Введение к работе
Актуальность темы. .їзменения интенсивности метаболических реакций э скелетных мьшцах, происходящие во время физической деятельности, отражают вачшые аспекты биохимической адаптации организма. Процессы восстановления после физической нагрузки іііі) включают не только восполнение затраченных энергетических ресурсов, но сопровождаются также изменениями в скорости синтеза и деградации ряда белков мышц. Таким образом, осуществляется обновление состава миофибрилл и образование пула свободных аминокислот, пригодных для синтеза как структурных и ферментных белков мьмд, так и энергетических субстратов. Кроме того, протеазы участвуют в реакциях посттрансляциончой модификации, в процессах регуляции количества ключевых ферментов, необходимых для быстрого восстановления работоспособности организма. Следовательно, протеолитические ферменты играют важную роль в поддержании нормального функционирования мышц при изменениях метаболизма, вызванных &Н. Однако пока неизвестно, какие факторы определяют скорость распада индивидуальных белков и какие ферменты участвуют в их деградации (РогозкинДЭЭО).
В клетках млекопитающих отмечается сосуществование лиэосо-мального и цитоплазматическсго путей распада белка. В скелетных мышцах обнаружено около 20 цитоплазматических протеаз, среди которых достаточно полно охарактеризованы сериновые протеазы, кал-паины и ферменты энергозависимого пути деградации белков ( Bird ct. al., 19SU ). дальнейшие исследования показали, что АТР-зави-симая система реакций протеолиза состоит из нескольких компонентов, включая небольшой по молекулярной массе (8.5 кДа) глобулярный белок убиквитин I Gieohanover, 19S4) - В ходе реакций зтого пути убиквитин сначала присоединяется к белку, предназначенному для деградации, с помощью мультиферментного АТР-эависимого комплекса. Затем происходит энергозависимый распад белка-мппени и освобождение убиквитина. На разрыв одной пептидной связи этим способом требуется две молекулы АТР, столько же, сколько и для ее синтеза (iierahko, Ciecimi.)va", 198G). Активность данного типа протеолиза была обнаружена во мн.тих тканях организма, в том числе в разных типах скелетных кшц v. сердечной мыще (Oer.irl-e, Jen-пізеп, 193?; Par,an еt. al.,19^2; Haas, 1 'j':
твовать в регуляции скорости обмена белков, однако конкретные механизмы измененип активности протеаз не изучены. Так, отмечается увеличение количества связанных с убиквитином белков клетки, а следовательно потенциальных субстратов для АТР-зависимого распада, при голодании, атрофии или деннервации мышечной ткани (Haas, 1990). Таким образом, Ш является удобной моделью для определе-г нкя степени участия данной энергозависимой системы в процессах биохимической адаптации организма к действию различных факторов среды.
Цель работы. Цель настоящей работы заключалась в исследовании влияния ФН различной интенсивности и длительности на активность АТР-зависимого протеолиза, содержание свободного убиквитина и распределение его конъюгатов с белками в различных типах скелетных мышц крыс.
Задачи исследования. I. Развить и охарактеризовать иммунологические методы определения свободного и связанного с белками убиквитина.
-
Определить условия для выявления активности АТР-зависимого протеолиза в скелетных мышцах крыс.
-
изучить величины активности ЛТР-зависимого протеолиза г. содержания убиквитина в скелетных мышцах различного функционального профиля.
-
.Ізучить влияние однократных ФН различной интенсивности и длительности на активность АТР-зависимого протеолиза, содержание свободного убиквитина и распределение конъюгатов его с белками в скелетных мышцах.
-
Лсследовать влияние систематической мышечной деятельности преимущественно аэробной или анаэробной направленности на активность АТР-зависимого протеолиза.
Научная новизна и практическая значимость работы. Обнаружена связь между величиной активности АТР-зависимого протеолиза, содержанием убиквитина и типом миофибрилл, составляющих мышцу. Значения данных показателей в мышцах, содержащих преимущественно оксидативные волокна,, в два раза превышали таковые в волокнах гяиколитического типа. Показано, что конъюгаты убиквитина с белками распределены по молекулярным массам сходным образом в исследуемых типах мышц.
Кроме того, было установлено, что активность определяемого типа распада белков в скелетных мышцах зависит от возраста крыс и имеет наибольшее значение на ранних стадиях формирования животных.
Установлено, что однократные ФН приводят к повышению активности АТР-зависимого протеолиза и изменению уровня конъюгат оз убиквитина с белками. Выявлен небольшой по молекулярной массе (30 кДа) конъюгат з'биквитина, содержание которого зависит от направленности физической работы мышцы. В период отдыха после длительной ФН увеличение общей активности АТР-зависимого протеолиза и плотности иммуноскрашивания белка-конъюгата с молекулярной массой 30 кДа происходит в мышцах, составленных в основном гликолитическими волокнами, а после интенсивной ФН - в мышцах с оксидативными волокнами. Концентрация свободного убиквитина под действием ФН достоверно не изменяется.
Выполнение систематических ФН преимущественно аэробной или анаэробной направленности сопровождается адаптацией ферментов АТР-зависимого протеолиза к изменениям метаболизма в скелетных мышцах. В состоянии покоя не выявлено различий в величине активности АТР-зависимого протеолиза в скелетных мынцах животных, подвергнутых систематической ФН с разной направленностью метаболические процессов.
Практическая значимость работы заключается в разработке чувствительных флуорометрического и флуороиммунного методов для определения активности АТР-зависимого протеолиза и концентрации свободного убиквитина, а также метода "Западного" блотинга для определения спектра конъюгатов убиквитина с белками с последующим их иммуноокрашиванием. Применение данных методов позволит исследовать определяемые показатели не только в скелетных мышцах, но и в других тканях животных.
Положения выносимые на защиту. I. Концентрация свободного убиквитина и хонъюгатов убиквитина с белками зависит от типа составляющих мышцу волокон. Распределение конъюгатов с белками но моле-куляным массам имеет сходный характер в пяточной мьяіцє и белой части четырехглавой мышцы бедра. Активность АТГ-завискмого протеолиза также коррелирует с типом волокон.
2. Обнаруженное после однократной длительной ФИ повышение
активности АТР-завиеимого протеолиза наиболее выражено в глико-литических, а после интенсивной ФН - в оксидативных волокнах.
-
Повышение скорости энергозависимого распада в скелетных мышцах после Ш сопровождается увеличением содержания коньюга-тов убиквитика с белками.
-
Выполнение в течение месяца Ш преимущественно с аэробной или анаэробной направленность» метаболических процессов не сопровождается изменениями активности АТР-зависимого протеолиза в скелетных мышцах животных в состоянии покоя.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на аспирантских конференциях Ленинградского научно-исследовательского института физической культуры в 1988, 1989 гг., Всесоюзной конференции "Биохимия питания спортсменов", Ленинград, 1938, междудном симпозиуме "Питание и физическая работоспособность", Ленинград, 1990, сателлитном симпозиуме 20. конференции ФЕБО, доборо-ко, Венгрия, 1990, 8 международной конференции "Биохимия физических упражнений", Нагойя, Япония, 1991, 15 международном конгрессе по биохимии, Иерусалим, Израиль, 1991.
Публикации. Результаты исследования опубликованы в 3-х статьях и 5-ти тезисах докладов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Работа содержит 116 страниц машинописного текста,10 таблиц и 26 рисунков. Список литературы включает 203 наименования, в том числе 198 на английском языке.
