Введение к работе
Актуальность исследования. Увеличение потребления топлива и смазочных материалов, различных пластических масс и других продуктов нефтехимии и, как следствие, постоянный рост добычи и объемов транспортировки нефти связаны с растущим загрязнением окружающей среды нефтью и нефтепродуктами.
Для ускорения восстановления загрязненных нефтяными углеводородами экосистем необходимо использовать не только технические средства, но и биологические резервы микробных сообществ, так как окисление углеводородов микроорганизмами - это ведущий фактор процесса биодеградации нефти.
В связи с интенсивным развитием нефтегазового комплекса в Южном регионе изучение штаммов микроорганизмов, участвующих в деструкции нефти в экосистемах Азовского и Черного морей, приобретает особую значимость.
До настоящего времени считалось, что основным, практически единственным, путем биологической деградации соединений нефти является ферментативное окисление углеводородов (Van Hamme et al., 2003). Однако для высокомолекулярных и полиароматических углеводородов с пятью и более кольцами, а также смол и асфальтенов, не известны механизмы ферментативной деградации, в лучшем случае, описан феномен их кометаболизма.
В последние годы постепенно накапливались данные о том, что микроорганизмы могут производить активные формы кислорода, которые потенциально способны окислять нефтепродукты (van Beilen, Funhoff, 2005; Stephen et al., 2007; Imlay, 2008; Kato et al., 2009). В свете имеющейся к настоящему моменту информации, изучение неферментативных механизмов биодеградации нефти с участием активных форм кислорода и свободных радикалов представляется черезвычайно актуальным. Это поможет глубже понять процессы, протекающие при биоремедиации, и использовать их при борьбе с нефтяными загрязнениями наиболее эффективным образом.
Цель работы: исследовать динамику бактериоценозов нефтеокисляющих микроорганизмов в Керченском проливе после аварии танкера «Волгонефть- 139» в ноябре 2007 г. и изучить роль процессов свободнорадикального окисления в микробиологической деградации нефти.
Задачи исследования:
выделение и идентификация чистых культур нефтеокисляющих микроорганизмов из проб воды и донных отложений, отобранных на месте аварии танкера в Керченском проливе, а также в зоне загрязнения акватории Азовского моря нефтепродуктами (нефть, мазут, дизельное топливо, льяльные воды) и определение уровня биодеградации различных фракций нефти выделенными штаммами нефтеокисляющих микроорганизмов;
оценка количественных изменений бактериоценозов нефтеокисляющих микроорганизмов в Керченском проливе и прилегающих акваториях Черного и Азовского морей в период с ноября 2007 года по июнь 2008 года включительно;
определение уровня свободнорадикальных процессов и антиоксидантной защиты методами хемилюминесценции и в системе биологической детекции с биосенсором E. coli MG1655 (pSoxS-lux), а также активности ферментов антиоксидантного комплекса (каталазы и супероксиддисмутазы) нефтеокисляющих микроорганизмов, выращиваемых в присутствии и в отсутствии нефти;
исследование влияния различных антиоксидантов на биодеградацию нефти выделенными штаммами нефтеокисляющих микроорганизмов;
изучение путей биодеградации соединений нефти, для которых неизвестны ферментные системы утилизации, в процессе инкубации с исследуемыми нефтеокисляющими микроорганизмами.
Научная новизна результатов. Впервые исследован и описан неферментативный путь биодеградации соединений нефти с участием активных форм кислорода.
Впервые описан феномен ингибирования антиоксидантами микробиологического окисления нефти, что служит прямым доказательством участия активных форм кислорода в микробиологической деструкции нефти.
Исследована и количественно охарактеризована биодеградация различных фракций нефти (углеводородов, смол и асфальтенов) 14 штаммами нефтеокисляющих микроорганизмов.
Исследована и количественно охарактеризована индукция супероксиддисмутазы некоторыми углеводородами у штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов Achromobacter xylosoxidans и Acinetobacter calcoaceticus.
Исследована динамика изменений бактериоценоза нефтеокисляющих микроорганизмов в течение длительного периода (более 10 месяцев) на месте аварии танкера «Волгонефть-139» в Керченском проливе и на прилегающих акваториях Азовского и Черного морей.
Научно-практическая значимость работы. Из воды и донных отложений Керченского пролива выделено 14 штаммов, относящихся к 8 видам нефтьдеградирующих микроорганизмов.
Создана плотная селективная питательная среда и получен патент на изобретение № 2415919 «Способ выделения нефтеокисляющих микроорганизмов из окружающей среды».
Отобраны активные штаммы нефтеокисляющих микроорганизмов, которые можно применять для биоремедиации нефтяных загрязнений. Два наиболее активных деструктора углеводородов нефти из выделенных штаммов бактерий - Achromobacter xylosoxidans № 4 и Acinetobacter calcoaceticus № 13 приняты на национальное патентное депонирование во Всероссийскую Коллекцию Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП «ГосНИИГенетика» под регистрационными номерами ВКПМ В-10344 и ВКПМ B-10353.
Подготовлены рекомендации по использованию нефтеокисляющих бактерий Керченского пролива для получения препарата для борьбы с нефтяным загрязнением на Юге России.
Создана база данных по нефтеокисляющим микроорганизмам Керченского пролива (таксономическая принадлежность, биохимические свойства).
В результате проведенных исследований заложены теоретические основы нового подхода к изучению процесса биодеградации нефти и предложена схема путей свободнорадикальной биодеградации как легких, так и тяжелых фракций нефти (углеводородов, смол и асфальтенов).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
-
В воде и донных отложениях Керченского пролива присуствуют микроорганизмы - нефтедеструкторы, относящиеся к видам Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas anguilliseptica, Micrococcus luteus, Kocuria rosea, Kocuria rhizophila, Shewanella putrefaciens, Exiguobacterium undae. Наиболее активными нефтедеструкторами из 14 выделенных штаммов являются два: Achromobacter xylosoxidans № 4 и Acinetobacter calcoaceticus № 13.
-
После аварии танкера «Волгонефть-139» в ноябре 2007 г. отмечен интенсивный процесс микробиологической трансформации углеводородов, что подтвеждает высокая численность нефтеокисляющих бактерий, зарегистрированная в поверхностных горизонтах воды в Таманском заливе и в районе косы Тузла. Титр нефтеокисляющих микроорганизмов в поверхностных горизонтах воды Керченского пролива оставался достаточно высоким до мая 2008 года и несколько снизился только летом. Осенью показатели численности нефтеокисляющего бактериоценоза оставались практически неизменными, что свидетельствует о длительном характере процессов биодеградации нефтепродуктов после данной аварии.
-
Культивирование изучаемых штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов Acinetobacter calcoaceticus на среде, содержащей нефть в качестве единственного источника углерода, приводит к увеличению содержания в клетках как прооксидантных веществ, так и антиоксидантов, а выращивание нефтьдеградирующих микроорганизмов Achromobacter xylosoxidans и Acinetobacter calcoaceticus в среде, содержащей декан, гексадекан и сырую нефть, приводит к значительной индукции супероксиддисмутазы.
-
Культивирование штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter calcoaceticus и Bacillus subtilis ВКПМ В-1895 с антиоксидантами (аскорбиновая кислота, маннитол, а-токоферола ацетат и ионол) подавляет биодеградацию нефти, в отдельных случаях вплоть до практически полного ее ингибирования.
-
В дополнение к ферментативному, существует свободнорадикальный путь биодеградации соединений нефти. При этом могут происходить процессы, сходные с перекисным окислением липидов.
Апробация работы. Результаты диссертации доложены на Всероссийской конференции «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2009); III Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009); Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2009. Современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущино, 2009); Научно-практической конференции грантодержателей Российского фонда фундаментальных исследований и администрации Краснодарского края «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» (Краснодар, 2009); Международной конференции «Антропогенная трансформация природной среды» (Пермь, 2010); 4-й Международной телеконференции «Фундаментальные науки и практика» (Томск, 2011); 5-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2011); IV Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2011) и Ученых Советах НИИ биологии ЮФУ
Конкурсная поддержка работы. Автор как ответственный исполнитель участвовал в работе по гранту № 2.1.1/5232 «Исследование свободнорадикальных механизмов биодеградации углеводородов» аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 годы)».
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, среди которых 6 статей в изданиях, рекомендованных ВАК, 1 патент и 1 электронная база данных по нефтеокисляющим микроорганизмам.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 178 страницах печатного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложений; содержит 15 таблиц, 11 рисунков. Приложения включают 28 таблиц и 14 рисунков. Список литературы включает 197 источников, из них 125 на иностранных языках. Структура исследований приведена на Рис. 1.
Автор выражает глубокую признательность за помощь в работе и научные консультации к.б.н., доценту М.А. Сазыкиной.
Рис. 1. Структура исследований.
Похожие диссертации на Роль процессов свободнорадикального окисления в микробиологической деградации нефти
-
