Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1 Понятие о рецепторе. Общие представления о структуре и свойствах рецепторов стероидных гормонов.
1.2 Общие представления о механизмах действия стероидных гормонов и рецепторнои цикле
1.3 Функционирование рецепторного аппарата стероидных гормонов
1.4 Методы изучения рецепторов стероидных гормонов
1.5 Рецепторы глюкокортикоидов, их общие свойства и структура Механизмы действия рецепторных комплексов.
1.6 Рецепторы андрогенов
1.7 Влияние стероидных гормонов на метаболизм жировой ткани
1.8 Метаболизм жировой ткани при Физических упражнениях
2. Материалы и методы исследования
2.1 Постановка экспериментов на животных
2.1.1 Методика проведения физических нагрузок
2.1.2. Методика постановки эксперимента по изучению влияния дополнительного введения кортикостерона
2.2 Препаративные методы
2.2.1 Получение цитозоля жировой ткани
2.2.2 Получение сыворотки крови
2.2.3. Подготовка колонок с сефадексом
2.3 А.налитические методы
2.3.1 Опре деление связывания андрогенов и глюкокортикоидов с рецепторами в цитозолях жировой ткани
2.3.2 Определение конкурентоспособности стероидов к связыванию рецептор-1Н-Д в цитозоле
подкожной жировой ткани 50
2.3.3 Определение константы скорости диссоциации комплекса
" Н-Д-рецептор 52
2.3.4 Определение концентрации белка в
цитозоле жировой ткани 52
2.3.5 Определение концентрации тестостерона и
кортикостерона в сыворотке крови 52
2.4. Математические методы
2.4.1 Вычисление Каи Втах для связывание глюкокортикоидов с рецепторами в цитозоле подкожной жировой ткани 53
2.4.2 Вычисление константы скорости диссоциации
комплексов" Н-Д-рецептор 53
2.4.3 Статистическая обпаботка данных 54
3.Результаты исследования
3.1 Разработка метода определения рецепторов глюкокортикоидов в цитозолях жировой ткани 55
3.2.Общие свойства рецепторов глюкокортикоидов в цитозоле подкожной жировой ткани крыс
3.2.1 Основные характеристики связывающей способности и специфичности связывания рецептор-дексаметазон 60
3.2.2 Кинетические характеристики взаимодействия Н-Д с рецепторами 63
3.3 Динамика связывания Н-Д с рецепторами после введения кортикостерона 64
3.4 Влияние однократной физической нагрузки на связывание
3.5 Влияние систематической физической нагрузки аэробного
3.6 Влияние систематической физической нагрузки с дополнительным введением креатина на связывание ЛН-Д в цитозоле подкожной жировой ткани 72
3.7 Влияние однократной физической нагрузки на связывание Н-Т в цитозолях жировой ткани 75
3.8 Влияние систематической физической нагрузки аэробного
4. Обсуждение результатов 80
Выводы 87
Список литературы 89
- Понятие о рецепторе. Общие представления о структуре и свойствах рецепторов стероидных гормонов.
- Методика постановки эксперимента по изучению влияния дополнительного введения кортикостерона
- Разработка метода определения рецепторов глюкокортикоидов в цитозолях жировой ткани
Понятие о рецепторе. Общие представления о структуре и свойствах рецепторов стероидных гормонов.
Наиболее известные эффекты стероидных гормонов опосредованы на клеточном уровне рецепторами. Рецепторами стероидных гормонов являются белки, способные связать гормон и транспортировать его к месту активного участия в клеточном метаболизме. Молекула рецептора может рассматриваться первым молекулярным элементом, который узнает специфический внеклеточный сигнал и посредством селективного связывания затем включает цепь внутрикпеточных реакций, на основе которых формируется гормональный ответ. Подходящие под определение рецепторов белки должны удовлетворять следующим критериям [Розен, 1981; Рогозкин, 1988; Akner, 1993]: в связывание должно быть специфично; связывание должно характеризоваться высокой аффинностью, ограниченной ёмкостью, насыщаемостью, обратимостью; посредством рецептора должен осуществляться биологический эффект лиганда. Каждый тип стероидных гормонов имеет истинный рецептор, КОТО мй г.ттРттисЬисгРГ .к иг гаячикая МПТТРК-VTTV ГТРПГШГТЯ ППИНИМЯРТ информационный сигнал. Рецепторы стероидных гормонов наряду с рецепторами витамина Дз, тиреоидных гормонов, ретиноевой кислоты и орфан-рецепторами, для которых не было идентифицировано специфического лиганда (табл. 1), принадлежат к семейству ядерных гормональных рецепторов. [Tsai, O Malley, 1994; Gronemeyer, Laudet, 1995; Mangelsdorf et al., 1995;] и характеризуются общностью строения и механизмов функционирования.
Рецепторы стероидных гормонов - глобулярные белки, относящиеся к гликопротеинам кисло-нейтральной природы. В зависимости от условий экстракции гормон-чувствительных клеток рецепторы стероидных гормонов могут содержаться в различных молекулярных формах [Gehring, 1998]. В растворах нейтральных солей низкой ионной силы (0,2М КС1) при 0С молекулы рецепторов характеризуются константой Сведберга 7-9S, радиусом Стокса 6-8нм (60-80А) и молекулярной массой порядка 200-ЗООкДа., значительно превышающей массу соответствующего рецепторного белка. Такие рецепторные формы, называемые "неактивированными", могут связывать соответствующие стероидные лиганды, но не способны взаимодействовать с ДНК [Gehring, 1998]. В присутствии солей молибденовой, ванадиевой, вольфрамовой кислот происходит стабилизация неактивжюванных рецепторных фопм [Dahmer et al., 1984]. Наиболее широко в исследовании свойств рецепторов стероидных гормонов применяется молибдат натрия [Moncharmont et al., 1982; Rowley et al, 1984]. Ионы M0O42", предохраняют рецепторы от тепловой инактивации, стабилизируют форму 7-9S, препятствуя трансформации и последующей активации [Leach et al., 1979; Ruh M., Ruh Т., 19841. Ещё более выражено стабилизш ющее пецептотшые белки действие молибдата натрия при его добавлении к цитозолям вместе с сульфгидрильными реагентами [Ratajczak et al., 1982; Kalimi, Hubbard, 1983]. Так, ЮмМ Na2Mo04 и 5мМ дитишрейтол (ДТТ) полностью блокируют инактивацию глюкокортикоидных рецепторных комплексов с дексаметазоном (Д) при 25С; 20мМ Na2Mo04 и 0,5-1,0мМ ДТТ в 2,5 раза эффективней, чем просто МО И лат fvrafiwrrirewnvfvr п .тс.гмсг\\лг\пе к\гияг\и\гил r+inniuv nprrprrrnnnR эстрадиола, способствуя более длительному сохранению специфического связывания эстадиола на высоком vpoBHe — более 80% начального в течение 5 дней [Kalimi, Hubbard, 1983]. Стабилизирующее связывающую способность цитозольных рецепторов стероидов действие сульфгидрильных реагентов связано с их способностью оказывать защитное действие в отношении SH-rpvnn белков. Неактивированные рецепторы стероидных гормонов представляют собой мультибелковый комплекс, включающий помимо гормон-связывающей субъединицы (рецепторного белка или апорецептора) общую для всех классических рецепторов стероидных гормонов (рецепторов андрогенов, эстрогенов, прогестерона и глюкокортикоидов) субъединицу с молекулярной массой 90кДа -белок теплового шока hs 90 TSanchez et al., 19851, а также д тиє не столь хорошо охарактеризованные белки [Gehring, 1998]. Способностью препятствовать диссоциации белков теплового шока (бтш) от рецепторного комплекса объясняется антиактивирующее
Методика постановки эксперимента по изучению влияния дополнительного введения кортикостерона
Однократная физическая нагрузка была представлена плаванием животных в течение 1ч.
Систематическая мышечная деятельность животных состояла из плавания 5 раз в неделю в течение 4-х недель с дополнительным грузом, составлявшим 4% от массы тела, с постепенным увеличением длительности плавания на 2 мин ежедневно, начиная с 4 мин в первый день до 40 мин в конце ттюнитювочного цикла.
Однократная и систематическая мышечная деятельность по изменениям в обмене веществ имели выраженную аэробную направленность [Ленкова, Усик, 1981].
Животные, подвергавшиеся систематическим физическим нагрузкам аэробного характера, содержались на рационе А или Вив зависимости от поставленных задач были разделены на 6 групп (табл. 5). На протяжении всего времени тренировок животным двух групп сразу после плавания вводили дополнительно через зонд креатин (25мг/кг веса) в 6%растворе глюкозы.
Разработка метода определения рецепторов глюкокортикоидов в цитозолях жировой ткани
Радиолигандные методы определения рецепторов основаны на использовании их специфической связывающей способности в сочетании с радиоизотопной индикацией лиганда. Наиболее важными моментами в процедуре определения специфического рецепторного связывания с помощью меченых радиоактивных стероидов являются выбор гормона-лиганда и способа разделения образовавшихся гормон-рецепторных комплексов и несвязавшегося лиганда. Стероид, используемый в исследованиях в качестве лиганда, должен с высокой аффинностью и специфичностью связываться с рецепторными белками; не подвергаться метаболизму в биопрепаратах из данной ткани; не связываться с транспортными белками крови [Розен, 1981]. Этим условиям удовлетворяют синтетические глюкокортикоиды и наибольшее предпочтение отдаётся Н-Д, который прочно связывается с РГ, характеризуется низкой деградацией и отсутствием связывания с транскортином [Akner 1993].
Для разделения гормон-рецепторных комплексов и несвязавшегося лиганда разработано несколько методических подходов (1.4, табл. 3), каждый из которых имеет свои преимущества в конкретных условиях эксперимента. При определении связывания андрогенов в цитозоле скелетных мышц было показано, что при низком содержании рецепторных белков и высокой концентрации белка в цитозолях непригодны методы, основанные на сорбции гормон-рецепторных комплексов, такие как разделение с помощью гидроксиаппатита или разделение на ДЕАЕ-целлюлозных фильтрах
[Осипова, 1990]. В связи с меньшей трудоёмкостью и большей производительностью в секторе биохимии Санкт-Петербургского НИИФК в экспериментах, связанных с применением радиолигандного метода определения рецепторов стероидных гормонов в тканях-мишенях, наиболее часто использовался метод разделения с помощью АУ. Разделение белок-связанного и свободного радиоактивного лиганда является одним из важных моментов, влияющих на точность измерения количества рецепторов в пробах цитозоля, поэтому была поставлена серия экспериментов с целью сравнения мягких методов разделения белок-связанной и свободной фракции Н-Д методом колоночной гелеэксклюзионной хроматографии (разделение на колонках с сефадексом LH-20 проводилось в соответствии с общепринятыми правилами [Микеш, 1982]) с более жёсткими - сорбцией свободного "Н-лиганда АУ (табл. 6).
