Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы 10
2.1. Характеристика липидов кожи 10
2.2. Регенерация кожи и процесс формирования грануляционно-фиброзной ткани 15
2.2.1. Морфологические характеристики грануляционно-фиброзной ткани 15
2.2.2. Некоторые биохимические особенности развивающейся грануляционно-фиброзной ткани 21
2.2.3. Влияние различных гормонов на процесс репаративной регенерации кожи 27
2.3. Биологическое действие мелатонина 30
2.3.1. Структура, синтез и содержание мелатонина в тканях 30
2.3.2. Биологические эффекты мелатонина 35
2.3.3. Влияние мелатонина на репаративные процессы в коже 40
III. Экспериментальная часть и методы исследований 44
3.1. Объекты исследований 44
3.2. Организация исследований 44
3.2.1. Модельные системы для изучения процесса регенерации кожи 44
3.2.2. Изучение влияния мелатонина на липиды раневого поля кожи крыс 45
3.3. Методы анализа липидов 47
3.3.1. Получение и очистка общего липидного экстракта 47
3.3.2. Анализ общих липидов и их отдельных фракций 47
3.3.3. Микрометоды определения общих фосфолипидов и их фракций 51
3.4. Статистическая обработка результатов исследований 54
Результаты собственных исследований 55
4.1. Изменения содержания общих липидов, общих фосфолипидов и их фракций в грануляционно-фиброзной, рубцовой тканях, струпе и прираневых участках кожи крыс в процессе регенерации 55
4.2. Влияние подкожного введения мелатонина на липидные показатели грануляционно-фиброзной, рубцовой тканей, струпа и прираневых участков кожи крыс в процессе регенерации 61
4.3. Влияние внутрибрюшинных инъекций мелатонина на липидный состав грануляционно-фиброзной ткани крыс 80
4.4. Изменения липидов грануляционно-фиброзной ткани крыс в условиях местного нанесения мелатонина 84
Обсуждение результатов исследований 90
5.1. Характеристика изменений липидных показателей раневого поля крыс при нормальном заживлении кожных ран 90
5.2. Сравнительная характеристика влияния длительного предварительного подкожного введения разных доз мелатонина на липиды раневого поля кожи крыс 93
5.3. Особенности действия однократного и многодневного введения мелатонина на липидные показатели грануляционно-фиброзной ткани крыс 98
5.4. Особенности воздействия местного применения мелатонина на липиды грануляционно-фиброзной ткани крыс 99
5.5. Сравнительная характеристика влияния разных способов и режимов введения мелатонина на липиды раневого поля кожи крыс в ходе регенерации 101
Выводы 104
Список литературы 107
- Морфологические характеристики грануляционно-фиброзной ткани
- Изучение влияния мелатонина на липиды раневого поля кожи крыс
- Влияние подкожного введения мелатонина на липидные показатели грануляционно-фиброзной, рубцовой тканей, струпа и прираневых участков кожи крыс в процессе регенерации
- Характеристика изменений липидных показателей раневого поля крыс при нормальном заживлении кожных ран
Введение к работе
Актуальность проблемы. Регенерация кожных ран является сложным многоэтапным процессом, сопровождающимся разнообразными изменениями клеточных компонентов раневого поля (грануляционно-фиброзной, рубцовой, тканей, струпа, прираневых участков кожи), существенными биохимическими перестройками белкового, углеводного, липидного и минерального обменов в нем [14,55,79,102]. Проведены многочисленные исследования, посвященные проблемам регуляции раневого процесса с помощью различных физико-химических факторов, лекарственных и гормональных препаратов [22,104,125,155,183].
В настоящее время большее значение приобретает изучение влияния на заживление ран эпифизарного гормона мелатонина в связи с его использованием в лечении разнообразных, в том числе кожных заболеваний [1,6,70,73,76]. Известно, что мелатонин проявляет широкий спектр действия. Этот гормон считается модучятором иммунной и эндокринной систем [5,89,90], обладает выраженными антиоксидантными свойствами [84,176,190,193], влияет на пролиферацию клеток [87,122,135,145], участвует в регуляции метаболизма белков, липидов и углеводов разных органов и тканей [123,186,194]. Перечисленные функции мелатонина позволяют предполагать как прямые, так и опосредованные механизмы его влияния на процессы репарации. На клеточном уровне это может выражаться в изменении динамики энергетического и пластического обменов компонентов раневого поля. Установлено, что экзогенный мелатонин изменяет спектр солерастворимых белков и фракционный состав гликозаминогликанов грануляционно-фиброзной ткани [50]. Данные, касающиеся влияния мелатонина на превращения липидов раневого поля, в настоящее время крайне ограничены. Вместе с тем, подобные исследования представляют интерес как с точки зрения выявления новых аспектов действия гормона в организме, так и в плане разработки общей проблемы регуляции восстановительных процессов в различных тканях.
Целью исследования явилось изучение изменений липидов раневого поля кожи крыс при нормальном заживлении и в присутствии экзогенного мелатонина.
В задачи исследования входило:
1. Выявить изменения липидного состава раневого поля кожи крыс при нормальном заживлении.
2. Исследовать влияние длительного предварительного подкожного введения мелатонина на липиды раневого поля кожи крыс в динамике заживления.
3. Оценить действие однократных и многодневных внутрибрюшинных инъекций мелатонина на липидные параметры грануляционно-фиброзной ткани крыс в процессе регенерации.
4. Изучить эффект местного нанесения мелатонина на липидные показатели грануляционно-фиброзной ткани крыс в условиях регенерации.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Процесс регенерации сопровождается значительными изменениями липидных показателей раневого поля кожи крыс: грануляционно-фиброзной, рубцовой тканей, струпа, прираневых участков кожи. В грануляционно-фиброзной ткани крыс к 5 дню регенерации происходит накопление липидов, с их последующим гидролитическим расщеплением к 8 дню. Превращение данной ткани в рубцовую сопровождается увеличением количества липидов, с активацией распада фосфолипидов в струпе и прираневых участках кожи.
2. Длительное предварительное подкожное введение мелатонина вызывает отчетливые дозозависимые изменения липидов раневого поля кожи крыс: в дозе 0,3 мг/кг он препятствует, в дозе 4 мг/кг - способствует увеличению количества липидов в грануляционно-фиброзной ткани крыс на 5 день регенерации. К 8 дню преобладают реакции гидролиза липидов; к 23 дню заживления наблюдается аккумулирование липидов. Под влиянием мелатонина в дозах 0,3; 1 и 4 мг/кг в струпе крыс усиливаются процессы гидролитического расщепления липидов, в прираневых участках кожи обнаруживается накопление липидов и фосфолипидов.
3. Многодневные инъекции мелатонина ограничивают возрастания липидного и фосфолипидного компонентов в грануляционно-фиброзной ткани крыс на 5 и 8 дни регенерации.
4. Местное нанесение мелатонина на раневую область стимулирует накопление фосфолипидов в грануляционно-фиброзной ткани крыс на ранних и более поздних сроках регенерации.
Научная новизна. В работе представлены новые данные о липидном составе раневого поля кожи крыс и динамике его изменений в ходе нормального заживления кожных ран. Выявлены изменения липидных показателей грануляционно-фиброзной ткани, струпа и прираневых участков кожи на 5, 8 дни регенерации, рубцовой ткани на 23 день заживления под влиянием предварительного подкожного введения разных доз мелатонина. Проведено сравнительное изучение изменений липидных и фосфолипидных параметров грануляционно-фиброзной ткани в условиях внутрибрюшинного (однократного и многодневного) и местного применения разных доз мелатонина в процессе регенерации. Проведенные нами исследования установили участие мелатонина в регуляции уровня липидов в раневом поле кожи крыс. Выявлено неоднозначное, в ряде случаев разнонаправленное влияние мелатонина, а также дозозависимый характер действия этого гормона в отношении липидов раневого поля кожи крыс.
Теоретическое и практическое значение. Полученные данные вносят определенный вклад в понимание роли липидов в процессе заживления кожных ран. Результаты проведенных исследований дают возможность более полного понимания молекулярно-биохимических механизмов влияния мелатонина на липидный состав грануляционно-фиброзной, рубцовой тканей, струпа и прираневых участков кожи крыс, дополняют и расширяют представления о роли эпифизарного гормона в регуляции липидного обмена в исследуемых тканях в динамике регенерации. Представленные результаты открывают возможность поиска новых путей предупреждения негативных последствий применения мелатонина в восстановление повреждений кожи, выполнение ею разнообразных функций. Представленные данные необходимо учитывать при разработке рекомендаций для клинических испытаний мелатонина в практике гастроэнтерологии, дерматологии, в косметологии и других областях медицины.
Материалы работы используются на кафедре биохимии и биотехнологии ТвГУ при подготовке курсовых и дипломных работ, а также в курсах «Молекулярная патология», «Биохимия гормонов».
Апробация работы. Материалы диссертационного исследования докладывались и обсуждались на VII, VIII, XII Областной научно-технической конференции молодых ученых «Химия и химическая технология», Тверь, 2000, 2001, 2005; научной конференции аспирантов и студентов, Тверь, 2001; I Международном конгрессе «Новые медицинские технологии», СПб, 2001; Межвузовской научной конференции молодых ученых, Тверь, 2001; 5-ой, 6-ой, 7-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 го века», Пущино, 2001, 2002, 2003.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и списка литературы, включающего 201 источник, из которых 87 иностранных. Работа иллюстрирована 15 таблицами, 11 рисунками и схемами.
Морфологические характеристики грануляционно-фиброзной ткани
В настоящее время представления о течении регенерационного процесса основаны на учении о воспалении. Воспаление включает много сложных, следующих друг за другом изменений микроциркуляторного русла, свертывающей и противосвертывающей системы крови, клеточных элементов соединительной ткани, которые направлены на изоляцию и устранение повреждающего фактора, восстановление или замещение поврежденных тканей. Воспаление, обусловленное присутствием макрофагов, является необходимым звеном процесса заживления. Удаление их из раны в эксперименте тормозит развитие грануляционной ткани и приводит к формированию длительно незаживающих ран [9,82,93,107], Таким образом, фаза воспаления представляет собой важную совокупность защитных физиолого-биохимических реакций, определяющих дальнейший ход процесса заживления ран [22,91,107,111].
Существенное значение имеют изменения, наступающие в микрососудистом русле [88,107,111]. В сосудах микроциркуляции при повреждении кожи отмечают стаз эритроцитов, лимфостаз, повышенную проницаемость для лейкоцитов, эритроцитов и плазмы, спазм периферических сосудов с последующей вазодилятациеи, что в конечном итоге приводит к реактивной гиперемии и развитию воспалительного отека [76,78]. Расширение сосудистой сети в окружности раны, явления экссудации и отека, последующая лейкоцит арная-инфильтрация, клеточные реакции моноядерной фагоцитирующей системы направлены на очищение раны от продуктов травматического распада. Спустя 4-6 часов после нанесения раны развивается клеточная реакция, заключающаяся в инфильтрации травмированных тканей лейкоцитами. Первыми в ране появляются и преобладают полиморфноядерные лейкоциты, затем увеличивается содержание мононуклеарных элементов и, наконец, фибробластов [44,107].
Сущностью следующего этапа раневого процесса - фазы пролиферации-является заполнение раневого дефекта регенератом и его эпителизация, которому предшествует гибель клеток и лизис некротизированных тканей. Пролиферативная функция соединительной ткани тесно связана с воспалением и наличием фибробластов, что являет собой начало истинно репаративных процессов. Восстановление соединительной ткани, образование грануляционно-фиброзной ткани играет ведущую роль в процессе заживления раны, обеспечивая ликвидацию патологических, посттравматических последствий структурного и функционального характера [144,183].
Грануляционно-фиброзная ткань начинает формироваться по краям раны в период ее очищения на 3-5 день после травмы (незрелая ГФ ткань) [98]. В этот период отмечена высокая ферментативная активность, связанная с интенсивно протекающими биосинтетическими процессами в фибробластах, активно включающих Н 3-тимидин, что свидетельствует о повышении синтеза ДНК, РНК и неколлагеновых белков. Происходит накопление несульфатированных мукополисахаридов (гиалуроновая кислота) [67,75]. Грануляционно-фиброзная ткань характеризуется полиморфизмом клеточных элементов крови и отдельных элементов соединительной ткани, интенсивным образованием капилляров, которые снизу врастают в формирующуюся ткань и на поверхности образуют петли. Сосуды грануляционной ткани являются не только транспортной системой, но и источником «строительного материала» для процессов организации и заживления раневого дефекта [108]. Отмечают значительное стимулирующее воздействие фибробластов на пролиферацию и адгезию кератиноцитов [20]. Увеличение количества фибробластов в ране происходит как благодаря их высокой митотической активности, так и в результате развития их из мигрирующих от сосудов субэндотелиальных и адвентициальных клеток.
С накоплением мукополисахаридов в основном веществе грануляционной ткани совпадает начало дифференцировки фибробластов на 7-10 день заживления (зрелая ГФ ткань). Этот период характеризуется максимальным содержанием фибробластов в ране, которые способны синтезировать липиды (помимо нейтральных липидов, образуются фосфолипиды, холестерин), углеводы, протеины, главным образом, коллаген [83]. На данном этапе регенерации максимальны тучные клетки, содержащие РНК, липиды, липазы, кислую и щелочную фосфатазы и характеризующиеся низким уровнем белкового синтеза. Однако, накопление образующихся в них белковых веществ, обеспечивает пластические процессы в клетке [67,75]. Выраженные структурные и биохимические изменения в фибробластах происходят в период завершения пролиферативной фазы заживления (15-20 день после травмы) [68,69,76].
Согласно современным представлениям, параллельно с формированием коллагеновых волокон происходит частичное их разрушение, в результате чего обеспечивается более тонкая регуляция процесса новообразования грануляционно-фиброзной ткани. Отсюда следует вывод о том, что фибробласты выступают в роли клеток как продуцирующих коллаген, так и одновременно разрушающих его. Такую особенность фибробластов рассматривают как клеточную основу постоянно протекающей перестройки соединительной ткани [165].
Изучение влияния мелатонина на липиды раневого поля кожи крыс
Кожа рассматривается многими исследователями как типичный орган-мишень для эпифизарного гормона, обладающий значительным количеством мелатониновых рецепторов [187], при этом и сама кожа способна синтезировать мелатонин [186].
Описано применение мелатонина в лечении некоторых дерматозов (атопической экземы, псориаза, злокачественной меланомы и др.) и катаракты. Протектирующий эффект МТ связывают с его способностью нейтрализовать активность свободных радикалов и (или) продукцию глутатиона. Отмечено, что как у здоровых людей, так и у больных склеродермой мелатонин в больших дозах значительно ингибирует пролиферацию фибробластов (более, чем на 80 %), причем данный процесс является дозозависимым [135,176].
По мнению ряда исследователей, мелатонин влияет на репаративные процессы через свои антиоксидантные свойства. Свободно-радикальное окисление, в частности, перекисное окисление липидов, входит в число процессов, возникающих в тканях при повреждении на этапе воспаления. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что некоторый сдвиг окислительно-восстановительного процесса в сторону усиления процессов окисления оказывает стимулирующее влияние на протеинкиназу С печени и пролиферацию фибробластов кожи человека [84,87].
Эффект гормона в значительной степени зависит от его дозы: мелатонин в концентрации 6 мкг/мл в среде дермальных фибробластов стимулирует их дифференцировку, в то время как в дозе 100-400 мкг/мл снижает степень пролиферации фибробластов более чем на 80 % [122].
В ряде работ отмечен ингибирующий эффект мелатонина на процессы заживления ран, что связано со снижением в тканях содержания коллагена и внеклеточных матриксных белков [145]. Так, по данным J. Drobnik (1993, 1995), инъекции высоких доз мелатонина (300 мг/кг веса) крысам замедляли сокращение раневой поверхности и увеличивали сроки заживления рак. Кроме того, длительное пребывание в темноте также оказывало тормозящий эффект на заживление полнослойных хирургических ран у животных [130]. Была обнаружена корреляция между скоростью заживления полнослойных хирургических ран кожи и синтезом и накоплением в них коллагена. По мнению некоторых авторов любые нарушения синтеза и накопления коллагена в грануляционной ткани могут быть причиной нарушения течения в ней репаративных процессов [130].
Местное применение мелатонина также оказывает выраженное тормозящее действие на заживление кожных ран. Полагают, что замедление репаративных процессов под действием гормона связано с изменением спектра водорастворимых белков, фракционного состава гликозаминогликанов и липидов в ГФ ткани крыс [50]. В настоящее время недостаточен объем сведений, необходимый для полного раскрытия механизмов влияния мелатонина на развитие грануляционной ткани при раневом процессе. Высказано предположение о существовании, по крайней мере, двух возможных механизмов. Согласно первому из них [131,145,146], мелатонин непосредственно влияет на пролиферацию клеток в ране и метаболизм коллагена. Второй механизм связан с непрямым действием гормона на репаративные процессы в ране через эндокринную и/или иммунную системы [130,183]. Некоторые авторы придерживаются точки зрения, согласно которой при воздействии мелатонина на грануляционно-фиброзную ткань происходит реализация отрицательной обратной связи между эпифизом и щитовидной железой [153]. Анализ литературных данных позволяет также предположить, что влияние мелатонина на репаративные процессы может быть связано и с антиоксидантными свойствами гормона. Как известно, свободно-радикальное окисление и, в частности, ПОЛ, входит в число процессов, возникающих в тканях при повреждении на этапе воспаления. Было высказано мнение, что свободно-радикальные процессы могут приводить к изменению внутриклеточного окислительно-восстановительного баланса, сдвигая его в сторону окисления. Этот феномен был назван «окислительным стрессом». В то же время опубликованы экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что умеренный сдвиг окислительно-восстановительного баланса в сторону окисления оказывает стимулирующее влияние на протеинкиназу С печени и пролиферацию фибробластов кожи человека. Конечные продукты ПОЛ, которые накапливаются в тканях в определенных количествах, участвуют в регуляции активности некоторых ферментов и проявляют хемотоксическое действие, а также усиливают процессы транскрипции и увеличивающие тем самым синтез коллагена [170,171]. В то же время, антиоксиданты влияют на окислительно-восстановительное равновесие в клетках и тканях, сдвигая его в сторону восстановленных форм. Подавляя процесс ПОЛ и снижая уровень его промежуточных и конечных продуктов, они препятствуют процессам коллагенообразования. Так, например, в экспериментах, проведенных in vivo, было показано, что внесение антиоксидантов может в значительной степени подавлять «сверхэксперессию» м-РНК проколлагена oti [168]. Литературные данные [176] свидетельствуют, что МТ влияет на активность ряда ферментов, увеличивающих степень антиоксидантной защиты организма. К числу этих ферментов относятся супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, нитрооксидсинтетаза. Приведенные данные свидетельствуют о способности мелатонина активно вмешиваться в протекание различных биохимических процессов в покровной ткани. Однако злияние экзогенногого гормона на обменные процессы, в особенности липидного компонента грануляционно-фиброзной ткани крыс, остаются пока мало исследованными и требуют дальнейшего изучения.
Влияние подкожного введения мелатонина на липидные показатели грануляционно-фиброзной, рубцовой тканей, струпа и прираневых участков кожи крыс в процессе регенерации
В прираневых участках кожи крыс на ранних сроках регенерации уровень ОЛ соответствовал 1932 мг% и существенно не менялся в процессе регенерации (табл. 4). Преобладающими фракциями на 5 день регенерации явились ТГ, ЭХ, ФЛ, которые составили 851, 397 и 282 мг%» соответственно. К 8 дню регенерации обнаружено снижение до 59 и 41 % соответственно количества ФЛ, ЭХ и увеличение в 2,9 раза ДГ. При сравнении 8 дня регенерации с интактной кожей выявлено уменьшение (в 1,5 и 2,2 раза соответственно) уровня ФЛ, ЭХ, возрастание (в 3,4 и 1,3 раза соответственно) ТГ и ДГ (рис. 6 А).
В коже интактных животных содержание суммарных фосфолипидов (см. табл. 5) соответствовало 315 мг%. Преобладающими фракциями были ФХ (110 мг%о), ФИ+ФС (70,3 мг%о), ФЭА (44,3 мг% ), наименьшее количество приходилось на ГЛФ - 12,3 мг% (рис. 6 Б).
В ГФ ткани крыс на ранних сроках регенерации количество ОФЛ не превышало 250 мг%). Наибольшее содержание было отмечено у холинсодержащих фракций - ФХ и СФМ (122,3 и 40,1 мг% соответственно), наименьшее - у ЛФЛ (8,1 мг% ). К 8 дню регенерации по сравнению с 5 днем уровень ОФЛ незначительно снизился и стал составлять 234 мг%. Среди фракций выявлено накопление ФИ+ФС, ФЭА, ЛФЛ и снижение до 59,9 и 24,6 % соответственно ФХ, ГЛФ. К 23 дню исследований количество ОФЛ недостоверно увеличилось до 270,1 мг%. В сравнении с 8 днем регенерации выявлено возрастание в 2; 1,4 и 4,3 раза соответственно уровня ФИ+ФС, ФЭА, ФК+ПГФ, снижение до 37,8; 24,9 и 26,2 % соответственно ФХ, СФМ, ЛФЛ. В сравнении с интактной кожей отмечено увеличение в 1,5 и 3,4 раза соответственно количества ФЭА, ФК+ПГФ, уменьшение до 24,9; 25,2; 65,3 и 24,1 % соответственно уровня СФМ, ФХ, а также продуктов деградации фосфолипидов - ГЛФ и ЛФЛ (рис. 6 Б).
В струпе крыс содержание ОФЛ на 5 день регенерации составило 391 мг% и практически не менялось в процессе регенерации (385,1 мг%) (табл. 5). На ранних сроках регенерации преобладающими фракциями были ФЭА, ФХ, ФИ+ФС (141, 78,4 и 68,3 мг% соответственно). К 8 дню регенерации обнаружено возрастание в 2,4 и 1,6 раза соответственно уровня ЛФЛ, ФК+ПГФ, уменьшение в 2,5; 2,9 и 1,5 раза соответственно СФМ, ФХ, ГЛФ (рис. 6 Б).
В прираневых участках кожи крыс количество суммарных фосфолипидов на ранних этапах регенерации соответствовало 301,2 мг%. При этом наибольшее содержание приходилось на ФХ (113,2 мг%), ФИ+ФС (67 мг%), наименьшее - на долю ГЛФ и ЛФЛ. К 8 дню регенерации в сравнении с предыдущим сроком (5 день), а также с интактной кожей отмечено снижение (в 1,6-1,7 раза) содержания ОФЛ и большинства фосфолипидных фракций -СФМ, ФХ, ФИ+ФС, ФЭА (рис. 6 Б).
Как следует из приведенных данных, в ГФ, рубцовой тканях, прираневых участках кожи и в струпе крыс в процессе регенерации выявлены значительные перестройки липидного и фосфолипидного состава, характер которых зависел от исследуемых тканей крыс. Так, в ГФ ткани к 8 дню регенерации обнаружено снижение содержания ОЛ и большинства липидных фракций при разнонаправленном изменении ФЛ фракций. К 23 дню наблюдений -накопление СЖК, ЭХ, ДГ, ФИ+ФС, ФЭА, ФК+ПГФ и уменьшение холинсодержащих фракций, а также лизофосфолипидов. В струпе и в прираневых участках кожи крыс отмечено снижение большинства липидных и фосфолипидных фракций.Влияние подкожного введения мелатонина на липидные показатели грануляционно-фиброзной, рубцовой ткани, струпа и прираневых участков кожи крыс в процессе регенерации
Из данных табл. 6 видно, что в ГФ ткани крыс контрольной группы животных на ранних сроках регенерации содержание ОЛ составило 3208 мг%. Из рис. 7 А следует, что наибольшее количество было обнаружено у фракций ТГ (1376 мг%), СЖК (683 мг%), X (385 мг%), наименьшее приходилось ДГ (141 мг%). К 8 дню регенерации уровень суммарных липидов незначительно снизился и составил 2626 мг% при параллельном накоплении ДГ, уменьшении до 73,8; 76,1 и 52,5 % соответственно ТГ, СЖК, X. К 23 дню эксперимента количество ОЛ не превышало 2160 мг%. В сравнении с 8 днем регенерации следует отметить достоверное снижение до 66,3; 70,3; 77,8 и 59,8 % соответственно СЖК, X, ДГ, ЭХ. В то же время по отношению к интактной коже в рубцовой ткани увеличился в 1,3; 1,8 и 3,9 раза соответственно уровень ТГ, СЖК, ДГ, снизились в 1,4 раза ЭХ.
Длительное подкожное введение МТ в сравнительно низкой дозе 0,3 мг/кг в ГФ ткани крыс на ранних сроках регенерации приводило к снижению содержания суммарных липидов до 2261 мг%, а также большинства липидных фракций: ТГ, СЖК, X, ФЛ по сравнению с контрольными животными в такой же период регенерации (табл. 6, рис. 7 А). К 8 дню регенерации обнаружено, что количество ОЛ и всех липидных фракций (ТГ, СЖК, X, ФЛ, ДГ, ЭХ) было ниже контрольных показателей. Вместе с тем, в процессе регенерации в условиях применения МТ в указанной дозе отмечено снижение 1,9 раза ОЛ и в 1,9; 2,6; 2,1; 2,1 и 2,2 раза соответственно большинства липидных фракций: ТГ, СЖК, X, ДГ, ЭХ. В то же время, к 23 дню исследований обнаружено более высокое содержание суммарных липидов и ряда их фракций (СЖК, ФЛ, ДГ) по сравнению с контрольными значениями и более высокое количество ОЛ и таких фракций как СЖК, X, ФЛ, ДГ.
Характеристика изменений липидных показателей раневого поля крыс при нормальном заживлении кожных ран
На ранних сроках регенерации грануляционно-фиброзная ткань крыс богата липидами (табл. 4). Преобладающей фракцией в молодой грануляционно-фиброзной ткани являются триглицериды, на долю которых приходится более 70 % суммы ОЛ (рис. 6 А). Высокое содержание липидов отмечено также в работе Ким Рен Хва (2000). При гистологическом исследовании липиды обнаруживаются в виде крупных и мелких капелек жира, разбросанных по всей толще в грануляционно-фиброзной ткани [50]. Биологический смысл накопления липидов, вероятно, состоит в создании депо материала, который может служить источником энергии для роста и деления клеток, синтеза элементов внеклеточного матрикса [37].
К более поздним срокам регенерации (8 день) выявлено двукратное снижение уровня ОЛ, в основном за счет триглицеридов и свободных жирных кислот. Данный факт, вероятно, связан с завершением формирования грануляционно-фиброзной ткани и началом ее созревания [20,22,108]. В период с 5 по 8 день регенерации основными процессами, протекающими в исследуемой ткани, по-видимому, являются: 1) ограничение притока из крови различных веществ, в том числе и липидов, 2) гидролитическое расщепление части липидов на энергетические и пластические процессы, в том числе, на синтез белка [75].
К 23 дню эксперимента содержание ОЛ практически не меняется по сравнению с предыдущим сроком, но увеличивается количество СЖК, ДГ, ЭХ. Исследования ряда авторов показали, что рубцовая ткань крыс по целому ряду морфологических [20,98] и биохимических параметров отличается от интактной кожи [22,88,98]. Достаточно высокий уровень ОЛ, а также СЖК, ТГ, X, ДГ в рубцовой ткан;; в отличие от интактной кожи, вероятно, объясняется их участием в процессах, направленных на восстановление утраченных дериватов кожи (желез и шерсти) [40,75,98].
Следует отметить, что по мере развития грануляционно-фиброзной и рубцовой ткани количество суммарных фосфолипидов в них остается постоянным (табл. 5). Однако при этом наблюдается перераспределение фосфолипидных фракций, в частности изменяется соотношение ФХ/ФЭА (рис. 6 Б). Этот факт, по-видимому, может объясняться реализацией различных перестроек метаболизма клеток грануляционно-фиброзной ткани, что влечет за собой изменение физико-химических свойств ее клеточных мембран [85]. К 23 дню регенерации содержание СФМ, ФХ, ЛФЛ было ниже, а количество ФЭА, ФК+ПГФ - выше, как по сравнению с 8 днем регенерации, так и с интактной кожей. Одним из возможных объяснений снижения количества ФХ следует считать использование их для образования ФЭА, ФК+ПГФ.
Содержание ОЛ в струпе крыс невелико и проявляет тенденцию к снижению в процессе регенерации (табл. 4). Главной особенностью фракционного состава струпа является малая доля (всего 12-14 % от суммы ОЛ) триглицеридов, причем их количество в ходе заживления достоверно снижается, также как и содержание большинства липидных фракций (рис. 6 А). Можно предполагать, что отмеченное снижение количества липидов в струпе является составной частью протекающих в нем процессов некроза и фиброзного превращения [18,98].
Обращает на себя внимание постоянство в ходе регенерации уровня суммарных фосфолипидов (табл. 5), содержание которых в струпе крыс заметно выше, чем в грануляционно-фиброзной ткани и интактной коже. Вместе с тем, регенерация сопровождается серьезными изменениями количества отдельных фосфолипидных фракций (рис. 6 Б). Резко снижается доля холинсодержащих молекул - ФХ и СФМ, что может быть следствием активации различных фосфолипаз. В результате подобных превращений соотношение ФХ/ФЭА оказывается много меньше единицы: 0,56 и 0,18 на 5 и 8 день соответственно. Значительное изменение уровня основных мембранных фракций, а также накопление мощного детергента -лизофосфолипидов может свидетельствовать о глубоких нарушениях структуры и функций биологических мембран клеток струпа.
В прираневых участках кожи крыс количество ОЛ (табл. 4) на 5 и 8 дни регенерации, а также содержание большинства липидных фракций (рис. 6 А) на 5 день не отличается от показателей интактной кожи, однако на 8 день эксперимента выявлен более низкий уровень ЭХ и более высокий - ДГ, ТГ. К этому сроку отмечается также достоверное снижение количества суммарных ФЛ (табл. 5) и таких фракций как СФМ, ФХ, ФИ+ФС, ФЭА (рис. 6 Б) по сравнению с предыдущим сроком и интактной кожей. Можно предполагать, что в этот период происходит активация гидролитического распада фосфолипидов при участии фосфолипазы С с образованием ДГ и далее ТГ. Вероятным донором жирных кислот могут являться эфиры холестерина. Наши данные подтверждают существующее в литературе мнение об участии прираневых участков кожи в процессе регенерации ран [88].
Полученные результаты свидетельствуют о сложной динамике липидных превращений в грануляционно-фиброзной ткани в ходе регенерации. На ранних этапах заживления (5 день) в грануляционно-фиброзной ткани происходит аккумулирование липидов, синтезированных в ней или привнесенных кровью, для обеспечения разнообразных пластических процессов. На более поздних этапах регенерации (8 день), характеризующихся снижением большинства липидных показателей, не исключены гидролитические реакции. К 23 дню процесс регенерации завершается и формируется рубец, который отличается от интактной кожи по содержанию многих липидных и фосфолипидных фракций. В струпе и в прираневых участках кожи регенерация сопровождается значительными изменениями липидного состава.
