивные процессы (Зыкова и др., 2000; Pobezhimova et al., 1996).

Продолжительное воздействие или действие очень высокой температуры (55-65 С) вызывает тепловой шок (Рихванов и др., 2001). Происходит термоинактивация ферментов. В клетках начинается плазмолиз. Клеточный сок выходит из вакуоли, что заканчивается коллапсом клетки. На листьях появляются некротические пятна — «ожоги», называемые «запалом», в отличие от «захвата» при засухе, когда листья остаются зелеными (Генкель, 1988).

Механизмы приспособления к засухе и высокой температуре в значительной мере сходны, поскольку более высокая засухоустойчивость способствует повышению и жароустойчивости. Все эти приспособления обеспечивают отражение интенсивной солнечной радиации и снижение потерь воды при испарении. Во-вторых, растения от действия высокой температуры предохраняет интенсификация испарения воды в ходе устьичной транспирации. Растение активизирует поглощение воды, ее транспорт и испарение, в результате лист охлаждается (Семихатова, 1990).

Существование растений в условиях высоких температур достигается с помощью биохимической адаптации. Жаростойкие растения отличаются: 1) значительным содержанием прочносвязанной воды, что приводит к высокой вязкости цитоплазмы; 2) наличием тех же осмотически активных веществ, что и у засухоустойчивых растений: пролина, бетаинов, многоатомных спиртов, углеводов и гидрофильных олигопептидов; 3) повышенным содержанием органических кислот, которые связывают аммиак; 4) способностью длительно поддерживать стабильный уровень дыхания в широком диапазоне изменения температур, что необходимо для энергетического обеспечения обмена веществ, в частности для синтеза органических кислот, участвующих в детоксикации продуктов, которые накапливаются при перегреве; 5) обезвреживанием продуктов ПОЛ с помощью системы антиоксидантов; 6) стабильностью липидов и белков мембран, что поддерживает их функциональную активность (Чиркова, 2002; Wallace et al., 1984).

При воздействии пониженных температур в первую очередь повышается проницаемость мембран. Эта реакция относится к первичным механизмам воздействия холода. Изменение состояния мембран при низкой температуре в значительной мере связано с потерей ионов кальция. У озимой пшеницы, если воздействие не слишком сильное (ниже порога), мембраны клеток теряют ионы кальция, проницаемость увеличивается; различные ионы, в первую очередь калия, а также органические кислоты и сахара из цитоплазмы выходят в клеточную стенку или межклетники. Ионы кальция тоже выходят в клеточную стенку, но повышается их концентрация и в цитоплазме, при этом активируется РҐ-АТРаза. Активный транспорт протонов запускает вторичный активный транспорт, и ионы калия возвращаются в клетку. В результате увеличивается поглощение воды и тех веществ, которые вышли из клетки, то есть клеточный сок из экстраклеточного пространства входит в нее, что ведет к восстановлению ее состояния после повреждения (Чиркова, 2002).

При действии более низкой температуры потеря мембранами ионов кальция очень велика (выше порога). В результате сильного воздействия количество ионов кальция в цитоплазме увеличивается и мембранные структуры нарушаются, так же как и функции мембраносвязанных энзимов. Н+-АТРаза инактивируется, а фосфолипазы, наоборот, активируются, что вызывает утечку ионов и стимулирует деградацию мембранных липидов. В этом случае повреждения становятся необратимыми. Изменение проницаемости мембран связано также со сдвигами в жирнокислотных компонентах: насыщенные жирные кислоты из жидкокристаллического состояния переходят в состояние геля раньше, чем ненасыщенные. Поэтому чем больше в мембране насыщенных жирных кислот, тем она жестче, то есть менее лабильна, и тем чаще в ней возникают разрушения. Мутанты растений, дефектные по десатуразам жирных кислот, не способны переносить понижение температуры. В опытах по генной инженерии с использованием растительных десатураз жирных кислот было установлено изменение жидкостности мембран. При увеличении уровня ненасыщенных жирных кислот удавалось снизить чувствительность к понижению температуры, и наоборот, более высокая чувствительность к холоду достигалась при возрастании количества насыщенных кислот (16:0). Так, у арабидопсиса мутанты по генам fad5 и fad6, дефектные по синтезу хлоропластной десатуразы, отличались хлорозом листьев, замедлением роста и изменением формы хлоропластов (Zhuang, 1996).

Повышение устойчивости к низким температурам связано с предотвращением или устранением указанных выше причин повреждения и гибели живых организмов. Мембраны устойчивых организмов более стабильны, чем неустойчивых, поэтому потери кальция и нарушение их проницаемости меньше. Предохранение от дезинтеграции мембран достигается прежде всего длительным поддержанием ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов, что может быть следствием активации или поддержания активности десатураз жирных кислот.

Ферменты холодоустойчивых растений активны в широком температурном диапазоне, и оптимальная температура у них ниже, чем у ферментов теплолюбивых видов. В результате довольно долго поддерживается интенсивность синтетических процессов, в том числе и синтез ненасыщенных жирных кислот, для нормального протекания которого необходимо достаточное количество NADPH. Роль основного поставщика NADPH в условиях гипотермии выполняет ПФП, который активируется при адаптивной реакции.

В ходе холодового воздействия синтезируются и стрессовые белки холодового шока. Так, в проростках озимой пшеницы трехчасовая гипотермия (+3 С) индуцирует синтез большого набора стрессовых низкомолекулярных и гидрофильных белков. К протекторным белкам относятся и десатуразы. Изменяются физические и химические свойства мембран в направлении возрастания содержания ненасыщенных жирных кислот. Чем устойчивее растение, тем выше индекс ненасыщенности двойных связей жирных кислот липидов. При закаливании повышается содержание липидов, мембранных фосфолипидов и увеличивается их ненасыщенность. Накапливаются выполняющие защитную функцию криопротекторы (Borovskii et al., 2000). Снижается точка замерзания цитоплазмы.

При понижении температуры происходит активация фосфолипазы А₂, что приводит к накоплению свободных жирных кислот и вызывает изменения в энергетике клетки (Perez-Esteban et al., 1997). Жирные кислоты в митохондриях становятся не только основными субстратами окисления, но и важнейшим регулятором — разобщителем дыхания и фосфорилирования, упрощающим превращение энергии дыхательных субстратов в тепло. В обычных условиях откачивание Н* из внутреннего объема митохондрий наружу посредством ферментов ЭТЦ сопряжено с функционированием АТРазы. При пониженной температуре откачанные из митохондрий ионы водорода на внешней поверхности мембраны присоединяются к анионам жирных кислот R-COO" (Skulachev, 1999). Получающаяся при этом протонированная форма жирной кислоты RCOOH диффундирует через мембрану и диссоциирует на ее внутренней поверхности, давая RCOO" и Н*. Таким образом, происходит снижение мембранного потенциала и основным продуктом функционирования ЭТЦ является тепло. Образующийся анион RCOO" возвращается наружу при участии митохондриальных белков - анионных переносчиков, в частности ATP/ADP-антипортера (Skulachev 1988; Skulachev 1998). Его главная функция состоит в обмене аниона внешнего (цитозольного) ADP на внутримитохондриальный анион АТР, образованный АТРазой. Антипортер хорошо различает гидрофильные анионы, например ADP и GDP. Однако в отношении гидрофобных анионов такой избирательности не наблюдается. Поэтому ATP/ADP-антипортер оказывается способным к транспорту анионов жирных кислот. Разобщающий белок митохондрий, близкий к ATP/ADP-антипортеру, в отличие от последнего неспособен транспортировать нуклеотиды, но сохранил способность переносить анионы жирных кислот. При адаптации к низкой температуре разобщающий белок включается наряду с ATP/ADP-антипортером в транспорт анионов жирных кислот через митохондриальную мембрану. В результате конкурентного блокирования ATP/ADP-антипортера жирными кислотами транспорт ADP и АТР через внутреннюю мембрану митохондрий ингибируется, повышается активность альтернативного пути транспорта электронов и усиливается рассеивание энергии в виде тепла. Поэтому в тканях растений зимостойкой озимой пшеницы митохондрии генерируют тепло. Температура побегов пшеницы в течение некоторого времени остается более высокой, чем температура окружающей среды. Альтернативный путь в этот период выполняет защитную функцию, способствующую ускорению окисления (Войников и др., 2001). Однако вклад альтернативного пути в дыхание слишком мал, чтобы быть ответственным за перестройку всего дыхательного процесса.

В ходе закаливания происходит более масштабная перестройка дыхания: снижаются интенсивность поглощения кислорода и дыхательный коэффициент (Левашов и др., 1965), увеличивается активность дегидрогеназ, что сопровождается появлением новых изоферментов (пероксидаз, каталаз, полифенолоксидаз, цитохромоксидаз). Повышение активности дегидрогеназ связано с усилением их роли в поставке NADH, необходимых для усиливающихся в это время синтетических процессов, обмена и накопления защитных веществ (Сахаров, аминокислот, белков). При закалке у растений зимостойкого сорта озимой пшеницы, в отличие от животных тканей, отмечено повышение энергетической эффективности дыхания (Войников и др., 2001).

Таким образом, митохондриальное дыхание играет важную роль в адаптации живых организмов к изменению температуры окружающей среды. При пониженных температурах универсальным механизмом адаптации является термогенез, обеспечиваемый несопряженным или разобщенным окислением дыхательных субстратов как у растений, так и у животных. Это подтверждает сделанное еще в 1958 г. предположение, что термогенез может быть одной из функции свободного окисления (цит по. Скулачев, 1989).

Окислительный стресс, генерация активных форм кислорода и «свободное окисление» как способ защиты от них

Устойчивость живых организмов - это их способность сохранять относительное постоянство внутренней среды, то есть гомеостаз в определенном диапазоне внешних воздействий. Она определяется степенью выживаемости организмов в неблагоприятных условиях обитания.

Устойчивость организма обеспечивается совокупностью механизмов: специфических, зависящих от особенностей фактора среды, и общих, неспецифических, характерных для отдельных воздействий и отражающих свойства самой реагирующей системы. Комплекс неспецифических изменений, возникающих при действии любых неблагоприятных факторов среды, называется стрессом, а сами факторы именуются стрессорами (Чиркова, 2002).

Термин «стресс» был введен в 1936 г. канадским физиологом Гансом Селье для обозначения совокупности первичных неспецифических изменений животного организма под влиянием любых внешних воздействий. Исследуя гипофизарно-адренокортикотропную систему у животных, он открыл «синдром болезни» как таковой, то есть неспецифический ответ организма на любое повреждение, вызванное бактериальной инфекцией, интоксикацией в связи с действием фармакологических и химических веществ, травмами, переохлаждением или ожогами, нервными потрясениями и т. д.

Селье обратил внимание на то, что изменения защитных сил животного (и человека) при различных заболеваниях обычно сопровождаются увеличением содержания в крови кортикостероидных гормонов, мобилизующих обмен веществ. При этом организм, несмотря на изменение своего состояния, приобретает способность сохранять относительную стабильность внутренней среды. Эта реакция была оценена им как адаптивная, то есть приспособительная реакция целостного организма, и названа генерализованным адаптационным синдромом. Согласно Селье, способность к адаптации является наиболее характерной чертой жизни, и приспособление всегда возникает в результате концентрации усилий (или напряжения). Отсюда и название «стресс» (англ. stress — напряжение). Подчеркнем, что Г. Селье увидел между неспецифическими признаками определенную связь, отражающую характер защитных реакций организма на воздействие, и понял, что это важнейший биологический феномен, присущий всем живым существам. По Селье, кривая ответных реакций на воздействие включает три фазы («триада Селье»): тревоги, адаптации и истощения. На протяжении триады формируется неспецифическая резистентность, но при увеличении силы эффекта и исчерпании защитных возможностей организма наступает его гибель (Селье, 1972).

Биохимическая адаптация у растений изучена также значительно хуже по сравнению с молекулярными механизмами приспособления животных к разнообразным условиям среды, тем не менее, имеющиеся данные свидетельствуют о глубоких и значительных изменениях в растительном организме, затрагивающих клеточный уровень. Под действием стрессоров у живых организмов имеет место ускоренный расход макроэргических соединений: происходит активация и синтез стрессовых белков, изменения затрагивают также гормональный баланс, проницаемость мембран, кислотность и вязкость цитоплазмы и т.д., что, в конечном итоге, приводит к торможению роста и угнетению физиологических процессов (Хочачка, Сомеро, 1977). В настоящее время для полной расшифровки механизмов стресса на молекулярном и клеточном уровнях необходимо изучение роли ферментных систем в ходе физиолого-биохимической адаптации к стрессовым факторам. Очевидно, что, в первую очередь, внимание должно быть обращено на особенности функционирования ферментов центральных метаболических путей, определяющих продуктивность растений. Однако многие аспекты данной проблемы остаются до настоящего времени мало изученными и не вполне ясными. Так, практически отсутствуют данные об особенностях каталитического действия и регуляции активности ферментов ЦТК в ходе развития метаболической реакции растения на стресс. Хотя имеющиеся данные позволяют заключить, что ЦТК в стрессовых условиях (в частности, при дефиците 02) подвергается существенной реорганизации (Чиркова, 2002). Возможно, происходит обращение дикарбоновой части цикла; шунтирование его дополнительными ферментативными реакциями, приводящими к накоплению, так называемых "стрессовых" аминокислот и органических кислот (гамма-аминомасляной кислоты, сукцината) (Bown, Shelp, 1989). Однако физиологическое значение данных процессов, регуляция их на ферментативном уровне остаются неясными.

Обогащение атмосферы Земли кислородом произошло на заре эволюции. Это событие положило начало развитию нового, бесконечно разнообразного мира аэробных организмов, в метаболизме которых кислород занимает главное место, обеспечивая их энергией за счет окисления питательных веществ в процессе дыхания. Ансамбли дыхательных ферментов, расположенные во внутренней мембране митохондрий растительных и животных клеток (а у бактерий - в плазматической мембране) обеспечивают перенос электронов на кислород, служащий конечным акцептором. Транспорт электронов осуществляется по градиенту окислительно-восстановительного потенциала этих ферментов, а выделяющаяся энергия конвертируется в электрохимический трансмембранный потенциал, который далее может быть использован для совершения работы, например, синтеза АТР или транспорта ионов (подробнее смотри Скулачев, 1989).

Ротенон-нечувствительные НАДН и НАДФН дегидрогеназы

Регуляция активности альтернативной оксидазы осуществляется за счет восстановления дисульфидного мостика, связывающего две субъединицы АО (Umbach et al., 1994). Кроме того, при добавлении кетокислот, например, пирувата, происходит увеличение убихинон оксидазной активности за счет формирования тиогемиацетала с одним из цистеиновых остатков (Umbach et al., 1994).

Хотя функция альтернативной оксидазы обсуждается (Parsons et al., 1999), однозначно признается, что у растений семейства Ароидные АО участвует в термогенезе, необходимом для повышения интенсивности испарения летучих веществ, привлекающих насекомых-опылителей. Подобное адаптационное приспособление обнаружено также у растений из других семейств подкласса Aridae (Cyclanthaceae, Palmae), из некоторых семейств подкласса Magnoliidae (Annonaceae, Aristolochiaceae, Nymphaceae) и в мужских репродуктивных органах некоторых цикад (Wagner, Moore, 1997). В нетермогенных тканях, в целом, активность АО ниже в нефотосинтезирующих тканях. Уровень содержания АО может повышаться в стрессовых условиях (Siedow et al., 1995), причем в этих условиях наблюдается ингибирование цитохромного пути. Химические ингибиторы цитохромного пути, например антимицин А, также приводят к индукции экспрессии белка альтернативной оксидазы в растениях и грибах (Minagawa et al., 1992). То есть в общем можно предположить, что индукция активности АО наблюдается, в том случае если заингибирован или нарушен цитохромный путь.

Накопление в клетке АТР и NAD(3 )H и снижение концентрации ADP приводит к ингибированию электронного транспорта через цитохромный путь (Mcintosh, 1994). Альтернативный электронный транспорт в этих условиях может обеспечивать поддержание работы цикла Кребса. H.Lambers (1982) предположил, что функцией альтернативной оксидазы является "energy overflow", т.е. что АО интенсифицируется при насыщении цитохромного пути. Эта гипотеза поддерживается данными о регуляции активности АО пируватом, накапливающимся при торможении ЦТК (Hoefhagel et al., 1995) и восстановлением дисульфидных мостиков в молекуле АО, приводящем к диссоциации димера фермента и его активации. В этом процессе может участвовать HADPH и тиоредоксин или глутатион-зависимая система. Еще одной важной функцией АО, вероятно, является участие в защите клеток от окислительного стресса. Функционирование электронтранспортной цепи митохондрий связано с четырехэлектронным восстановлением кислорода. Но существует также возможность функционирования паразитического процесса одноэлектронного восстановления кислорода, приводящего к образованию супероксидрадикала (02"). Инициируемые позднее ферментативные процессы приводят к образованию перекиси водорода и чрезвычайно агрессивного окислителя гидроксилрадикала (ОН), который может окислять практически все компоненты клетки, включая ДІЖ. Эти процессы наиболее активно протекают при блокировании работы ЭТЦ, нарушении работы Q-цикла и накоплении убисемихинона (CoQ"). Одним из механизмов предотвращения кислородной опасности может быть понижение внутримитохондриальной концентрации кислорода (Skulachev, 1996). Ранее было предположено, что одним из механизмов, обеспечивающих этот процесс, является альтернативная оксидаза. Функционирование этого пути индуцируется окислительным стрессом и может способствовать снижению редокс уровня компонентов ЭТЦ и минимизировать образование восстановленных форм кислорода (Van den Bergen et al., 1994). Гипотезу участия АО в процессах детоксикации 02 и снижения уровня восстановленности компонентов ЭТЦ подтверждает то, что восстановленные формы кислорода являются мессенджерами в процессии экспрессии генов АО. Wagner (1995) показала, что Н202 может индуцировать экспрессию генов АО в растительных тканях. Активация синтеза АО также наблюдалась у растений и » дрожжей, выращиваемых в присутствии антимицина A (Minagawa et al., 1992). Кроме того, супероксидный радикал является вторичным мессенджером в индукции АО (Minagawa et al., 1992). Салициловая кислота, являющаяся внутриклеточным генератором Н202, а также добавление в среду цистеина, ацетата и цитрата или изоцитрата приводит к повышению уровня мРНК, продуцируемой геном Aoxl, кодирующего АО, а содержание мРНК гена Ccl, кодирующего один из полипептидов цитохрома с) остается неизменным (Wagner, Moore, 1997).

Ротенон-нечувствителъные НАДН и НАДФН дегидрогеназы Для растительных митохондрий описано несколько ротенон-нечувствительных НАДН и НАДФН дегидрогеназ, акцептором электронов для которых, как и для комплекса I является убихинон (Moller, 2002). В лаборатории проф. Меллера было показано, что помимо комплекса I во внутренней мембране митохондрий с внутренней стороны локализованы две ротеноннечувствительные дегидрогеназы. Одна - Са2+"зависимая НАД(Ф)Н дегидрогеназа, другая -кальцийнезависимая НАДН дегидрогеназа (Табл. 3). Эти ферменты связаны с электронным транспортом через комплекс III и, по-видимому, участвуют в генерации мембранного потенциала (Melo et al., 1996). Кроме того на внешней стороне внутренней мембраны митохондрий обнаруживаются Са2+-зависимые НАДН и НАДФН дегидрогеназы, функционирование которых не приводит к образованию мембранного потенциала. Данные ферментные системы еще не очищены, поэтому многие аспекты их регуляции остаются невыясненными (Melo et al., 1996).

Анализ интенсивности дыхания митохондрий, мембранного потенциала, уровня восстановленности хинонов и скорости генерации активных форм кислорода

Определение активности ферментов проводили при 25С с помощью спектрофотометрических методов. Активность изоцитратлиазы определяли по методу Dixon и Kornberg (1959) при 324 нм. Среда определения содержала 50 мМ трис-HCl буфер (рН 7.5), 0.5 мМ изоцитрат, 4 мМ фенилгидразин и 5 мМ MgCl2.

Малатсинтазу определяли при 412 нм по формированию комплекса СоА и дитио-бис-нитробензойной кислоты (ДТНБ). Среда спектрофотометрирования включала 50 мМ трис-HCl буфер (рН 7.5), 150 мкМ ацетил-СоА, 2 мМ глиоксилат и 1 мМ ДТНБ.

Активность МДГ определяли спектрофотометрически при 340 нм по изменению оптической плотности реакционных смесей, определяемой скоростью образования или расходования NADH. При определении скорости ферментативного восстановления оксалоацетата среда калориметрирования содержала 50 мМ трис-НС1, рН - 7,5, 2 мМ оксалоацетат, 0,15 мМ NADH. Для измерения активности МДГ в прямой реакции использовали реакционную среду следующего состава: 50 мМ трис-НС1, рН-8,0; 30 мМ малат; 0,2 мМ NAD+.

Для определения активности АГ применяли метод, основанный на учете разности поглощения цитрата и изоцитрата по сравнению с цис-аконитатом. Показателем активности являлось возрастание плотности раствора при 240 нм за счет образования цис-аконитата. При определении активности АГ по этому методу использовали среду спектрофотометрирования следующего состава: 50 мМ трис-НС1 (рН 7.8), 20мМ цитрата Na (или 10 мМ изоцитрата).

Для определения активности СДГ использовали метод Cooper и Beevers (1969). Для определения активности фермента использовались искусственные акцепторы электронов с подходящим редокс потенциалом и удобными спектральными свойствами (ФМС, ДХФИФ). Средой определения служил 30 мМ калий-фосфатный буфер, содержащий 0,033 % ФМС, 0,002 % ДХФИФ, 2 мМ азид натрия и сукцинат натрия в концентрации от 0,2 до 20 мМ в зависимости от цели эксперимента. рН среды составлял 7,8. Контролем служила среда без сукцината. Активность фермента фиксировали по падению оптической плотности среды спектрофотометрирования при длине волны 600 нм (максимум поглощения для ДХФИФ) в течение 10-15 минут при 25С, обусловленное обесцвечиванием акцептора в ходе его восстановления. Для расчета активности использовалась разница коэффициентов миллимолярной экстинкции для окисленной и восстановленной форм акцептора, равной 20 мМ см"1. При расчете учитывали, что ДХФИФ - двухэлектронный акцептор.

Продукты реакции, катализируемой ГСО, определяли спектрофотометрически с использованием вспомогательных ферментов. Возможность образования маната и оксалоацетата анализировали при 340 нм, добавляя МДГ (0.015 ФЕ/мл) и соответственно NAD+ (0.6 мМ) или NADH (0.2 мМ). Возможность образования лактата и пирувата анализировали, добавляя ЛДГ (0.015 ФЕ/мл) и соответственно NAD и NADH. Определение пероксида водорода проводили с использованием пероксидазы и о-дианизидина при 435 нм. Реакционная смесь во всех случаях содержала 50 мМ Трис-HCl, рН 7.8, 20 мМ сукцината, ферментную вытяжку, соответствующие вспомогательные ферменты и кофакторы. Контролем служила реакционная смесь, содержащая все компоненты, кроме сукцината. Для измерения ферментативной активности ГСО осадок микротелец разрушали в присутствии различных концентраций следующих детергентов: дигитонина, Твина-80, Тритона Х-100. Для ингибирования СДГ при измерении ГСО в неочищенных фракциях, вносили ТТФА в конечной концентрации 5 мМ. Активность каталазы определяли спектрофотометрически при 230 нм (Breidenbach et al., 1968). Активность фумаратгидратазы определяли по увеличению оптической плотности при 240 нм в результате образования фумарата. За единицу ферментативной активности (ФЕ) принимали количество фермента, образующее 1 мкмоль продукта за 1 минуту при 25С. Гашение супероксидных радикалов осуществляли в среде, содержащей 60 мМ Трис-НС1-буфер, рН 8.9, 9 мМ ТЕМЕД, 20 мкМ рибофлавина, 10 мкМ нитросинего тетразолия, 0.1 мМ ЭДТА, 30 мкг/мл БСА, 2 мкг/мл каталазы (Weisiger, Fridovich, 1973). В опытных вариантах в кюветы вносили осадок глиоксисом (100 мкг белка) в присутствии или в отсутствии 5 мМ сукцината. Образцы освещали лампой 60 Вт на расстоянии 20 см в течение 5 мин и определяли изменение оптической плотности при 560 нм. Для получения высокоочищенных препаратов ИЦЛ был разработан метод, включающий несколько стадий очистки. После гомогенизации материала проводили фракционирование белков сульфатом аммония. От низкомолекулярных соединений ферменты отделяли гель-фильтрацией на сефадексе G-25. Далее использовали ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе или ДЭАЭ-фрактогеле, и гель-хроматографию на Toypearl HW-65. Частичная очистка других ферментов проводилась с использованием тех же методов, по схемам, описанным по ходу изложения экспериментальных данных. Все операции проводили в холодной комнате при 0...4С. Один грамм печени гомогенизировался в 10 мл среды выделения (рН 7,5), содержащей 50 мМ трис-НС1, 1 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтол и 1 мМ ЭДТА. Для осаждения неразрушенных тканей использовалось центрифугирование при 2000g в течение 5 минут. Измельченный растительный материал гомогенизировали в заранее охлажденных в течение ночи фарфоровых ступках со средой выделения следующего состава: 50 мМ трис-НС1 буфер, рН 7,5, содержащий 5 мМ MgCl2, 5 мМ ДТТ, 2 мМ ЭДТА. Из бесклеточного экстракта дифференциально высаливали различные фракции насыщения сульфатом аммония. Для этого в вытяжку добавляли в течение 15 минут при постоянном помешивании сульфат аммония. После центрифигурирования при 15000g в течение 20 минут к супернатанту добавляли следующую порцию (NH4)2S04. (Гродзинский, Гродзинский, 1973). Во время высаливания ферментов осуществляли постоянный контроль рН, добавляя при необходимости 1 М NaOH, поскольку под действием сульфата аммония может подкисляться среда, что, в свою очередь, приводит к инактивации фермента и снижению его выхода в ходе фракционирования.

Обнаружение индукции глиоксилатного цикла в печени крыс при голодании

Экстракция, разделение с помощью HPLC и определение восстановленной и окисленной форм убихинонов из изолированных митохондрий проводилось по методике, описанной A.Wagner и M.Wagner (1995). 0,5-1 мг митохондриального белка использовалось для одного определения.

Измерение интенсивности продукции перекиси водорода митохондриальной фракцией проводили с помощью флюоресцентного метода на флюориметре MPF-4 (Hitachi, Япония), используя в качестве зонда 2 тМ 2,7-дихлордигидроксифлюоресцеиндиацетат (Popov et al., 1997). Среда инкубации содержала 20 мМ HEPES/Tris буфер (рН 7,5), 0,4 М сахароза, 5 мМ КН2Р04, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ MgCl2, 2 мкМ ротенон и 1 мкМ олигомицин. В качестве вспомогательного фермента для определения перекиси водорода применяли пероксидазу (3 ФЕ/мл среды инкубации), использовавшую зонд и перекись водорода в качестве субстратов. При построении калибровочной зависимости была показана логарифмическая зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации Н202.

Для определения скорости продукции супероксидрадикала фиксировалось окисление эпинефрина по разности поглощения между длинами волн 480-579 нм (Purvis et al., 1995). В среду инкубации аналогичную среде определения перекиси водорода вносился 1 мМ эпинефрин. В таблицах приведена СОД-чувствительная часть окисления эпинефрина.

Все спектры ЭПР регистрировали на спектрометре Е-109Е фирмы Varian (США) в условиях варьируемой газовой среды при комнатной температуре ( 25С). Инкубацию митохондрий производили непосредственно в резонаторе спектрометра при непрерывной аэрации образца или при гипоксии (газовая среда - воздух или азот, соответственно). Содержание кислорода в среде инкубации определяли по ширине компонент спектра ЭПР нитроксильного радикала TEMPONE-D-X5N (4-оксо-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-016-1 -оксил-l5N). Условия записи спектров: СВЧ мощность 5 мВт (для TIRON) или 0,5 мВт (для TEMPONE-D- N), СВ частота 9,15 ГГц, амплитуда ВЧ модуляции 0,05 мТл. Абсолютные значения скорости образования 0{ митохондриями определяли с помощью модельной системы ксантиноксидаза-ксантин по интенсивности сигнала ЭПР спиновой ловушки TIRON. Калибровку системы ксантиноксидаза-ксантин проводили по измерению скорости восстановления цитохрома с супероксидными радикалами на спектрофотометре фирмы Весктап (США).

Блотинг-анализ Для проведения иммуноферментного анализа 100 ug митохондриального белка солюбилизировались в буфере, содержащем 312 мМ Трис/HCl [рН 6.8], 10% SDS, 10% глицерол, 0.002% бромфеноловый синий и 100 мМ дитиотрейтол и кипятились в течение 1-2 минут. Образцы наносились на 10% полиакриламидный гель и после трансфера на мембрану использовались для инкубации с антителами (Wagner, 1995). Антитела против альтернативной оксидазы из Sauromatum guttatum были любезно предоставлены проф. Т. Elthon, против StUCP были предоставлены проф. Vercesi. При инкубации использовалось разведение 1:1000, визуализация осуществлялась хемилюминисцентно.

Для изучения содержания мРНК, соответствующей флавопротеину сукцинатдегидрогеназы осуществляли несколько этапов: экстракция суммарной РНК из тканей, обратная транскрипция мРНК и ПЦР-амплификация участка гена СДГ с разработанными нами дегенерированными праймерами.

Для выделения тотальной РНК использовали метод фенол-хлороформной экстракции РНК. Для гомогенизации 1 г ткани использовали 10 мл среды, содержащей 42,6% гуанидин тиоцианат, 0,75 М цитрат натрия (рН 7), 10% саркозил, 2 мМ 2-меркаптоэтанол. К полученному гомогенату добавляли 1 мл 2 М ацетата натрия (рН 4), 10 мл водонасыщенного фенола, 2 мл смеси хлороформ-изоамиловый спирт (49:1). Отделение РНК от ДНК и белка проводили центрифугированием смеси при 10000 g в течение 20 минут. Водную фазу переносили в чистую пробирку и добавляли 10 мл изопропанола. Смесь инкубировали при -20 С в течение 1 часа. Осадок РНК собирали центрифугированием при 10000 g (20 мин, 4 С). Препарат РНК ресуспендировали в 3 мл среды для гомогенизации. Для повышения степени чистоты РНК добавляли один объём изопропанола и повторяли последний этап. Полученный осадок ресуспендировали в 75% этаноле, осаждали центрифугированием. РНК высушивали при комнатной температуре и растворяли в 30 мкл деионизованной воды.

Визуализацию результатов экстракции РНК проводили с помощью формальдегидного электрофореза в 1%-агарозном геле. К суммарной РНК (1-0,2 мкг) добавляли 4 мкл 5-кратного буфера, содержащего 250 мМ Tris-HCl (рН 8,3), 375 мМ КС1, 15 мМ MgCl2, 50 мМ DTT, и 1 мкл 2 мМ раствора dNTP. Смесь доводили деионизованной водой до суммарного объёма 15 мкл и инкубировали 3 мин при 60 С. Затем прибавляли 2 мкл раствора олиго-dT праймера, 1 мкл раствора РНазина, 2 мкл раствора MuLV-RT обратной транскриптазы. Проводили инкубацию смеси при 37 Січи при 42 С последующие 30 мин в амплификаторе ДНК фирмы Biometra. Результат обратной транскрипции визуализировали с помощью агарозного гель-элекрофореза ДНК в 1%-агарозном геле. Для идентификации гена сукцинатдегидрогеназы использовали метод полимеразной цепной реакции со специально синтезированными дегенерированными праймерами (5 -GARTTYGTNCARTTYCAYCC-3 и 5 -CCNCCCATRTTRTARTGNAC-3 ) Состав реакционной смеси: 1 мкл ДНК-пробы, 5 мкл ПЦР буфера (100 мМ Tris-HCl, рН 8,3, 500 мМ КС1), по 1 мкл раствора праймера 1 и праймера 2, 1 мкл 2мМ раствора dNTP, 1 мкл 50 мМ раствора MgS04, 0,5 мкл Thermostar Taq-полимеразы (20 ед/мкл), 39,5 мкл деионизованной воды. Температура отжига праймеров составляла 49 С. После амплификации фрагмент, получнный в результате ПЦР (370 Ьр) был клонирован с помощью вектора PGemT Easy и использовался для получения радиоактивного зонда для проведения гибридизации с мРНК. 35Р dATP включался в зонд с помощью Кленов-энзима. 100 ug общей РНК связывались с нитроцеллюлозной мембраной и гибридизовалась с меткой в течение 30 мин при 58С. Для визуализации после промывки мембраны использовалась пленка Pharmacia.

Похожие диссертации на Роль процессов свободного окисления дыхательных субстратов в метаболизации жирных кислот и защите от активных форм кислорода

Биологическая роль активных форм кислорода при физиологически и патологически протекающей беременностиСторожук Александр Петрович

Влияние активных форм кислорода на структурно-функциональное состояние мембран мышечных клеток и их антиоксидантная защитаДятлов, Роман Викторович

Влияние гомоцистеина на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами крысБрюшкова, Екатерина Александровна

Роль процессов свободнорадикального окисления в микробиологической деградации нефтиСазыкин, Иван Сергеевич

Содержание энергетических субстратов в печени и мышцах и продуктов гликолиза в крови лабораторных мышей после введения метилфосфоновой кислотыСавинова, Ирина Викторовна

Взаимодействие карнозина и родственных ему соединений с активными формами кислородаТюлина, Ольга Владимировна

Образование 8-оксогуанина в ДНК и активных форм кислорода в растворах под действием тепла и методы их определенияМасалимов Жаксылык Каирбекович

Медьсодержащие мембранные оксидоредуктазы: их свойства, функции и роль меди в восстановлении кислородаМаркосян, Кира Андреевна

Восстановление кислорода в электрон-транспортной цепи хлоропластов высших растений: роль ферредоксина и мембраносвязанных переносчиков электроновКозулева, Марина Алексеевна

Регистрация неравновесных состояний мембраносвязанных ионов водорода в митохондриях и их роль в процессе окислительного фосфорилированияЮрков Владимир Игоревич