Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 13
1.1 Общая характеристика токсического воздействия свинца 13
1.2 Действие свинца на нервную систему 15
1.3 Пути реализации нейротоксического действия свинца 16
1.4 Активация свинцом окислительных процессов в нервной ткани 18
1.5 Изменение работы ферментов в нервной ткани под влиянием свинца 20
1.6 Развитие нервной системы, нейритный рост и свинец 23
1.6.1 Нейритный рост 24
1.6.2 Нарушение нейритного роста под воздействием свинца 28
1.7 Глутатионовая система и свинец 30
1.7.1 Биологическая роль глутатиона 31
1.7.2 Содержание, распределение и метаболизм глутатиона в мозге 34
1.7.3 Ферменты глутатионовой системы 36
1.7.4 Защитная роль АТС при свинцовой интоксикации 38
1.8 Роль глутамата в мозге в условиях нормы и патологии 41
1.8.1 Физиологическая роль глутамата 41
1.8.2 Патогенетическая роль глутамата 43
1.8.3 Нарушение функций глутамата под воздействием свинца 47
1.9 Предупреждение последствий свинцовой интоксикации 49
1.10 Коменовая кислота 53
1.11 Заключение по обзору литературы 54
2. Методика исследования 56
2.1 Содержание и кормление животных 56
2.2 Схемы экспериментов 56
2.3 Культура ткани 59
2.3.1 Культивирование спинальных ганглиев 59
2.3.2 Культивирование клеток-зерен мозжечка 59
2.4 Методика экспериментов in vitro 60
2.4.1 Воздействие ацетатом свинца на спинальные ганглии 60
2.4.2 Воздействие глутаматом на клетки-зерна мозжечка 60
2.5 Биохимический анализ 61
2.5.1 Определение малонового диальдегида 61
2.5.2 Определение концентрации общего глутатиона, GSH и GSSG 63
2.5.3 Определение активности глутатионредуктазы 66
2.5.4 Определение активности глутатионпероксидазы 68
2.5.5 Определение свободных радикалов 70
2.6 Количественный анализ результатов 71
2.6.1 Оценка ростовых процессов в культуре спинальных ганглиев 71
2.6.2 Оценка выживаемости нейронов после воздействия глутамата 72
2.6.3 Оценка результатов биохимических и хемилюминесцентных . исследований 73
3 Результаты собственных исследований 74
3.1 Пренатальное воздействие АС на оксидантный статус и АГС ткани головного мозга новорожденных крыс 74
3.2 Влияние свинцовой интоксикации на нейритный рост в культуре спинальных ганглиев новорожденных крыс 78
3.2.1 Изменение нейритного роста после пренатального воздействия АС 78
3.2.2 Изменение нейритного роста при прямом воздействии АС на спинальные ганглии in vitro 85
3.3 Действие КК на оксидантный статус и состояние АГС ткани мозга при свинцовой интоксикации 87
3.4 Нейропротекторный эффект КК при цитотоксическом действии глутамата в культуре клеток мозжечка 92
3.4.1 Нейропротекторный эффект КК в культуре клеток мозжечка 7-9-дневных крыс, не подвергавшихся действию АС 92
3.4.2 Нейропротекторный эффект КК в культуре клеток мозжечка 7-9-дневных крыс, подвергавшихся действию АС пренатально и в лактационный период...95
4 Обсуждение полученных результатов 98
4.1 Индукция свинцом окислительного стресса в ткани развивающегося головного мозга 98
4.2 Нарушение нейритного роста при воздействии AC in vivo и in vitro 100
4.3 Нормализация КК оксидантного статуса и состояния АТС в развивающемся мозге крыс при свинцовой интоксикации 104
4.4 Цитотоксическое действие глутамата in vitro на фоне свинцовой интоксикации и нейропротекторный эффект КК 105
4.5 Возможность использования КК для защиты развивающегося мозга от последствий свинцовой интоксикации 108
Заключение 113
Выводы 115
Список использованных источников 117
- Активация свинцом окислительных процессов в нервной ткани
- Предупреждение последствий свинцовой интоксикации
- Пренатальное воздействие АС на оксидантный статус и АГС ткани головного мозга новорожденных крыс
- Нарушение нейритного роста при воздействии AC in vivo и in vitro
Введение к работе
Актуальность проблемы. Пагубное воздействие свинца на организм человека в настоящее время является глобальной экологической проблемой, которой уделяется большое внимание, в том числе на государственном уровне [Розанов, 2000]. Свинец является тяжёлым металлом и относится к токсикантам I класса опасности [ГОСТ 17.4.1.02-83]. Токсическое действие соединений свинца является причиной развития патологических состояний всех без исключения органов и систем организма. Нервная система, как центральная, так и периферическая, одной из первых страдает при свинцовой интоксикации. Особенно опасно воздействие свинца в период её формирования и развития, что приводит к нарушениям внимания, памяти, когнитивных функций у детей школьного возраста. При этом малые дозы свинца, под действие которых попадет огромное число людей, не менее опасны, чем острые отравления [Переслегина и Загоскин, 2006; Toscano and Guilarte, 2005; Bellinger, 2008].
Несмотря на то, что исследования, направленные на изучение механизмов токсического влияния свинца, ведутся уже более ста лет, до настоящего времени многое остаётся неясным и требует детального исследования. Свинец обладает широким спектром патологического действия на ЦНС, нарушая формирование структур мозга [Рыжавский и др., 2000], а также нейромедиаторную систему, которая играют ключевую роль в модуляции эмоционального ответа, памяти и обучения [Finkelstein Y. et al., 1998]. Одним из основных последствий свинцовой интоксикации является развитие оксидативного стресса в нервной ткани, что проявляется в снижении уровня ее антиоксидантной защиты и активации окислительных процессов [Adonaylo and Oteiza, 1999b; Wang et al., 2006].
Поиск средств защиты организма от свинцовой интоксикации ведётся во многих странах. Важной задачей является предупреждение последствий длительного воздействия малых доз свинца, поскольку ему подвергается огромное количество людей. Наиболее уязвимыми являются дети, чья развивающаяся нервная система в наибольшей степени подвергается токсическому действию свинца, тогда как организм взрослого человека обладает сформировавшимися защитными механизмами [Переслегина и Загоскин, 2006; Bellinger, 2004]. Накапливаясь годами в организме, свинец может высвобождаться из костного депо во время беременности и способен проникать в организм развивающегося плода через плаценту, а после родов продолжает поступать с грудным молоком. Таким образом, свинцовая интоксикация оказывает свой эффект уже на самых ранних стадиях развития ребенка. Кроме того, воздействие свинца, которому беременная женщина подвергалась на протяжении жизни, в том числе и в детстве, может иметь пагубные последствия для ее детей [White et al., 2007; Переслегина и Загоскин, 2006].
В связи с этим актуальным является выяснение последствий свинцовой интоксикации нервной ткани в пренатальный и ранний послеродовой периоды, а также возможности её эффективной защиты от воздействия свинца. Одним из нейропротекторных соединений нами была выбрана коменовая кислота, обладающая высокой антиоксидантной активностью. Коменовая кислота (КК) является основным физиологически активным компонентом лекарственного препарата Бализ-2, который в течение многих лет с успехом используется в медицинской практике как антиоксидантное, противовоспалительное и репаративное средство для лечения язв желудочно-кишечного тракта, ран и ожогов [Шурыгин, 2002]. Коррекция токсического воздействия свинца на развивающуюся нервную систему в эксперименте с помощью КК может послужить основанием для проведения углубленных доклинических и клинических испытаний с целью дальнейшего практического использования препаратов на её основе по новому назначению.
Целью работы являлось исследование влияния свинца в пренатальный и ранний послеродовой периоды на оксидантный статус и ростовые процессы в развивающейся нервной ткани крыс, а также изучение возможности использования КК для фармакологической коррекции нарушений, вызываемых свинцовой интоксикацией.
В задачи работы входило исследование: состояния оксидантного статуса и антиоксидантной глутатионовой системы в ткани головного мозга крыс после их интоксикации свинцом в пренатальный и лактационный периоды; влияния свинца на ростовые процессы в культуре спинномозговых ганглиев новорожденных крыс;
3) толерантности культивируемых нейронов мозжечка крыс, подвергнутых интоксикации свинцом пренатально и в период лактации, к цитотоксическому действию глутамата;
4) возможности использования коменовой кислоты для коррекции нарушений механизмов антиоксидантной защиты, вызываемых свинцом, в ткани развивающейся нервной системы крыс.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование показателей оксидантного статуса и активности антиоксидантной глутатионовой системы (АГС) в ткани головного мозга новорожденных крыс после пренатального токсического воздействия свинца во время беременности и лактации. Показано, что хроническая интоксикация малыми дозами свинца или его однократное введение в более высокой дозе отрицательно сказывается на состоянии систем антиоксидантной защиты в мозге потомства.
Получены новые данные, свидетельствующие о том, что свинец нарушает рост отростков спинномозговых ганглиев (СМГ) in vitro, а при хроническом воздействии в малых дозах во время беременности может накапливаться в ткани периферической нервной системы потомства, обнаруживая свой цитотоксический эффект при ее последующем культивировании. Установлено, что характер нарушения нейритного роста СМГ зависит от дозы свинца и может проявляться как в стимуляции, так и в угнетении ростовых процессов.
Впервые показано, что свинцовая интоксикация в период беременности и лактации вызывает снижение устойчивости культивируемых нейронов мозжечка потомства к цитотоксическому действию глутамата.
Обнаружено, что применение КК во время свинцовой интоксикации в пренатальныи и лактационный периоды препятствует нарушениям окидантного статуса и АГС в ткани мозга потомства. В экспериментах in vitro впервые показано, что нейроцитотоксический эффект глутамата в культуре клеток мозжечка крыс как после их пренатальной свинцовой интоксикации, так и в ее отсутствие, под влиянием КК снижается.
Научно-практическая значимость. Полученные данные исследования систем антиоксидантной защиты в ткани мозга после его пренатальной интоксикации свинцом дополняют результаты опубликованных ранее работ, показавшие прооксидантный и нейротоксический эффект свинца, вводимого во время беременности, на ряд структур головного мозга потомства и, таким образом, расширяют представления о механизмах токсического действия свинца на развивающуюся нервную систему.
Данные о нейропротекторном эффекте КК in vivo и in vitro служат экспериментальным обоснованием проведения доклинических и клинических испытаний препаратов на ее основе, в том числе, препарата Бализ-2, для изучения возможности их использования с целью предотвращения отрицательного воздействия свинца на нервную систему в период эмбриогенеза и лактации.
Основные положения, выносимые на защиту: 1. Окислительные процессы в ткани головного мозга потомства крыс после пренатальной интоксикации свинцом усиливаются, а механизмы антиоксидантной защиты подавляются.
В культуре спинномозговых ганглиев новорожденных крыс после их внутриутробной интоксикации свинцом происходит нарушение нейритного роста.
Оксидантный статус и состояние антиоксидантной глутатионовой системы в ткани головного мозга крыс, подвергнутых пренатально и во время лактации интоксикации свинцом, под влиянием коменовой кислоты нормализуются.
Толерантность культивируемых нейронов мозжечка крыс к цитотоксическому действию глутамата после их интоксикации свинцом в пренатальный и ранний постнатальный периоды снижается.
Коменовая кислота повышает толерантность культивируемых нейронов мозжечка крыс, подвергнутых во внутриутробный и лактационный периоды свинцовой интоксикации, к цитотоксичности глутамата.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на международной научно-практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (Санкт-Петербург, 2007 г.), 4-й региональной научно-практической конференции «Новые технологии в рекреации здоровья населения» (Владикавказ, 2007 г.), Международной научной конференции «Перспективы развития вузовской науки» (Дагомыс, Сочи, 2007 г.), Международном конгрессе ветеринарных фармакологов «Эффективные и безопасные лекарственные средства» (С.-Петербург, 2008 г.), III Международной научной конференции «Традиционная медицина: современное состояние и перспективы развития» (Улан-Удэ, 2008 г.), Конференции получателей грантов регионального конкурса Российского фонда фундаментальных исследований и администрации Краснодарского края: «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики» (Краснодар, 2008 г.), заседании Совета отдела биологически активных веществ Кубанского государственного университета (Краснодар, 2010 г.).
Публикации по теме диссертации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 8 статей, из них 2 в журналах, рецензируемых ВАК. Подана заявка на получение патента.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение, заключение и выводы. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 24 рисунками. Указатель литературы включает 46 отечественных и 295 иностранных публикаций.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты №№ 06-04-96773-р_юг_а; 08-04-99067-р_офи).
Активация свинцом окислительных процессов в нервной ткани
Механизмы, по которым свинец индуцирует оксидативный стресс, до сих пор не вполне ясны. Наблюдения показывают, что задействованными могут быть многие механизмы. Любое вещество или воздействие, обусловливающее окислительный стресс, действует через ускорение прооксидантных компонентов или снижение антиоксидантной защиты клеток, либо индуцирует оба эти процесса [Gurer and Erical, 2000].
Ионы металлов с переменной валентностью могут выступать в качестве факторов разветвления цепей свободнорадикального окисления и, следовательно, общего усиления ПОЛ [Зозуля и др., 2000]. Как металл с переменной валентностью и донор электронов, свинец способствует окислительному повреждению липидов, белков и нуклеиновых кислот [Ralston and O Halloran, 1990]. Экспериментально показано, что свинец при совместной инкубации повышает переокисление ненасыщенных жирных кислот, причём тем сильнее, чем больше в молекуле кислоты двойных связей между атомами углерода [Yiin and Lin, 1994].
Являясь нормальным физиологическим процессом, ПОЛ при гиперактивации может приводить к серьёзным последствиям, прежде всего к дестабилизации и нарушению барьерной функции биологических мембран [Берберова, 2000]. Нервная ткань вследствие высокого содержания липидов более уязвима к атакам АФК, чем многие другие органы и ткани. Содержащиеся в мембранах полиненасыщенные жирные кислоты в первую очередь подвергаются воздействию кислородных радикалов [Halliwell and Gutteridge, 1989; Зозуля и др., 2000; Владимиров, 2000; Владимиров и Арчаков, 1972]. ПОЛ сопровождается окислением тиоловых (сульфгидрильных) групп мембранных белков, что может приводить к неферментативной реакции SH-групп со свободными радикалами липидов. При этом образуются сульфгидрильные радикалы, которые затем взаимодействуют с образованием дисульфидов [Владимиров, 2000].
В экспериментах на животных показана прямая зависимость между содержанием свинца и уровнем ПОЛ в различных отделах мозга при свинцовой интоксикации [Shafiq-ur-Rehman, 1984; Villeda-Hernandez et al., 2001; Bokara et al., 2008], а также снижение содержания тиолов [Gallegos et al., 2001] и повышение содержания дисульфидов при свинцовой интоксикации [Gurer and Ercal, 2000].
Свинец связывается с тиоловыми группами, что приводит к снижению уровня восстановленного глутатиона и связанной с ним антиокислительной активности [Gurer and Ercal, 2000].
Другим механизмом, благодаря которому свинец индуцирует оксидативный стресс, может быть ингибирование им фермента 8-аминолевулинат-дегидратазы, что приводит к накоплению 8-аминолевулиновой кислоты, которая может быстро окисляться, генерируя Ог , ОН, и Н2Ог [Bechara, 1996]. Вызывая изменение физических свойств мембран; свинец может усиливать их переокисление под воздействием железа [Aruoma et al. 1989; Adonaylo and Oteiza, 1999a]. Свинец взаимодействует с отрицательно заряженными фосфолипидами мембран, что вызывает изменение их физических свойств и облегчает окисление фосфолипидов [Adonaylo and Oteiza, 1999а]. Кроме того, свинец может увеличивать окислительную способность АФК [Adonaylo and Oteiza, 1999b]. Он формирует комплекс Pb2+- 02 , который обладает боле высокой, по сравнению с Ог , окислительной способностью [Adonaylo and Oteiza, 1999а].
Большое внимание, особенно в последнее десятилетие, уделяется изучению влияния малых доз свинца на нервную систему в период развития [Toscano and Guilarte, 2005]. Исследования, проведённые на крысах, показали, что воздействие свинца в период беременности и лактации вызывает нарушение антиоксидантной защиты в головном мозге потомства. В работе Bokara К.К. et al. [2008] сообщается о значительном угнетении активности супероксиддисмутазы (СОД), каталазы и увеличении уровня ПОЛ в ряде мозговых структур потомства, чьи матери подвергались воздействию ацетата свинца при беременности и лактации. Изменения были наиболее значительными в первые недели после рождения, но не отмечались в возрасте 40 дней. Mareira E.G. et al. [2001] сообщает об угнетении активности СОД в гипоталамусе 23-дневного потомства крыс от самок, подвергшихся действию малых доз ацетата свинца в период беременности и лактации. В более позднем возрасте потомства (70 дней) изменения отсутствовали. На основании полученных результатов Mareira E.G. et al. [2001] предположили, что нарушение антиокислительной функции не может являться главным механизмом токсического действия малых доза свинца.
Накопленные к настоящему времени экспериментальные данные убедительно свидетельствуют о том, что под воздействием свинца в нервной ткани происходит активация окислительных процессов. И хотя её механизмы окончательно не установлены, совершенно ясно, что нарушение окислительно-восстановительного равновесия является одним из важных аспектов токсического действия свинца.
Как прооксидант, свинец затрагивает ферментные системы, участвующие в регуляции проокислительно-антиокислительного равновесия в тканях. Снижение активности таких антиоксидантных ферментов как СОД, каталаза и глутатионпероксидаза после воздействия свинца прямо коррелирует с повышением уровня ПОЛ и содержанием свинца в мозге [Sandhir et al., 1994]. СОД играет важную роль в защите клеток от токсического действия Ог-, катализируя реакции дисмутации [Halliwell and Chirico, 1991] Аналогичные исследования отдельных структур мозга, показали, что свинец вызывает снижение активности СОД и каталазы в мозжечке, стриатуме, гиппокампе и новой коре [Shukla et al., 2003; Wang et al., 2006; Yin et al., 2008; Bennet et al., 2007].
Во многих исследованиях установлено, что при свинцовой интоксикации нарушается работа ферментов антиоксидантной глутатионовой системы [Wang and Ballatory, 1998; Adonaylo and Oteiza, 1999b], в том числе через влияние на транскрипцию этих ферментов, [Korashy and El-Kadi, 2006], которые, как известно, играют крайне важную роль в поддержании редокс-статуса клеток [Meister and Tate, 1976; Meister and Anderson, 1983; Зозуля и др., 2000].
Свинец имеет высокое сродство к сульфгидрильным (SH) группам, вследствие чего связывается с SH-группами цистеина и понижает стабильность комплекса с другими аминокислотами в цепочке. Свинец показал себя как ингибитор нескольких ферментов, имеющих функциональные SH-группы [Vallee et al., 1972]. Дегидратаза 5-аминолевулиновой кислоты является наиболее известным ферментом, работа которого нарушается свинцом посредством данного механизма [Bernard and Lauwerys, 1987].
Предупреждение последствий свинцовой интоксикации
Большинство исследователей сходятся во мнении, что главным путём предупреждения умственных и физических нарушений, вызываемых свинцом, является снижение его концентрации в окружающей среде. Так, простое рыхление и умягчение почвы связано со значительным уменьшением содержания свинца и мышьяка в крови людей и в жилых комнатах ближайших домов [Lanphear et al., 2003]. Экспериментально показано, что улучшение окружающей среды возмещает долговременную недостаточность обучения восприятию пространства животными, подвергнутыми воздействию свинца, и поэтому может рассматриваться как основа лечения свинцовой интоксикации [Guilarte et al., 2003]. Неудовлетворительные условия окружающей среды могут усиливать отрицательные поведенческие и нейрохимические эффекты свинца, тогда как их улучшение могут эти эффекты смягчать [Schneider et al., 2001]. Так, снижение уровня свинца в городских зонах приводит к уменьшению его содержания в крови проживающих там детей [Переелегина и Загоскин, 2007]. В России принят целый комплекс законодательных актов, направленных на снижение возможности вредного воздействия свинца из окружающей среды на организм человека. Однако многое ещё предстоит сделать для того, чтобы обезопасить население (прежде всего детей) от свинца, накопленного за многие годы в окружающей среде [Переслегина и Загоскин, 2007].
В зависимости от тяжести токсического воздействия свинца применяют различные средства помощи. В случае наиболее тяжёлых отравлений используют фармакологическую коррекцию, сорбционную терапию и терапию хелатными средствами. Кроме того, при обнаружении тяжёлого отравления свинцом необходимо проведение исследования экологического состояния окружающей среды, установление источника загрязнения и принятие мер по предупреждению подобных случаев в будущем [Розанов, 2000].
Рекультивация земель, улучшение условий обитания людей и уменьшение вероятности контакта со свинцом являются, безусловно, главными факторами предупреждения свинцовой интоксикации, однако это ни в коей мере не отменяет необходимости использования терапевтических мероприятий, направленных на снижение концентрации этого металла в крови. Для этой цели издавна используются разнообразные комплексоны (хелатирующие агенты), облегчающие мобилизацию и выведение свинца из тканей-депо организма, антиоксиданты, витамины, гормоны и т. д. [Переслегина и Загоскин, 2007]. Весьма полезной представляется информация о том, что добавление кальция, железа и пищевых волокон в рацион питания женщин в период лактации препятствует повышению уровня свинца в крови матерей и ослабляет его ингибирующий эффект на активность дельта- аминолевулинатдегидратазы (дельта-ALAD) и, возможно, на эритропоэз в материнском организме [Переслегина и Загоскин, 2006; Pires et al., 2002].
Продолжает исследоваться терапевтическая эффективность известного комплексона, этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), а также тиоловых хелаторов, таких как З-димеркаптопропан-1-сульфат (DMPS) и моноизоамил-2,3-димеркаптосукцинат (MiADMSA), по отдельности и в комбинации, как агентов, снижающих концентрацию свинца в крови и мягких тканях, а также восстанавливающих биохимические параметры, нарушенные попаданием свинца в организм крыс. При подостром свинцовом отравлении крыс комбинационная терапия СаЫа2ЭДТА и MiADMSA оказывает более выраженное действие на восстановление биохимических и клинических параметров по сравнению с монотерапией, осуществляемой с помощью этих хелатирующих агентов [Saxena and Flora, 2004]. Для оптимизации эффекта хелатной терапии также рекомендовано совместное введение витамина Е и мезо-2,3-димеркаптосукцината (DMSA) или MiADMSA [Flora et al., 2003], a также DMSA и таурина [Flora et al., 2004] и DMSA и а-липоевой кислоты [Pande and Flora, 2002]. Однако в исследовании одной из клиник США, в котором было проведено три курса терапии DMSA детям, имеющим уровень свинца в крови 20-44 мкг/дл, было установлено, что, хотя DMSA и снижает уровень свинца в крови, он обладает рядом побочных эффектов [Rogan, 2000].
Следует очень осторожно подходить к назначению тиоловых комплексонов, поскольку хелатирующие агенты, такие как, 2,3-димер-каптопропанол (BAL), 2,3-димеркаптопропан-1-сульфоновая кислота и мезо-2,3-димеркаптосукцинат, заметно потенцируют ингибирование дельта-ALAD свинцом in vivo и in vitro, Эти вещества образуют комплексы (свинец+хелатор), которые являются более сильными ингибиторами, чем сам свинец в отношении активности фермента в печени и почках ex vivo [Santos et al., 2006].
Другим важным недостатком терапии хелатирущими агентами является невозможность их применения без удаления пациента от источника свинцовой интоксикации из-за эффекта «отката», а также нецелесообразность их использования при относительно невысоких уровнях свинца в организме [Gurer and Ercal, 2000].
В некоторых случаях более рациональной может быть комбинированная терапия хелаторами и антиоксидантами [Flora et al., 2003, 2004; Pande and Flora, 2002]. В опытах на животных, подвергнутых воздействию свинца, показан эффект таких антиоксидантов как витамины В6, С и Е, цинк, таурин, N-ацетилсерин и а-липоевая кислота, применявшихся либо поодиночке, либо в комплексе со стандартными хелатирующими агентами [Patrick, 2006]. Способность уменьшать последствия пренатального воздействия свинца на головной мозг крыс обнаружена у обладающего антиоксидантными свойствами препарата гистохором [Рыжавский и др., 2008]. Испытаны также эффекты некоторых гормонов в качестве антиоксидантов. Так, действие мелатонина на индуцированные свинцом нарушения синтеза гема приписываются его способности увеличивать антиоксидантную емкость клеток в дополнение к его способности устранять свободные радикалы [El-Missiry, 2000]. Важнейшим преимуществом терапии антиоксидантами перед хелатной терапией является большая их безопасность и возможность их применения без удаления человека из зоны загрязнения, а также при относительно невысоких уровнях свинца в организме, что встречается гораздо чаще, чем острые случаи отравления [Gurer and Ercal, 2000].
Пренатальное воздействие АС на оксидантный статус и АГС ткани головного мозга новорожденных крыс
Полученные нами результаты, свидетельствующие об интенсификации окислительных процессов в тканях головного мозга новорожденных крыс под воздействием АС в пренатальный и ранний послеродовой период (нарушение соотношения GSH/GSSG, изменение активности ферментов АТС, повышение содержания МДА и уровня СРО), полностью соответствует имеющимся в литературе данным о прооксидантном действии свинца. Сходные результаты были получены в исследовании на мышах, где интоксикацию свинцом также проводили в периоды беременности и лактации. В аналогичных условиях интоксикации была установлена прямая взаимосвязь между уровнем перекисного окисления липидов (ПОЛ) и содержанием свинца в различных структурах мозга крыс [Villeda-Hernandez et al., 2001]. Повышение интенсивности ПОЛ и падение уровня GSH наблюдалось в гиппокампе потомства крыс при свинцовой интоксикации самок только в период лактации [Yin et al., 2008].
Данные литературы свидетельствуют о том, что воздействие свинца в период беременности и лактации может вызывать как снижение активности ГПО, ГР и СОД в головном мозге [Wang J. et al., 2006], так и ее повышение [Babu et al., 2007; Bokara et al., 2008]. Снижение активности ГПО, ГР и СОД отмечено в головном мозге мышей при концентрации АС в питьевой воде 0,06 % [Wang et al., 2006]. Возрастание активности ГПО и ГР наблюдалось в головном мозге крыс при концентрации АС в питьевой воде 0,05 % и сопровождалось падением активности СОД [Babu et al., 2007]. В другом исследовании интоксикация в периоды беременности и лактации вызывала повышение активности СОД и каталазы и сопровождалась накоплением продуктов ПОЛ в головном мозге потомства крыс при 0,4 % АС в питьевой воде [Bokara et al., 2008]. Исследование уровня GSH и GSSG в этих работах не проводилось.
Установленное нами при интоксикации в пренатальный и послеродовой период (см. главу 3, часть 3) повышение активности ГПО и снижение активности ГР, катализирующих, соответственно, реакции окисления и восстановления глутатиона [Зозуля и др., 2000], полностью соответствует повышению в тканях мозга уровня GSSG и снижению уровня GSH. В экспериментах с интоксикацией АС в той же дозе только в период эмбриогенеза при повышении активности ГПО активность ГР оставалась на уровне контроля. Известно, что свинец взаимодействует с SH-группами цистеина, образуя при этом стабильные комплексы, что приводит к нарушению конформации и активности ферментов [Vallee and Ulmer, 1972]. ГР содержит дисульфид в активном центре [Fahey and Sundquist, 1991], который, как предполагается, является мишенью для свинца, что в итоге приводит к ингибированию фермента [Sandhir et al., 1995; Sandhir et al., 1994]. С нашей точки зрения, именно этим может объясняться снижение активности ГР при интоксикации в период эмбриогенеза и лактации. Это предположение согласуется с результатами, полученными ранее в работе Othman A.I. and El-Missiry M.A. [1998], обнаруживших, что селен, конкурирующий со свинцом при всасывании [Schrauzer, 1987], при его введении самцам крыс перед воздействием свинца оказывает профилактический эффект, вызывая повышение активности ГР, СОД и уровня GSH. Сохранение активности ГР на уровне контроля в наших экспериментах при интоксикации только в период эмбриогенеза может являться следствием менее длительного воздействия АС. ГПО, не имеющая в реакционном центре SH-групп, непосредственному влиянию свинца, по-видимому, не подвергается, поэтому вероятно, что обнаруженное нами повышение её активности при интоксикации в период эмбриогенеза либо эмбриогенеза и лактации прежде всего является следствием усиления процессов
СРО и ПОЛ. В экспериментах на новорожденных крысах нами показано, что доза АС 1 мг/кг массы тела во время всей беременности не вызывает заметных изменений уровня ПОЛ и состояния АТС в ткани их мозга. Поэтому можно предположить, что оксидативныи стресс и снижение антиоксидантнои защиты в головном мозге потомства при внутриутробной интоксикации небольшими дозами свинца может быть не основным механизмом его нейротоксичности. Такой же вывод был сделан другими авторами на основании собственных экспериментов при интоксикации крыс в пренатальный и лактационный периоды [Moreira et al., 2001].
Нами установлено, что однократное пренатальное воздействие высокой дозы АС (200 мг/кг массы тела) вызывает усиление ПОЛ и снижение глутатионовой защиты в головном мозге новорожденных крыс, идентичное нарушениям в состоянии ПОЛ и ГС при длительной интоксикации более низкой дозой (6 мг/кг массы тела) в течение всей беременности. В мозге 7-дневных крыс, подвергнутых интоксикации той же низкой дозой в течение всей беременности и во время лактации, нами обнаружено, помимо повышения ПОЛ и снижения глутатионовой защиты, значительное возрастание интенсивности СРО.
Таким образом, результаты наших исследований дополняют полученные ранее данные о нарушении оксидантного статуса и антиоксидантнои защиты в головном мозге потомства при интоксикации в пренатальный и ранний послеродовой период.
Нарушение нейритного роста при воздействии AC in vivo и in vitro
Интересна работа, в которой показано, что сине-зелёная водоросль Spirulina fusiformis способна снижать ПОЛ и нормализовать уровень эндогенных антиоксидантов в мозге, печени, почках, легких и сердце взрослых крыс подвергнутых воздействию AC [Upasani and Balaraman, 2003]. Другими авторами показано, что гель из морских водорослей существенно уменьшает токсическое воздействие свинца на беременных женщин и потомство и может использоваться как профилактическое средство [Одинец и др., 2008]. На наш взгляд, это средство в наибольшей степени соответствует высоким требованиям, предъявляемым к средствам защиты от свинцовой интоксикации детей, особенно во время внутриутробного развития.
Важную роль в предотвращении токсического воздействия свинца играет рацион питания. В опытах in vitro установлено, что свинец значительно быстрее проникает в клетки при нехватке кальция [Kerper and Hinkle, 1997]. Это связано с тем, что кальциевые каналы в высокой степени проницаемы для свинца [Simons, 1986, 1993]. Последующее исследование показало, что снижение потребления детьми растительных жиров, витамина С и кальция способствует повышению токсического воздействия свинца. Авторы рекомендовали дополнить питание детей указанными элементами, а также эссенциальными аминокислотами, железом, тиамином и токоферолом, поскольку многие из них являются антагонистами тяжёлых металлов или повышаю резистентность организма [Стародумов, 2003]. Совместное применение витамина С и таурина способно снижать последствия оксидативного стресса в печени взрослых мышей [Wang et al., 2007]. В работе других авторов было установлено, что оптимальная комбинация нутриентов таких как метионин, таурин, цинк, аскорбиновая кислота и глицин предотвращают нарушения когнитивных функций и памяти у взрослых крыс, а таурин и тиамин способны снижать последствия нейротоксического воздействия свинца [Fan G. et al., 2009]. Таким образом, в настоящее время имеется ряд препаратов, показавших достаточно высокие способности предотвращать последствия свинцовой интоксикации, такие как окислительный стресс, а также нарушение памяти и обучения. Однако работы, в которых исследовалась бы возможность защиты мозга от действия свинца в период его закладки и эмбрионального развития, единичны. Приведённые средства имеют ряд недостатков, которые подвергают сомнению возможность их использования в указанный период онтогенеза. Поскольку, как было сказано выше, именно развивающийся мозг наиболее чувствителен к действию соединений свинца, а отклонения от нормального хода развития наиболее опасны на первых стадиях пре- и раннего постнатального онтогенеза, поиск средств надёжной защиты от токсических эффектов свинца именно на этих стадиях представляется крайне актуальной задачей.
Полученные нами данные могут иметь достаточно важное научное и практическое значение, так как убедительно демонстрируют способность КК нормализовать уровень ПОЛ и АФК, сохранять нормальную активность АГС, а также повышать устойчивость нейронов к повреждению глутаматом при интоксикации АС в пренатальный и ранний послеродовой периоды. При этом подтверждением преимущества возможного практического применения КК по сравнению с другими нейропротекторами является то, что лекарственный препарат Бализ-2, в котором она является основным действующим компонентом, не обладает побочным действием, хорошо выводится из организма и в течение многих лет успешно применяется в медицинской практике [Шурыгин, 2002].
Хорошо известно, что пренатальное и послеродовое воздействие свинца приводит к многочисленным морфофункциональным нарушениям развивающейся ЦНС [Yagminas et al., 1992; Рыжавский, 2000; Gilbert et al., 2005; Villeda-Hernandez et al., 2006; Verina et al., 2007], отрицательно влияет на ее высшие функции ЦНС (Xu J. et al., 2007) и на работу генетического аппарата [Чухловина, 1977; Привалова и др., 2002; Переслегина и Загоскин, 2006, 2007]. У детей при минимальном содержании свинца в крови (5-10 мкг/дл) затрудняется обучение, нарушаются внимание и память [Canfield et. al., 2003; Toscano and Guilarte, 2005]. Исследования когнитивной функции показали, что повышение содержания свинца на каждые 10 мкг/дл приводит к прогрессирующему снижению коэффициента IQ [Bellinger, 1995]. Полученные нами данные, свидетельствующие о нарушениях оксидантного статуса развивающейся нервной ткани потомства, подвергнутого пренатальному воздействию свинца, расширяют имеющиеся представления о механизмах его токсического эффекта [Bennet et al., 2007]. Исходя из этих представлений, к наиболее эффективным протекторным соединениям при свинцовой интоксикации в настоящее время относят антиоксиданты различной природы. Важнейшим преимуществом антиоксидантной терапии перед терапией хелатирующими агентами является большая её безопасность и возможность применения без удаления человека из зоны загрязнения, а также при относительно невысоких уровнях свинца в организме, что встречается гораздо чаще, чем острые случаи его отравления большими дозами [Gurer and Ercal, 2000].
