Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 10
1.1. Гомоцистеин 10
1.1.1. Метаболизм гомоцистеина 10
1.1.2. Причины повышения концентрации гомоцистеина в плазме крови 12
1.1.3. Гомоцистеин как фактор риска 13
1.2. Глутаматные рецепторы как возможная мишень для действия ГЦ 16
1.2.1. Общая характеристика глутаматных рецепторов 16
1.2.2. NMDA-рецептор: структура и функции 20
1.2.3. Нейропротекторный и экзайтотоксический пути активации NMDA-рецепторов .23
1.3. Влияние ГЦ на клетки крови. Нейтрофилы 25
1.3.1. Общая характеристика нейтрофилов 26
1.3.2. Функциональная активность нейтрофилов 27
1.3.3. Системы генерации АФК в нейтрофилах 29
1.3.3.1. NADPH-оксидаза – источник АФК в нейтрофилах 30
1.3.3.2. Миелопероксидаза 35
1.3.4. Рецепторы нейтрофилов 39
II. Материалы и методы исследования 45
11.1. Выделение нейтрофилов 45
11.1.1. Выделение нейтрофилов из периферической крови 45
11.1.2. Выделение активированных in vivo нейтрофилов 45
11.2. Выделение суспензии нейронов из мозжечка крыс 46
11.3. Подсчет клеток в камере Горяева 46
11.4. Опсонизация зимозана 47
11.5. Хемилюминометрический метод регистрации активных форм кислорода 48
11.6. Определение активности коммерческого препарата миелопероксидазы человека 49
11.6.1. Измерение продукции гипохлорита в ходе реакции, катализируемой препаратом миелопероксидазы 49
11.6.2. Спектрофотометрический метод измерения активности миелопероксидазы 49
11.6.3. Исследование возможности прямого взаимодействия гомоцистеина с гипохлоритом 50
11.7. Исследование клеток методом проточной цитометрии 50
11.7.1. Принцип метода проточной цитометрии 50
11.7.2. Побор оптимальных условий выделения нейтрофилов из общей лейкомассы на среде MonoPoly 52
II.7.3. Получение очищенной суспензии интактных нейтрофилов 53
11.7.4. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток 54
11.8. Идентификация белковых субъединиц NMDA-рецептора 56
11.8.1. Лизис клеток и иммунопреципитация белка 56
11.8.2. Разделение белков методом электрофорез в SDS-полиакриламидном геле 56
11.8.3. Вестерн блоттинг 58
II.8.4. Идентификация белка методом усиленной хемилюминесценции (ECL) 59
11.9. ПЦР 60
11.9.1 Индукция экспрессии мРНК для NR1 субъединицы NMDA-рецептора 60
11.9.2 Выделение тотальной РНК 61
11.9.3. Получение кДНК в реакции обратной транскрипции 62
11.9.4. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) 62
11.10. Определение концентрации цАМФ в нейтрофилах 64
11.10.1. Принцип метода 64
11.10.2. Определение концентрации цАМФ в нейтрофилах 65
11.11. Статистическая обработка результатов 66
III. Результаты и их обсуждение 67
111.1. Исследование действия гомоцистеина на генерацию активных форм кислорода интактными и активированными in vivo нейтрофилами 67
111.2. Исследование механизмов антиоксидантного эффекта ГЦ 71
111.2.1. Ферментативные системы нейтрофилов, отвечающие за генерацию АФК 71
111.2.2. Изучение влияния ГЦ на коммерческий препарат миелопероксидазы 72
III.2.2.1 Влияние ГЦ на активность МПО, измеренную хемилюминесцентным
методом.. 72
111.2.2.2. Исследование прямого взаимодействия ГЦ с гипохлорит-анионом 75
111.2.2.3. Влияние ГЦ и других серосодержащих соединений на активность МПО, измеренную в присутствии о-дианизидина.. 76
111.3. Исследование возможности рецепторного воздействия ГЦ на нейтрофилы 80
111.3.1. Определение экспрессии мРНК к NR1 субъединице NMDA-рецепторного комплекса 80
111.3.2. Идентификация субъединиц NMDA-рецептора в активированных in vivo нейтрофилах 83
111.3.3. Исследование экспрессии NR2B субъединицы NMDA-рецептора на поверхности интактных и активированных in vivo нейтрофилов 85
111.3.4 Исследование роли NMDA-рецепторов в ГЦ-индуцируемом усилении продукции АФК активированными in vivo нейтрофилами 87
111.3.5 Исследование возможного механизма реализации действия ГЦ на
активированные in vivo нейтрофилы через NMDA-рецепторы 89
111.4. Исследование других возможных путей реализации эффекта гомоцистеина 91
111.4.1. Изучение роли метаботропных глутаматных рецепторов в реализации 92
действия ГЦ 92
111.4.2. Изучение роли аденозиновых рецепторов в реализации действия ГЦ 94
IV. Заключение 97
Выводы 101
Благодарности 102
Список литературы
- Гомоцистеин как фактор риска
- Системы генерации АФК в нейтрофилах
- Исследование возможности прямого взаимодействия гомоцистеина с гипохлоритом
- Исследование экспрессии NR2B субъединицы NMDA-рецептора на поверхности интактных и активированных in vivo нейтрофилов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Гомоцистеин (ГЦ) является природным метаболитом, связывающим обмен метионина и глутатиона. В норме его стационарный уровень в крови не превышает 15-20 мкМ [Seshadri et al, 2002], но в условиях нарушения метаболизма ГЦ наблюдается гипергомоцистеинемия, характеризующаяся повышением его уровня в крови до 100-500 мкМ и выше. При этом увеличение концентрации ГЦ в плазме крови может быть как причиной, так и следствием патологических состояний. Повышение стационарного уровня ГЦ в организме коррелирует с разнообразными сердечнососудистыми и нейродегенеративными заболеваниями [Boushey et al, 1995]. ГЦ является фактором риска инфарктов и инсультов [Mangoni and Jackson, 2002], а также усиливает развитие атеросклероза [McCully et al, 1975; Tehlivets, 2011].
Токсическую роль ГЦ в повреждении клеток нервной системы связывают с его взаимодействием с глутаматными рецепторами и явлением экзайтотоксичности, которое характеризуется повышением концентрации ионов Са в цитоплазме, активацией Са -зависимых ферментативных каскадов и росту свободных радикалов в нейронах [Dingledine et al, 1999].
Данные о влиянии ГЦ на иммунокомпетентные клетки немногочисленны и фрагментарны. Известно, что ГЦ усиливает адгезию лейкоцитов к сосудистой стенке [Guo and Dudman, 2001], вызывает активацию, дифференциацию и апоптоз Т-лимфоцитов [Dawson et al, 2004], усиливает продукцию активных форм кислорода (АФК) в тромбоцитах [Signorello et al, 2002], стимулирует сборку и активацию NADPH-оксидазы в нейтрофилах и моноцитах [Alvarez-Maqueda et al. 2004; Siow et al, 2006]. Эти факты свидетельствуют о том, что ГЦ направленно стимулирует цитотоксичность данных клеток, но механизм описанных явлений до конца не установлен.
Уровень активных форм кислорода и хлора в клетках крови является важной характеристикой их метаболического состояния. Его изменение служит сигнальным механизмом для запуска различных клеточных процессов, таких как дифференцировка, пролиферация, апоптоз. С другой стороны, при нарушениях работы организма несбалансированная продукция АФК становится очень опасной, причем ведущая роль в подобных патологических состояниях принадлежит нейтрофилам - единственным клеткам организма, продуцирующим в межклеточное пространство значимое количество активных форм кислорода и хлора.
В связи с вышесказанным, изучение влияния ГЦ на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами и исследование возможных механизмов действия ГЦ является
актуальной проблемой, имеющей как теоретическое, так и практическое значение для современной биохимии.
Целью данной работы явилась оценка влияния гомоцистеина на генерацию активных форм кислорода и хлора в интактных и активированных in vivo нейтрофилах.
Задачи исследования:
Исследовать продукцию активных форм кислорода и хлора в суспензии интактных и активированных in vivo нейтрофилов крысы в присутствии гомоцистеина методом люминол-зависимой хемилюминесценции.
Исследовать возможные механизмы действия гомоцистеина на нейтрофилы, находящиеся в разных функциональных состояниях.
Изучить возможность нерецепторного влияния ГЦ на уровень активных форм кислорода и хлора, продуцируемых нейтрофилами.
Выявить возможные рецепторы, участвующие в реализации эффектов ГЦ, на мембране нейтрофилов.
Установить возможность экспрессии de novo канальной NR1-субъединицы NMDA-рецептора в нейтрофилах после их активации.
Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе охарактеризовано влияние гомоцистеина - соединения, которое образуется в ходе взаимопревращения метионина и цистеина, на нейтрофилы крыс, находящиеся в разных функциональных состояниях. Обнаружено, что интактные и активированные in vivo нейтрофилы различным образом реагируют на повышенные концентраций гомоцистеина.
Показано, что для интактных клеток ГЦ выступает в роли умеренного супрессора уровня АФК. Установлено, что в пределах физиологических концентраций ГЦ ингибирует миелопероксидазу, специфический фермент азурофильных гранул нейтрофилов. Обнаружена способность ГЦ напрямую реагировать с продуктом миелопероксидазной реакции гипохлоритом, приводящая к образованию хлораминового производного гомоцистеина.
В работе впервые установлена способность нейтрофилов экспрессировать NMDA-рецепторы в результате их активации in vivo. При помощи иммунофлуоресцентного окрашивания показано связывание антител с внеклеточным доменом NR2B субъединицы NMDA-рецепторного комплекса на мембране активированных in vivo нейтрофилов. С помощью иммунопреципитации выявлены белки, соответствующие NR1 и NR2B субъединицам NMDA-рецептора. Показано участие NMDA-рецепторов в реализации
эффекта ГЦ, приводящего к увеличению продукции АФК нейтрофилами, выделенными из очага острого воспаления.
Полученные результаты расширяют представления как об экспрессии NMDA-рецепторов в клетках иммунной системы, так и о механизмах взаимодействия гомоцистеина с нейтрофилами в зависимости от их иммунного статуса, что существенно для понимания молекулярных механизмов токсичности гомоцистеина.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на научных семинарах кафедры биохимии Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Россия, Москва, 2008); Ehrlich II World Conference on Magic Bullets (Germany, Nurnberg, 2008); 7th Int. Conference on Homocysteine Metabolism (Czech Republic Prague, 2009); 12th Int. Congress on Molecular Mechanisms of Neurological and Psychiatric Disorders (Slovakia, Martin, 2009); the 6th European Meeting for Vascular Biology and Medicine (Poland, Krakow, 2011). Апробация работы прошла на кафедре биохимии МГУ имени М.В. Ломоносова (26 сентября 2011 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, включая 2 статьи в журналах, входящих в список ВАК РФ, 1 статья в зарубежной монографии и 6 тезисов научных докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, разделов «Материалы и методы исследования», «Результаты и их обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 120 страницах печатного текста, содержит 38 рисунков и 10 таблиц. Список литературы включает 218 отечественных и зарубежных источников.
Гомоцистеин как фактор риска
Причин повышения концентрации ГЦ в крови может быть довольно много: снижение фильтрующей способности почек [Arnadottir et al., 1996], происходящее вследствие различных заболеваний; нарушение всасывания витамина B12, вызванное заболеваниями желудочно-кишечного тракта; недостаточное поступление с пищей витаминов, участвующих в метаболизме ГЦ (витаминодефицитное состояние), наследственная предрасположенность (дефицит того или иного фермента, участвующего в метаболических превращениях ГЦ), а также чрезмерное поступление метионина с пищей.
Самыми частыми причинами повышения уровня гомоцистеина являются витаминодефицитные состояния. Особенно чувствителен организм к недостатку витаминов B6, B12 и фолиевой кислоты [Ubbink et al., 1993]. Другим важным фактором, способствующим росту уровня ГЦ в крови, является наследственная предрасположенность. Наиболее подробно изучены генетические нарушения, связанные с работой фермента MTHFR [Varga et al., 2005]. MTHFR обеспечивает превращение 5,10-метилентетрагидрофолата в 5-метил-тетрагидрофолат, являющийся основной реакционно-способной формой фолиевой кислоты, которая используется во многих биохимических превращениях, включая метилирование гомоцистеина. Существует несколько аллельных вариантов гена, кодирующего этого фермент, экспрессия которых приводят к тяжелой недостаточности MTHFR, но большинство из них встречается редко. Практическое значение имеют два аллеля: термолабильный аллель C677T и аллель A1298C [Weisberg et al., 2001]. Показано, что у индивидуумов, гетерозиготных по обоим аллелям, уровень ГЦ значительно выше по сравнению с таковым у пациентов, имеющих только один мутатнтный аллель (C677T).
Концентрация ГЦ в крови может меняться в зависимости от приема ряда лекарств. Механизм их действия обычно связан с влиянием на функцию почек, а также на уровень витаминов и гормонов [Welch, Loscalo, 1998]. Негативно на уровень ГЦ влияют метотрексат (антагонист фолиевой кислоты, применяемый для лечения ревматоидного артрита) [Morgan, Baggott, 2010], противосудорожные препараты (в частности, фенитоин, истощающий запасы фолиевой кислоты в печени [Mintzer et al., 2009]) и метформин (препарат, использующийся для лечения сахарного диабета второго типа) [Carlsen et al., 1997]. Напротив, прием некоторых гормонов, таких как 17-эстрадиол, приводит к снижению уровня ГЦ в крови женщин в период менопаузы [Hak et al., 2001].
Повышение уровня гомоцистеина в крови наблюдается при диагностике большого количества различных заболеваний, в частности, витаминодефицитных состояний и почечной недостаточности. Сахарный диабет [Huijberts et al., 2005], псориаз [Malerba et al., 2006] и лейкозы (особенно в раннем возрасте) [Ruud et al., 2006] часто сопровождаются ростом уровня гомоцистеина в крови. Увеличение концентрации ГЦ в плазме крови происходит также при развитии некоторых карцином, таких как рак молочной и щитовидной желез, а также при лимфобластомах [Welch, Loscalo, 1998]. Существуют данные о том, что повышенную склонность к гипергомоцистеинемии имеют курящие [Stein et al., 2002]. Потребление больших количеств кофе также является мощным фактором, способствующим повышению уровня гомоцистеина в крови [Grubben et al., 2000]. Предполагается, что негативное действие кофеина на уровень ГЦ связано с изменением фильтрующей функции почек.
Даже сравнительно небольшое повышение уровня ГЦ в крови (до 30 мкМ) служит фактором риска для возникновения ряда сердечнососудистых заболеваний (атеросклероз, инфаркт миокарда, ишемическая болезнь сердца, тромбо-васкулярная болезнь) и заболеваний нервной системы (инсульт, болезнь Альцгеймера, эпилепсия, врожденные дефекты развития нервной системы).
В 1975 году K. McCully предложил гомоцистеиновую теорию атеросклероза, хронического заболевания, характеризующегося утолщением и уплотнением стенок артерий. Он исходил из полученных им данных о положительной корреляции между увеличением уровня ГЦ в крови и развитием тяжелых сердечнососудистых заболеваний [McCully, 1975]. В дальнейшем были проведены разнообразные опыты по моделированию сердечнососудистых заболеваний. В результате было показано, что артерии животных, употреблявших избыточное количество метионина, характеризуются утолщением интимы, усилением пролиферации гладкомышечных клеток и увеличением количества пенистых клеток [Harker et al., 1976; Boushey et al., 1995; Mangoni et al., 2002].
Сегодня считается, что ГЦ влияет на развитие атеросклероза, действуя на несколько различных типов клеток. С одной стороны, ГЦ ингибирует транспорт L-аргинина в тромбоцитах, что приводит к уменьшению продукции NO [Mutus et al., 2001], а также ослабляет высвобождение NO эндотелиальными клетками [Upchurch et al., 1997]. Поскольку NO является вазорелаксантом и предотвращает агрегацию тромбоцитов и тромбоз, то в результате действия ГЦ возрастает интенсивность тромбообразования. С другой стороны, ГЦ индуцирует ферментативное окисление арахидоновой кислоты, что сопровождается образованием тромбоксана В2 и генерацией АФК [Signorello et al., 2002].
Важной особенностью гомоцистеина является его высокая химическая активность. В организме он может превращаться различные производные, такие как ГЦК, гомоцистеин тиолактон (ГЦТ), гомоцистин и другие. Показано, что гомоцистеин тиолактон обладает способностью модифицировать различные белки путем образования пептидной связи между ГЦ и -NH2 группой лизина в составе модифицируемого белка. Это явление получило название гомоцистеинилирование (Рис. 3).
Впервые ГЦТ был синтезирован в 1934 г. кипячением метионина с иодистоводородной кислотой (HI). Кроме того, он также образуется из ГЦ в кислой среде при нагревании. По химической структуре ГЦТ представляет собой циклический тиоэфир, в котором SH-группа конденсирована с карбоксильной группой. ГЦТ способен спонтанно гидролизоваться до ГЦ, однако в физиологических условиях (в водном растворе при pH 7,4 и 37C) его время полужизни составляет около 25 ч. В биологических системах синтез ГЦТ тесно связан с активностью аминоацил-тРНК-синтетазы (ААРС).
Образование ГЦТ показано в различных типах клеток млекопитающих, включая раковые и трансформированные клетки гепатом и карцином человека, почечной аденокарциномы мышей (RAG) и эндотелиальных клетках пуповинной вены человека [Betowski, 2005].
Высокая реакционная способность ГЦТ, в результате которой к белкам присоединяется остаток ГЦ, существенно влияет на работу различных белков. На примере трипсина и метионил-тРНК-синтетазы было показано, что множественное гомоцистеинилирование по остаткам лизина вызывает формирование большого числа межмолекулярных сшивок, что приводит к утрате активности и денатурации этих ферментов [Jakubowski, 1999]. В ряде экспериментов показано гомоцистеинилирование таких белков как сывороточный альбумин, фибриноген, трансферрин, миоглобин, -глобулин, цитохром с и других [Betowski, 2005]. Хорошо известно о ряде белковых модификаций, сопровождающих различные заболевания. Так, пенициллирование белков при участии антибиотика пенициллина связано с развитием аллергии на данный препарат, ацетилирование белков аспирином рассматривают как одну из возможных причин непереносимости этого вещества, а модификация ряда белков глюкозой может лежать в основе развития таких патологических процессов как диабет или болезнь Альцгеймера [Jakubowski, 1999]. На сегодняшний день исследователи предполагают, что гомоцистеинилирование представляет собой еще один вариант повреждения белков, которое вносит свой вклад в развитие различных патологии при гипергомоцистеинемии [Jakubowski, 2004].
Системы генерации АФК в нейтрофилах
В последнее время в литературе стали появляться данные о том, что нейтрофилы вовлекаются в развитие противоопухолевого иммунного ответа. Они мигрируют в зоны наиболее интенсивного роста опухоли и ингибируют поверхностную диффузию опухолевых клеток, а также разрушают трансформированные и опухолевые клетки на ранних стадиях канцерогенеза, но способны проявлять также и проопухолевое действие, что встречается чаще всего на III-IV стадии онкологического заболевания [Мальцева и соавт., 2006; Мальцева, Сафронова, 2009]. Показано, что на поздних стадиях формирования злокачественных образований инфильтрация опухоли нейтрофилами способствует прогрессу ее развития, усилению ангиогенеза и метастазирования с помощью L- и P-селектинов [Borsig et al., 2002]. Поскольку негативное действие, оказываемое нейтрофилами на организм, в первую очередь связано с избыточной продукцией этими клетками АФК, рассмотрим их пути образования в нейтрофилах более детально.
Понятие «активные формы кислорода» (АФК) носит довольно условный характер. Этот собирательный термин используется для того чтобы подчеркнуть высокую реакционную способность всех промежуточных продуктов восстановления обычной молекулы кислорода и ее возбужденного (синглетного) состояния [Осипов и соавт., 1993]. На сегодняшний день, к этой группе относят разные по своей структуре химические соединения: молекулы (Н2О2), свободные радикалы (ОН, НО2), ион-радикалы (О2). Основными компонентами АФК являются супероксидный анион-радикал (О2), гидроксильный радикал (ОН), перекись водорода (Н2О2), синглетный кислород (1О2), оксид азота (NO), пероксильный (RO2) и алкоксильный (RO) радикалы, гипогалоиды (HOCl, HOBr, HOI) и пероксинитрит (ONOO) [Дубинина, 2006].
Процесс поглощения иммунокомпетентными клетками чужеродных частиц сопровождается так называемым «дыхательным взрывом» - интенсивным потреблением кислорода, направленным на генерацию АФК [Бурместер, Пецутто, 2007]. При этом усиление потребления О2 не связано с обычным клеточным дыханием, что подтверждается данными о нечувствительности данного явления к ингибиторам дыхательной цепи митохондрий. При помощи ингибиторного анализа было также показано, что и вклад процесса пе-рекисного окисления липидов в генерацию АФК в этом случае незначителен [Мальцева и соавт., 2006].
Иммунокомпетентные клетки имеют две основные системы генерации АФК - это NADPH–оксидазный комплекс и миелопероксидаза. Кроме того, известно о присутствии-ии в цитоплазме нейтрофилов двух изоформ NO-синтазы (нейрональной и цитокининду-цибельной) [Saini et al., 2006]. Поскольку обе изоформы фермента локализуются в цитоплазме и генерируют NO во внутриклеточное пространство, роль NO-синтазы в реализации «дыхатиельного взрыва» невелика. Интенсивность генерации АФК нейтрофилами определяется в основном активностью NADPH-оксидазы, которая у нейтрофилов млекопитающих детально изучена [Дубинина, 2006].
I.3.3.1. NADPH-оксидаза – источник АФК в нейтрофилах
NADPH–оксидаза представляет собой сложный комплекс из белков, локализованных как в составе плазматической мембраны, так и в цитоплазме. Мембраносвязанный компонент состоит из белков gp91phox (в составе которого присутствуют два координируемых гистидинами гема) и p22phox [Babior et al., 1976], а также малого G-белка Rap1A, роль которого на сегодняшний день до конца не установлена. Белки p22phox и gp91phox вместе с FAD, который отвечает за связывание NADPH, формируют гетеродимерный флавоцито-хром b558. Его функция заключается в переносе электронов от цитоплазматического NADPH на молекулу внеклеточного кислорода [Segal et al., 1979]. Кроме того, предполагается, что gp91phox представляет собой специфический канал, по которому протоны транспортируются из клетки во внеклеточную среду, компенсируя возникающий при работе фермента положительный заряд на цитоплазматической стороне мембраны [Henderson et al., 1988].
Цитозольная часть NADPH-оксидазы состоит из белков p47phox, p67phox, p40phox [Hancock et al., 2001], малых G-белков Rac2 и Cdc42, а также недавно обнаруженного белка пе-роксиредоксина p29. Он сочетает в себе фосфолипазную и пероксидазную активности и способен восстанавливать тиоредоксин [Ambruso et al, 2004]. Тем не менее, его роль до конца не установлена. Цитозольные белки, кроме малого G-белка Rac2, ассоциированы в 260 кДа комплекс, для стабилизации которого необходимы ионы Mg2+ [Cross et al., 1999].
В покоящихся клетках NADPH-оксидаза находится в «разобранном» состоянии: 15% флавоцитохрома b558 локализовано в плазматической мембране, а оставшиеся 85% при-30 сутствуют в мембранах специфических гранул или секреторных везикул, которые транс-лоцируются в плазматическую мембрану при активации фермента [Cross et al., 1981].
При активации нейтрофила происходит сборка NADPH–оксидазного комплекса, результатом которой является генерация супероксидного анион-радикала (О2.-), а также повышение в клетке уровня свободной арахидоновой кислоты, вызывающее синтез лейкот-риенов [Radmark, Samuelsson, 2010].
Несмотря на важность всех компонентов NADPH-оксидазы для обеспечения нормальной работы фермента, наибольший интерес представляют цитоплазматические белки, поскольку именно они подвергаются модификациям при сборке NADPH-оксидазного комплекса, а значит, являются мишенями различных регуляторных воздействий. Дополнительное фосфорилирование сериновых и треониновых остатков цитоплазматических белков p47phox, p67phoxи p40phox осуществляется с помощью протеинкиназы С, p38-MAPK, фосфоинозитид-3-киназы и p21-активируемой киназы [Sheppard et al., 2005]. С-концевой богатый пролином домен p47phox имеет по крайней мере 6 серинов, по которым его может фосфорилировать протеинкиназа С, а также два участка фосфорилирования МАP-киназой. Это фосфорилирование является необходимым условием для транслокации белка в цито-плазматическую мембрану. Важную роль в этом процессе играет N-концевой PX домен белка, который взаимодействует с фосфатидилинозитол-3,4-бисфосфатом плазматической мембраны. Показано, что в случае нарушения этих взаимодействий (например, при точечных мутациях в структуре белка) развивается хронический гранулематоз [Kanai et al., 2001]. Между тем, в покоящихся нейтрофилах PX домен блокирован с помощью аутоин-гибиторного домена и становится доступен для взаимодействия только после фосфорили-рования белка.
Аналогичным образом, фосфорилирование необходимо для транслокации в мембрану p67phox и осуществления его взаимодействия с p40phox и Rac2. Интересно, что находящийся в покоящихся клетках в уже фосфорилированном состоянии p40phox при активации нейтрофила подвергается дополнительному фосфорилированию протеинкиназой С по остаткам серина и триптофана, что коррелирует с возрастанием генерации супероксид-радикалов.
Исследование возможности прямого взаимодействия гомоцистеина с гипохлоритом
Суспензию нейтрофилов, содержащую 10 000 клеток, осаждали центрифугированием при 200g 5 мин и ресуспендировали в «Stimulation Buffer», состоящим из среды Хенкса, 5 мМ HEPES и 0,05% БСА, pH 7,4 (все используемые реактивы входят в состав кита) с добавлением 1 мМ ингибитора фосфодиэстеразы 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX). Затем суспензию инкубировали с антителами, меченными флуоресцентным красителем (титр 1:100), в течение 15 мин при 25 С.
В измерительную ячейку стандартного 96-луночного планшета вносили 6 мкл суспензии клеток, добавляли 500 мкМ ГЦ и «Stimulation Buffer» до конечного объема 12 мкл, после чего инкубировали 30 мин при 37С и постоянном перемешивании. После окончания инкубации в ячейку добавляли равный объем раствора «Detection Mix» (22,4 мкМ Eu-SA, 13,6 мкМ биотин-цАМФ в «Stimulation Buffer») и инкубировали в темноте при 25 С в течение 1 ч. «Detection Mix» готовили заранее и выдерживали 15 мин в темноте при 25 С. Сигнал от образцов регистрировали с помощью прибора для чтения планшетов «Wallac 1420» (PerkinElmer, Finland).
Строили калибровочную кривую зависимости сигнала от концентрации в пробе цАМФ (исходная концентрация 50 мкМ). В качестве положительного контроля использовали пробы с добавлением форскалина, прямого активатора аденилатциклазы, чтобы удостовериться в наличии в клетках работающего фермента. Соответствующие графики приводятся на Рис. 18.
Измерения проводили не менее чем в 3 параллельных пробах для каждого измеряемого в опыте параметра. Полученные результаты сопоставляли с данными контрольных проб, полученных в аналогичных условиях. Между собой сопоставляли результаты, полученные не менее чем для 3 различных животных. Итоговые результаты количественных измерений представлены в виде «среднее значение ± средняя ошибка». Статистическую обработку данных внутри одного эксперимента проводили с использованием критерия значимости Y 0,1, а при обработке серии экспериментов использовали t критерий Стью-дента для независимых выборок. Достоверными считали различия при которых Р 0,05.
Для статистической обработки результатов, полученных методом проточной цито метрии, использовали критерий Смирнова-Колмогорова (при а = 0,05), который отражает достоверность различий между двумя распределениями. III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Нейтрофилы представляют собой уникальные клетки, способные продуцировать значительное количество активных форм кислорода и хлора во внеклеточное пространство. Это явление, известное как «дыхательный взрыв», является одной из основных цитотоксических функций нейтрофилов [Маянский, Маянский, 1989]. Образующиеся в результате «дыхательного взрыва» активные формы кислород и хлора проявляют бактерицидное, цитотоксическое и иммунорегуляторное действие.
Тем не менее, роль АФК в организме двойственна. С их помощью нейтрофилы обеспечивают защиту организма от различных патогенных инвазий, замедляют рост трансформированных клеток на ранних этапах формирования опухоли [Zivkovic еt al., 2005], обеспечивают деструкцию чужеродных антигенов и собственных дефектных клеток. С другой стороны, АФК, продуцируемые нейтрофилами обладают канцерогенным потенциалом, участвуют в мутагенезе, повреждая белки и нуклеиновые кислоты [Knaapen et al., 2006], способствуют пролиферации опухолевых клеток на поздних стадиях заболевания [Мальцева, Сафронова, 2009], а также могут включаться в аутокринную регуляцию жизнеспособности и функций нейтрофилов [Splettstoesser, Schuff-Werner, 2002]. Все это свидетельствует о том, что избыточная активация нейтрофилов представляет существенную опасность для организма и актуальным направлением исследования является изучение возможных причин гиперактивации данных клеток.
Известно, что ГЦ вызывает активацию и дифференциацию Т-лимфоцитов и их апоптоз [Dawson et al., 2004], препятствует высвобождению NO тромбоцитами [Mutus et al., 2001], усиливает продукцию АФК и высвобождение арахидоновой кислоты в тромбоцитах [Signorello et al., 2002]. Поэтому первым этапом нашей работы стало изучение влияния гомоцистеина на генерацию нейтрофилами активных форм кислорода.
Продукцию АФК регистрировали с помощью хемилюминесцентного метода в присутствии 1 мкМ люминола. В случае нейтрофилов, выделенных из очага острого воспаления, наблюдали интенсивную хемилюминесценцию клеток без добавления какого-либо дополнительного активатора.
Исследование экспрессии NR2B субъединицы NMDA-рецептора на поверхности интактных и активированных in vivo нейтрофилов
В ходе данной работы мы установили, что гомоцистеин по-разному влияет на интактные и активированные нейтрофилы. На интактные клетки ГЦ действует как умеренный супрессор продукции свободных радикалов. В то же время, на клетки, выделенные из очага острого воспаления, фактически имитирующего поведение нейтрофилов в условиях патогенной инвазии, ГЦ оказывает стимулирующее действие, увеличивая генерацию клетками АФК в 1,5 раза.
Известно, что в нейтрофилах присутствует две системы генерации АФК - NADPH– оксидазный комплекс и миелопероксидаза. Измеряя хемилюминесценцию интактных и активированных клеток в присутствии апоцинина, специфического ингибитора NADPH-оксидазы, мы обнаружили, что в интактных клетках генерацию АФК осуществляют как МПО, так и NADPH-оксидаза, а в активированных – только NADPH-оксидаза. Предварительные результаты, полученные в нашей лаборатории, свидетельствуют о том, что в экспериментах in vitro нейтрофильные гранулы, содержащие в том числе и МПО, оказывается истощенными в результате дегрануляции уже через 30 мин после добавления зимозана. Поскольку МПО не синтезируется de novo зрелыми нейтрофилами [Gullberg et al., 1997], клетки, подвергнутые 5 часовой активации в очаге острого воспаления, не должны содержать данного фермента. Кроме того, известно, что ГЦ инициирует сборку белкового комплекса NADPH-оксидазы нейтрофилов [Sheppard et al., 2005] и, значит, должен вызывать активацию этого фермента и клеточного ответа в целом. Таким образом, разнонаправленный эффект ГЦ может быть связан с тем, что он по-разному действует на оба компонента, отвечающие за генерацию АФК.
Мы предположили, что ГЦ в интакных клетках связывает продуцируемый МПО гипохлорит или/и ингибирует фермент непосредственно. В пользу данного предположения свидетельствует тот факт, что в присутствии ГЦ снижение уровня АФК, генерируемых интактными клетками, происходит на постоянную величину не зависимо от того, был ли ГЦ добавлен в преинкубацию или по ходу развития хемилюминесцентного сигнала («мгновенный эффект»).
Для проверки нашего предположения мы проанализировали влияние ГЦ на очищенную миелопероксидазу с использованием двух различных методов: хемилюминометрического и спектрофотометрического. В обоих случаях протекание реакции регистрируется по образованию продукта, но использование во втором методе о-дианизидина, специфического субстрата миелопероксидазы [Klebanoff, 1965], позволяет избежать взаимодействия исследуемых соединений с продуктом реакции. Оказалось, что в диапазоне концентраций ГЦ от 1 до 10 мкМ наблюдается уменьшение хемилюминесцентного сигнала вплоть до нуля, что может быть вызвано подавлением активности фермента и/или связыванием продукта реакции. При этом в этом же диапазоне наблюдается незначительное снижение активности МПО, измеряемое по количеству окисленного о-дианизидина. Полное ингибирование фермента наблюдалось в присутствии 500 мкМ о-дианизидина.
Тот факт, что действующая концентрация ГЦ зависит от способа регистрации реакции, свидетельствует о взаимодействии ГЦ не только с ферментом, но и с продуктом реакции гипохлоритом. Чтобы убедиться в правильности данного предположения, мы проанализировали спектры поглощения гомоцистеина, гипохлорита и смеси этих соединений. В смеси, содержащей одновременно ГЦ и гипохлорит, наблюдалось исчезновение пика 290 нм, характерного для гипохлорита. При этом появляется пик поглощения при 252 нм, что соответствует продукту взаимодействия ГЦ с гипохлоритом (хлорамину гомоцистеина).
Таким образом, мы показали, что ГЦ не только ингибирует миелопероксидазу, но и выступает в качестве ловушки для основного продукта ее реакции, гипохлорита. Сравнение влияния ряда серосодержащих соединений на активность МПО показало, что функциональной группой, ответственной за ингибирующий эффект, является SH-группа. Мы предполагаем, что ингибирующий эффект ГЦ, глутатиона и ацетилцистина может быть связан с ковалентным присоединением данных соединений к МПО с участием SH-или S-S-связей данного белка.
Поскольку в наших опытах ГЦ оказывал противоположно направленный эффект на нейтрофилы, находящиеся в различных функциональных состояниях, мы предположили, что интактные клетки могут отличаться от активированных in vivo наличием или отсутствием на мембране одного или нескольких типов рецепторов.
Известно, что в нейтрофилах в присутствии ГЦ возрастает количество активных (фософорилированных) форм p38-MAP и Erk1/2 киназы за счет снижения внутриклеточного уровня MAPK-фосфатазы-1, отвечающей за дефосфорилирование p38-MAPK и Erk1/2 [Alvarez-Maqueda et al., 2004]. Эти данные свидетельствуют о возможности рецепторного действия ГЦ на клетки иммунной системы. По аналогии с данными, полученными для лимфоцитов [Болдырев, Тунева, 2005], мы предположили, в нашем случае эффект ГЦ может также реализоваться при участии NMDA-рецепторов.
Поскольку наличие данных рецепторов в интактных клетках не было показано [Владыченская, Болдырев, 2009], мы начали проверку нашей гипотезы с установления принципиальной возможности экспрессии мРНК для NR1-субъединицы NMDA-98 рецептора. При помощи метода РТ-ПЦР мы показали экспрессию искомой мРНК в нейтрофилах после активации. Полученные данные подтверждают нашу гипотезу о том, что экспрессия NR1 субъединицы NMDA-рецептора в нейтрофилах является индуцибельной.
Считается доказанным, что для формирования функционального NMDA-рецептора в нервной системе млекопитающих необходима комбинация NR1 и NR2 субъединиц, делающая возможным одновременное связывание глицина и глутамата [Laube et al., 1993, Kuryatov et al., 1994, Grimwood et al., 1995]. С помощью Вестерн блоттинга мы продемонстрировали присутствие в лизатах активированных нейтрофилов белков, соответствующих NR1 и NR2B субъединицам NMDA-рецептора. С помощью иммунофлуоресцентного окрашивания клеток FITC-меченными антителами на внешний домен NR2B субъединицы NMDA-рецептора, мы продемонстрировали локализацию данных рецепторов на плазматической мембране активированных in vivo нейтрофилов. Предположение о реализации прооксидантного эффекта ГЦ через эти рецепторы, подтверждаются нашими опытами, в которых продемонстрирована чувствительность обсуждаемого феномена к специфическому антагонисту NMDA-рецепторов МК-801.
Из литературы известно, что эффект, оказываемый гомоцистеином на нейроны и лимфоциты, реализуется как через ионотропные, так и и метаботропные глутаматные рецепторы [Владыченская и соавт., 2006, Zieminska et al., 2003, Lipton et al., 1997], однако данных о наличии этих рецепторов на мембране нейтрофилов на сегодняшний день нет. С другой стороны, хорошо известно об участии аденозиновых рецепторов в регуляции различных функций нейтрофилов, включая цитотоксичность [Sun, 2007]. Поэтому в данной работе мы исследовали также роль глутаматных и аденозиновыех рецепторов в прооксидантном действии ГЦ на данные клетки.
Проведя иммунофлуоресцентное окрашивание нейтрофилов FITC-меченными антителами к метаботропным глутаматным рецепторам I и III класса, мы не обнаружили присутствия на плазматической мембране клеток как в случае интактных, так и в случае активированных in vivo нейтрофилов. Полученные результаты позволили исключить метаботропные глутаматные рецепторы из дальнейшего рассмотрения. Чтобы проверить могут ли аденозиновые рецепторы вовлекаться в индуцируемое гомоцистеином увеличение продукции АФК, мы исследовали влияние антагонистов трех типов аденозиновых рецепторов на интенсивность хемилюминесценции активированных in vivo нейтрофилов. Оказалось, что преинкубация клеток с антагонистом 2 типа аденозиновых рецепторов ZM 241385 частично предотвращала рост уровня хемилюминесценции клеток в присутствии ГЦ. Полученные результаты согласуются с известными из литературы данными об участии аденозиновых рецепторов второго типа в регуляции внутриклеточных сигнальных каскадов, приводящих к снижению активности NADPH-оксидазы [Rib et al., 2008].
Таким образом, в настоящей работе мы впервые продемонстрировали, что влияние гомоцистеина на нейтрофилы зависит от функционального состояния этих клеток. В отсутствие дополнительной активации клеток, гомоцистеин в физиологических концентрациях выступает в роли антиоксиданта, аналогично таурину или глутатиону, нейтрализуя гипохлорит, продуцируемый миелопероксидазой, а так же обладает способностью ингибировать миелопероксидазу, снижая уровень АФК продуцируемых нейтрофилами при локальной активации. Но при этом, ГЦ, сам по себе не вызывая активации нейтрофилов, в значительной степени стимулирует генерацию свободных радикалов клетками, полученными из очага воспаления, индуцированного in vivo, действуя через глутаматные рецепторы NMDA-класса. Появление в активированных in vivo нейтрофилах NMDA-рецепторов, регулирующих активность этих клеток, частично объясняет прооксидантный эффект ГЦ. Участие аденозиновых рецепторов в реализации этого эффекта свидетельствует о существовании у нейтрофилов физиологических механизмов регуляции цитотоксической активности в условиях повышенных концентрации ГЦ и глутамата. Все эти факты свидетельствуют, что в условиях гипергомоцистеинемии, осложненной любым воспалительным процессом, может иметь место избыточная драматическая активация клеток иммунной системы, которая может приводить к негативным последствиям для организма в целом.
