Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Роль перекисного окисления липидов в реализации резистентной стратегии адаптации 10
1.2. Антиоксидантная система клетки 18
1.3. Физиологические и биохимические механизмы структурно-функциональных нарушений при гипокинезии различной продолжительности 23
1.4. Индивидуально-типологические особенности реагирования на стресс 29
1.5. Структура, физико-химические свойства и биологическая роль ноотропа ГВС-111 36
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 43
2.1. Постановка эксперимента 43
2.2. Препаративные методы 45
2.2.1. Получение субклеточных фракций коры мозга 45
2.2.2. Получение плазмы крови, эритроцитарного лизата и эритроцитарной массы 47
2.2.3. Экстракция липидов 47
2.3. Биохимические и биофизические методы 48
2.3.1. Определение продуктов ПОЛ методом Н2О2-индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции 48
2.3.2. Определение молекулярных продуктов ПОЛ 48
2.3.3. Определение активности СОД 49
2.3.4. Определение активности каталазы 50
2.3.5. Определение оксидазной активности церулоплазмина.. 50
2.3.6. Определение содержания гемоглобина 50
2.3.7. Определение проницаемости эритроцитарных мембран. 51
2.3.8. Определение количества общих липидов 51
2.3.9. Определение общего белка t
2.4. Математическая обработка результатов 52
ГЛАВА 3. Результаты исследования 53
3.1. Влияние ГВС-111 на интенсивность свободнорадикальных процессов в тканях крыс с различным уровнем тревожности 55
3.1.1. Содержание продуктов ПОЛ и активность ферментов антиоксидантной системы в коре головного мозга крыс... 55
3.1.2. Содержание продуктов ПОЛ и активность ферментов антиоксидантной системы в плазме крови крыс 61
3.2. Действие ГВС-111 на интенсивность свободнорадикальных процессов при гипокинезии 67
3.2.1. Интенсивность процессов ПОЛ и активность ферментов антиоксидантной системы в коре головного мозга крыс в условиях гипокинезии и на фоне введение ГВС-111 67
3.2.2. Интенсивность процессов ПОЛ и активность ферментов антиоксидантной системы в плазме крови крыс в условиях гипокинезии на фоне введения ГВС-111 72
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 79
Выводы 94
- Роль перекисного окисления липидов в реализации резистентной стратегии адаптации
- Физиологические и биохимические механизмы структурно-функциональных нарушений при гипокинезии различной продолжительности
- Получение субклеточных фракций коры мозга
- Влияние ГВС-111 на интенсивность свободнорадикальных процессов в тканях крыс с различным уровнем тревожности
Введение к работе
В последнее время особо значимым становится поиск путей повышения адаптивных возможностей организма и предупреждения развития патологических состояний при действии экстремальных факторов среды. Особую актуальность приобретает разработка фармакологических веществ, которые могут предотвращать и ослаблять нарушения высших интегративных функций мозга при неблагоприятных внешних воздействиях (Машковский, 1982; Вальдман, Александровский, 1987; Бенькович, 2000; Середенин и др., 2001). В этой связи перспективным является создание новых соединений с ноо-тропньши свойствами на основе эндогенных медиаторов и метаболитов головного мозга, в частности пептидного строения, способных взаимодействовать со множеством регуляторных механизмов в живых системах (Тушмало-ва, 1994; Ашмарин, Каразеева, 1996; Воронина 1991; Скребицкий, Чепкова, 1999). В НИИ фармакологии РАМН синтезирован пептидный аналог пираце-тама на основе пролина - ГВС-111 (ноопепт, этиловый эфир N- фенилацетил-L- пролилглицина), значительно превосходящий пирацетам по спектру положительных мнестических эффектов и проявляющий ноотропную активность в дозах существенно (до 3-х порядков) меньших, чем пирацетам (Островская и др., 2001).
Поскольку влияние ноотропов на процессы, происходящие в организме, более выражено при действии экстремальных факторов среды, для изучения молекулярных механизмов антистрессорного действия ГВС-111 в нашей работе использована 24-часовая гипокинезия, которую можно рассматривать как модель хронического эмоционального стресса (Коваленко, Гуровский, 1980). Профилактика и реабилитация последствий гипокинезии привлекает все большее внимание исследователей, поскольку в условиях современной трудовой деятельности существенно снизилась интенсивность систематической мышечной активности и резко возросло нервное и эмоциональное на-
пряжение при выполнении ответственных операций (Альперович и др., 1999).
Основным и универсальным механизмом развития стрессорной реакции является интенсификация перекисного окисления липидов (ПОЛ) и вызванное накоплением его продуктов повреждение мембранных структур. Поэтому при создании новых лекарственных средств изучение интенсивности свободнорадикальных процессов в норме и при экстремальных воздействиях необходимо для поиска эффективных способов профилактики и лечения стресс-индуцированных патологий. При этом необходимо учитывать зависимость эффективности большинства фармакологических препаратов от генетически детерминированного уровня тревожности конкретного индивида, который может быть прогностически определен на основании параметров двигательной и исследовательской активности (Blizard, 1981; Августинович, Корякина, 2000; Серединин и др., 2001).
В связи с этим целью настоящей работы явилось изучение роли свободнорадикальных процессов в механизме действия ГВС-111 в условиях нормально функционирующего организма и при 24-часовой гипокинезии у животных с различным уровнем тревожности. В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования:
Изучить влияние ГВС-111 на интенсивность ПОЛ в плазме крови, мембранах эритроцитов, синаптосомальной и митохон-дриальной фракциях коры головного мозга у крыс с высоким и низким уровнем тревожности в условиях нормально функционирующего организма и при гипокинезии;
Установить влияние ГВС-111 на активность ферментов анти-оксидантной защиты - супероксиддисмутазы (СОД) и катала-зы в коре головного мозга, а также на супероксидустраняю-щую активность (СУА), оксидазную активность белка плазмы крови - церулоплазмина и активность каталазы в плазме крови
7 крыс с различным уровнем тревожности в норме и при действии гипокинезии;
Исследовать влияние ГВС-111 на структурное состояние эритроцитарных мембран в норме и при действии гипокинезии у животных с различным уровнем тревожности;
Установить корреляционные взаимосвязи между изменениями параметров перекисного окисления липидов и антиоксидант-ной системы при введении ГВС-111 перед началом гипокинезии.
Научная новизна работы. Впервые показано, что введение ГВС-111 в дозе 5 мг/кг за 1 час и 25 часов до декапитации приводит к активации процессов ПОЛ, о чем свидетельствует повышение содержания первичных молекулярных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов (ДК) в коре головного мозга и плазме крови крыс обеих типологических групп. Наибольшая выраженность активации ПОЛ отмечается у животных с низким уровнем тревожности. Впервые установлено, что ГВС-111 обладает стресс-протекторным эффектом при его профилактическом введении животным, помещенным в условия 24-часовой гипокинезии. Наиболее выраженное антистрессорное действие ГВС-111 проявляется в отношении крыс с высоким уровнем тревожное ги. Повышение адаптационных возможностей организма при введении ГВС-111 в условиях гипокинезии достигается посредством усиления эффективности работы ферментов антиоксидантной системы головного мозга и крови, что приводит к снижению уровня продуктов ПОЛ в перечисленных тканях и стабилизации структуры мембран эритроцитов, особенно у животных с высоким уровнем тревожности. Причем, в коре головного мозга анти-стрессорный эффект препарата, судя по уровню молекулярных продуктов ПОЛ, в зависимости от типа высшей нервной деятельности животного реализуется либо на уровне синаптических структур (у высокотревожных крыс), либо на уровне митохондриальных структур (у крыс с низким уровнем тревожности).
8 Теоретическое и практическое значение. Результаты исследования
соединения пептидной природы ГВС-111 расширяют наши представления о молекулярных механизмах действия ноотропных препаратов и способствуют пониманию взаимосвязи их антистрессорного эффекта с индивидуально-типологическими особенностями организма, дополняют ранее полученные факты о роли ноотропов в механизмах формирования адаптационной стратегии организма и возможности повышения эффективности адаптивного ответа. Полученные в данной работе новые факты о соотношении уровня продуктов ПОЛ и активности антиоксидантных ферментов в реализации стресс-протекторного действия ГВС-111, а также факты о мембраностабилизирую-щем эффекте препарата позволяют с высокой эффективностью применять его в медицине с целью управления адаптационными реакциями организмов с различным уровнем тревожности.
Материалы работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий в Ростовском государственном университете по курсам: «Физиология регуляторных пептидов», «Механизмы памяти».
Основные положения, выносимые на защиту:
Введение ГВС-111 интактным животным способствует интенсификации ПОЛ на начальных стадиях процесса, особенно в группе с низким уровнем тревожности, что необходимо для повышения резистентности путем развития реакции активации. При этом увеличение мощности антиоксидантных систем поддерживается на уровне, предупреждающем необратимые структурно-функциональные нарушения мембран.
Ноотроп ГВС-111 обладает стресс-протекторным эффектом в условиях гипокинезии, механизмом которого является способность препарата к формированию состояния «преадаптации» путем поддержания оптимального для каждой конкретной ситуации баланса активности про- и антиоксидантных систем мозга и крови.
9
3. Стресс-протекторный эффект дипептида зависит от индивиду-
ально-типологических особенностей животных и соответствует его способности снижать вызванное гипокинезией накопление продуктов ПОЛ в исследованных тканях и оказывать стабилизирующее влияние на структуру эритроцитарных мембран, что особенно выражено у крыс с высоким уровнем тревожности.
Роль перекисного окисления липидов в реализации резистентной стратегии адаптации
Достижения последних лет свидетельствуют о важной роли свободных радикапов в механизмах регуляции метаболизма. Свободный радикал - это молекула (или ее часть) с высокой химической активностью за счет одного или нескольких неспаренных электронов на внешней орбитали (Владимиров и др., 1983). Активные формы кислорода (АФК) являются нормальными продуктами метаболизма и образуются в клетках живых организмов при ферментативных и неферментативных реакциях окисления. Так, образование 0{-происходит при: -работе цитохрома Р-450, главного фермента детоксикации ксенобиотиков
(Иванов и др., 1975); -оксидазной активности ксантиноксидазы, КФ 1.2.3.2. (Щепеткин, 1998); -при работе альдегидоксидазы, флавинсодержащих гидролаз, липоксигеназы (Fridovich, 1986; Nagao et al., 1981); НАДФН-оксидазы фагоцитов, КФ 1.6.99.6 (Земсков, 1988; Bellavite, 1988); -автоокислении адреналина, тетрагидроптеринов, лейкофлавинов, фенолов, гемсодержащих белков и других соединений, имеющих окислительно-восстановительный потенциал ниже, чем у кислорода (Fe-heretal., 1987); -прямом переносе электрона с электрон-транспортных систем на кислород, когда супероксид образуется как побочный продукт (Демин и др., 1998); -в сыворотке крови человека и животных обнаружена фракция липопро-теинов, способных генерировать супероксид (Симонян и др., 1996). Свободнорадикальные процессы широко используются в организме в норме и в ответных реакциях на внешние воздействия. Следовательно, их следует рассматривать как отражение эволюционно сложившейся потребно сти организма. Свободные радикалы участвуют:
1. в регуляции клеточной пролиферации, дифференцировки (Кобляков, 1998) и биосинтезе белка, причем эта регуляция, очевидно, осуществляется на этапе транскрипции;
2. в антивирусной защите организма, запуская программу апоптоза зараженной клетки путем наработки 02_- и Н202. (Скулачев, 1998);
3. аминокислотные радикалы и нуклеотидные радикальные интермедиа участвуют в превращении рибонуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды рибонуклеотидредуктазами (Пескин, 1998).
При выходе процесса образования свободных радикалов из-под контроля АФК способны: 1. эффективно окислять (и тем самым инактивировать) различные белки и разрушать некоторые полисахариды; 2. стимулировать мутагенез за счет накопления окислительных повреждений в ДЬЗСК (Брусков и др., 1996) и в остальных азотистых основаниях с последующей фрагментацией рибозы и образованием поперечных сшивок между ДНК и белками и между соседними пиримидиновыми и пуриновыми основаниями (Пескин, 1997); 3. вызывать неоплазию генома и участвовать в процессах канцерогенеза (Варганян и др., 2001).
Согласно современным представлениям, повреждающее действие кислорода обусловлено не столько супероксидным анион радикалом (0 2), являющемся окислителем средней силы с малым радиусом действия за счет высокой реакционной способности, сколько продуктами дальнейших его преобразований - перекисью водорода (Н202), гидроксильным радикалом (ОН), пероксинитритом (ONOO), синглетным кислородом (J02) и радикалами, образующимися при распаде гидроперекисей липидов (Скулачев, 2000).
Таким образом, главная опасность для клеток со стороны АФК заключается в инициации перекисного окисления липидов (ПОЛ). ПОЛ в животных клетках слагается из следующих фаз: 1) реакция зарождения; 2) реакция раз вития цепи; 3) реакция разветвления; 4) реакция обрыва цепи.
На стадии зарождения цепей свободные радикалы отщепляют атом водорода от молекулы ненасыщенной жирной кислоты (LH) с образованием радикального центра на альфа-метиленовом углероде жирной кислоты (L ) и этим запускают цепь реакций, ведущих к появлению гидроперекисей липи-дов (LOOH). Зарождение цепи ПОЛ запускается супероксидным анион-радикапом 02 , пергидроксильным радикалом Н02-, синглетным кислородом ]02, однако наиболее мощным индуктором является гидроксильный радикал ОН. Первые три радикала оказывают двоякий эффект: собственно запуск ПОЛ и образование Н2О2, из которой в реакции Фентона при участии Fe образуется -ОН (главный "пускатель" ПОЛ). Кроме АФК, запускать СРО липи-дов могут и радикалы органических молекул, например аминокислот (Владимиров и др., 1983).
На следующей стадии органические радикалы быстро взаимодействуют с Ог, который в силу незаполненности верхних молекулярных орбиталей выступает в качестве акцептора электронов. В результате взаимодействия образуется пероксирадикал (LO2 ), в свою очередь, атакующий ненасыщенные липиды. Возникновение в этой реакции наряду с органической перекисью нового радикала L способствует продолжению окислителной цепи.
Реакции разветвления цепи связаны с разложением перекисей липидов, которые реагируют с ионами металлов переменной валентности, в первую очередь с Fe +, и образуют алкоксильные радикалы. Образовавшиеся алкок-сильные радикалы при взаимодействии с липидами порождают липидные ра if, if, $ дикалы, запускающие новую цепь ПОЛ. Не все радикалы L , L0 и ІХЬ продолжают участвовать в цепных реакциях, часть их рекомбинирует с образованием неактивных продуктов: L + L — - LL; L02 + L — - LOOL
Физиологические и биохимические механизмы структурно-функциональных нарушений при гипокинезии различной продолжительности
Термин гипокинезия употребляется для обозначения длительного снижения объема движений с преимущественным уменьшением локомоторных актов и общей двигательной активности, приводящих к детренированности и многообразным нарушениям функций организма. Гипокинезия является мощным стрессорным фактором, причем вызванный ею ответ развивается у животных с первых часов ограничения локомоции, поскольку резкое ограничение подвижности в случае иммобилизации или помещения в тесные клетки-пеналы осложняется невозможностью освобождения с преобладанием эмоционального компонента реакции (Коваленко, Гуровский, 1980).
В зависимости от продолжительности выделяют 3 этапа гипокинезии у некоторых млекопитающих в эксперименте (приведенная периодизация характерна для «устойчивых» к стрессу животных):
1) в первые дни ограничения подвижности (около 6 суток) животные нахо дятся в состоянии острого стресса, основным проявлением которого яв ляется гипертрофия коркового вещества надпочечников (Юргенс, Кирил лов, 1972), уменьшение массы тимуса и селезенки (Ли и др., 1989). Как и при других воздействиях, стрессорная реакция при гипокинезии реализу ется через симпатоадреналовую и гипоталамо-гипофизарно надпочечниковую системы, что сопровождается высвобождением норад реналина из гипоталамуса, возрастанием секреции АКТГ и синтеза кор тикостероидов (Kraicer et. al., 1980). Важную роль в регуляторных про цессах при стрессе и адаптации на первых этапах гипокинезии играют холинергические структуры гипоталамуса (Тонкоглас и др., 1980). Ацетил холин и его агонисты вызывают активацию щитовидной железы и сим патоадреналовой системы, что приводит к возрастанию уровня катехола минов в крови и тканях (Udupa et. al., 1976).
2) вторая стадия (вторая половина 1-го начало 2-го месяца) характеризуется развитием определенной адаптации {фаза резистентности), однако нормализации метаболизма не происходит и процесс быстро переходит к третьей стадии (Федоров, 1970, Кротов, 1972).
3) стадия истощения развивается в конце 2-го - начале 3-го месяца. В этот период особенно значительны изменения фосфорно-кальциевого обмена в связи с уменьшением нагрузки на костный аппарат и относительной недостаточностью выработки кальцитонина (Бакулин и др., 1994). Кроме того, эта стадия характеризуется возрастанием проницаемости гемато-энцефалического барьера к адреналину и преобладанием процессов катаболизма над биосинтезом. С избыточным содержанием катехоламинов в мозге и крови связывают возникновение окислительных поражений тканей и органов при гипокинезии (Ковачева-Иванова и др., 1992), что сопровождается: понижением количества антиоксидантов и активности антиокси-дантных ферментов (Thor et al., 1982); повышением содержания продуктов ПОЛ и уменьшением количества глутатиона (Kagan, 1988); деструкцией полиеновых фосфолипидов и индукцией лизосомаль-ных ферментов (Halliewll, Gutteridge, 1988). Именно высокая концентрация катехоламинов при стрессе способствует изменению соотношения путей их инактивации в сторону преобладания хиноидного превращения с образованием свободнорадикальных интермедиа-тов, выступающих в роли инициаторов ПОЛ. Кроме того, катехоламины, являясь агонистами аденилатциклазы, способны обусловливать катаболизм фосфолипидов через ц-АМФ-опосредованную активацию фосфолипаз, на рушая структурную целостность мембран (Осипов и др., 1990).
Активация ПОЛ при стрессе позволяет использовать содержание его продуктов для определения наличия стресс-реакции и отдельных её стадий в организме, а также судить об эффективности действия фармакологических препаратов (Меерсон, 1984; Александровский и др., 1991; Саакян и др., 2001; ВеЫ, 1998).
Интенсивность ПОЛ в различных органах и тканях зависит от продолжительности гипокинезии (Морозкина и др., 1989). Уже при 24-часовом ограничении подвижности отмечается некомпенсированная активация ПОЛ в мозге, причинами которой может быть:
1. прямое взаимодействие продуктов ПОЛ с мембраносвязанными ферментами и рецепторами;
2. изменение свойств липидной матрицы (образование гидрофильных пор и каналов, изменение микроокружения мембранных белков, содержания липидов - эффекторов, сегрегации липидов, их перераспределения в плоскости мембраны, или между наружным и внутренним монослоями и т.п.).
Последствия активации ПОЛ в мозге особенно опасны при гипокинезии, осложненной эмоциональным стрессом (как это происходит при 24-часовом ограничении подвижности), поскольку:
1. интенсификация фосфоинозитольного цикла в синаптосомах вызывает па тологическое накопление Са2+ в нейроцитах и приводит к окислительному стрессу (Шестакова и др., 1994; Кручинина, Порошин, 1994);
2. происходит нарушение проницаемости мембран, работы насосов, фермен тов и рецепторов, а также изменение механической и электрической проч ности мембраны, её способности к контакту и взаимодействию с другими мембранами;
Получение субклеточных фракций коры мозга
Для выделения субклеточных фракций (синаптосомы, митохондрии) использовали метод дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (de Robertis, 1971). Центрифугирование проводили на ультрацентрифуге VAC-602 с бакетным ротором (0,32-08-1,25). Фракции на границах раздела слоев сахарозы отбирали шприцем, отмывали от сахарозы и концентрировали центрифугированием в Tris-HCl буфере, рН 7,4. (Рис.4.)
Для получения плазмы, кровь собирали в стеклянные центрифужные пробирки, содержащие 0,48% раствор гепарина в физиологическом растворе из расчета 0,075 мл раствора на каждый мл цельной крови. Кровь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин.
Для получения эритроцитарного лизата, после удаления лейкоцитарной пленки на границе раздела плазмы и эритроцитарной массы 0,1 мл осадка эритроцитов ресуспендировали в охлажденном изотоническом растворе и центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. После трехкратной отмывки эритроцитарной массы физиологическим раствором осадок гемолизировали в 2 мл дистиллированной воды с последующим перемешиванием и выдерживанием на холоду в течение часа.
Для получения эритроцитарной массы осадок эритроцитов ресуспендировали в двукратном объеме изотонического раствора центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин., надосадочную жидкость сливали; описанную процедуру повторяли трижды.
Липидный экстракт получали по методу Bligh, Dyer, 1959. Метод основан на том, что гидрофобные липиды экстрагируются в гидрофобную среду хлороформа, а все водорастворимые молекулы переходят в водно-метанольную фазу. После разделения слоев (5 час, холодильник) отбирали нижний хлороформный слой, в котором определяли общие липиды, диеновые конъюгаты, основания Шиффа.
Для определения НзОг-люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ) в кювету вносят 2,9 мл 50 мкМ раствора люминола в 0,1 М трис-HCl буфере рН 6,8 и 0,1 мл образца (плазмы крови или водорастворимой фракции коры головного мозга). Затем кювету прогревают 500 секунд при 37С и вносят в нее 0,5 мл 350 мМ Н2О2, одновременно включая счетчик импульсов. Измерение проводили в течение 100 секунд. Определяли следующие параметры (Шестаков и др., 1972): - светосумма свечения за 100 секунд; - высота быстрой вспышки. Светосумма отражает общее число образовавшихся LCV. Амплитуда быстрой вспышки прямо пропорциональна концентрации LOOH в пробе (собственно, быстрая вспышка обусловлена разложением присутствующих в пробе перекисей). Интенсивность свечения определяли на хемилюминометре, состоящем из блока фотометрирования с детектором ФЭУ-37 в составе сцинти-ляционного измерительного зонда VA-S - 968 (RTF) и базового сцинтиляци-онного спектрофотометра 22028 (RTF), а также цифропечатного устройства и самописца КСП-4.
Содержание диеновых конъюгатов (ДК) определяли в липидных экстрактах субклеточных фракций коры головного мозга и плазме крови крыс спек-трофогометрическим методом (Стальная, 1977). Метод основан на образовании системы сопряженных диеновых связей, для которых характерен максимум поглощения в гексане при 233 нм. Оптическую плотность измеряли на СФ "Beckman" против метанол-гексановой смеси. Содержание ДК вычисляли исходя из 8()=2.lelO5! "1 см"1 и выражали в нМ/мг общих липидов.
Содержание Шиффовых оснований (ШО) определяли в липидных экстрактах субклеточных фракций коры головного мозга и плазме крови крыс. ШО обладают способностью флуоресцировать при облучении видимым светом с длиной волны 360 нм (Bidlack, Tappel, 1973). Максимум флуоресценции приходится на длину волны 440 нм. Содержание ШО измеряли на спектроф-луориметре Hitaci- F- 4010 (Япония) и выражали в относительных единицах флуоресценции на 1 мг общих липидов (отн. ед. флуоресценции/мг ОЛ).
Промежуточным продуктом ПОЛ является малоновый диалъдегид (МДА). Его количество определяли колориметрическим способом в гемолиза-те эритроцитов и гомогенате коры головного мозга крыс (Стальная, Гаришви-ли, 1977). Метод основан на образовании в кислой среде триметинового комплекса, состоящего из одной молекулы МДА и двух молекул 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК). Оптическую плотность определяли на ФЭК КФК 2-МП при А,=540 нм против контроля реактивов, в который вместо субстрата вносили дистиллированную воду. Количество МДА рассчитывали исходя из єо=1.56»105М"1см"1 и выражали в [мкмоль/л или нМ/мг ОБ].
Влияние ГВС-111 на интенсивность свободнорадикальных процессов в тканях крыс с различным уровнем тревожности
В результате проведенного исследования установлено, что введение ГВС-П1 интактным животным за 1 и 25 часов до декапитации не приводило к достоверным изменениям в показателях НгСЬ-индуцированной люминол-зависимой ХЛ как у высокотревожных, так и у низкотревожных крыс в субклеточных фракциях (Таблица 2) коры головного мозга, в то время как отмечалось некоторое увеличение содержания молекулярных продуктов ПОЛ (Таблица 3). Подобная динамика, вероятно, обусловлена высокой скоростью протекания свободнорадикального окисления, фармакокинетикой препарата, а также пролонгированностью действия дипептида, пять основных метаболитов которого обладают максимальной активностью довольно длительное время после ферментативного разложения ГВС-111 (Бойко и др., 1997).
Так, через 1 час после введения ГВС-111 в митохондриальной фракции низкотревожных крыс показано повышение концентрации конъютированных диенов и оснований Шиффа на 72% и 56 %, соответственно (р 0,001) (Таблица 3) при одновременном снижении содержания МДА в общем гомогенате на 37% (р 0,05) по сравнению с уровнем контроля (Таблица 4). У крыс с высоким уровнем тревожности в этот период, напротив, наблюдалось снижение содержания оснований Шиффа во фракции митохондрий (Таблица 3).
Через 25 часов после введения ГВС-111 в синаптосомах высокотревожных животных содержание ДК увеличивается на 62% (р 0,001), в митохондриях на 28% (р 0,05); у низкотревожых на 58% и 120% (р 0,001), соответственно. Одновременно отмечается накопление МДА в общем гомогенате (32%, р 0,05) у низкотревожных крыс.
Увеличение соотношения ДК/ШО после введения препарата в синаптосомах (с 2,3 в контроле до 2,9 через 1 час и до 4,7 через 25 часов) и митохондриях (с 1,5 до 2,4 через 1 час и до 2,6 через 25 часов) у животных с высоким уровнем тревожности указывает на интенсификацию ПОЛ на начальных стадиях. Интенсификация перекисного окисления липидов на начальной стадии еще более выражена у низкотревожных крыс в синаптических мембранах (увеличение ДК/ШО с 2,3 до 5,5 через 25 часов после введения ГВС-111), тогда как во фракции митохондрий отмечено и накопление конечных продуктов ПОЛ - ШО (129%, р 0,001). Однако содержание общих липидов во фракциях коры головного мозга по сравнению с контролем у животных с высоким уровнем тревожности не изменилось и даже несколько увеличилось в группе низкотревожных крыс, что указывает на отсутствие необратимых, патологических структурно-функциональных нарушений мембран при введении ГВС-111 интактным животным (Таблица 5).
Вероятно, подобная активация процессов ПОЛ при введении дипептида не содержит в себе немедленной угрозы физиологическому гомеостазу и обусловлена способностью ноотропов усиливать снабжение тканей кислородом, интенсифицировать энергетический метаболизм в мозге, тем самым, оказывая активирующее влияние на пластические процессы нервной ткани и высшие интегративные функции мозга, действуя по принципу повышения «активной резистентности» (Вальдман, Александровский, 1987). Увеличение интенсивности процессов ПОЛ указывает на способность препарата сохранять умеренное возбуждение ЦНС, что физиологически проявляется в преобладании активных форм поведения и увеличении представленности форм целенаправленного поведения при преимущественной активации норадренергической и дофаминэргической систем, отмеченной через 1 час после введения ГВС-111 на фоне повышения содержания ГАМК в общем гомогенате и увеличения концентрации глутамата и аспартата в синаптической фракции коры головного мозга молодых крыс (Лысенко, Демьяненко, 2000).
Одним из возможных механизмов такого действия препарата, вероятно, является регуляция метаболизма мембранных липидов путем изменения баланса основных нейромедиаторных систем мозга, смещения энергетического обмена в сторону ускорения окислительных процессов, мобилизации внутриклеточных регуляторных систем транспорта Са (Солнцева и др., 1996), усиления биосинтеза фосфолипидов и подавления процессов липолиза. Кроме того, ранее в нашей лаборатории показано (Самецкий, 1996), что повышение функциональных возможностей работы нервной системы при введении пирацетама достигается за счет увеличения энергообеспечения нейронов без нарушения их ультраструктуры.
Таким образом, введение ГВС-111 интактным крысам вызывало различные изменения в характере протекания процессов ПОЛ в исследованных группах. Эти различия зависели от уровня тревожности, что по данным литературы, связано с индивидуально-типологическими особенностями поведения и некоторыми биохимическими характеристиками (Гуляева, Степаничев, 1997), в том числе с различиями в содержании и соотношении разных классов фосфолипидов, характеризующихся неодинаковой способностью к окислению (Райзе и др., 2001). Предполагают, что повышенная способность липидов мозга подвергаться перекисному окислению у стресс-неустойчивых животных обусловлена дефицитом эндогенных антиоксидантов и (или) повышенным содержанием легкоокисляемых липидов в тканях ЦНС (Крушинская и др., 1986).
Действительно, описанные различия в динамике ПОЛ при введении ГВС-111 интактным животным были обусловлены обнаруженными нами особенностями активности ферментов антиоксидантной защиты в мозге крыс с различным уровнем тревожности.
Хотя через 1 час после введения ГВС-111 отмечается повышение активности СОД у низкотревожных животных на 37%, р 0,001, активность каталазы снижалась на 32% (р 0,05) (Таблица 6, 7). У высокотревожных животных достоверного повышения активности СОД не наблюдалось, активность каталазы была достоверно ниже контрольного уровня на 30% (р 0,05) (Таблицы 6, 7).
