Введение к работе
Актуальность работы
Значительная часть исследований на эмбриональных стволовых клетках (ЭСК) посвящена выяснению механизмов дифференцировки и репрограммирования из дифференцированного состояния в плюрипотентное с целью создания фундаментальной базы для разработок новых биомедицинских технологий. Активно обсуждаются перспективы использования ЭСК для терапевтического клонирования и получения в условиях in vitro большого количества специализированных клеток для лечения наследственных и дегенеративных заболеваний, продления жизни человека (Colman, King, 2000; Wakayama et al., 2001; Caplice, Gersh, 2002; Chen et al., 2003; Hochedlinger, Jaenisch, 2003, 2006).
К настоящему времени сформировались четкие представления о молекулярно-генетических системах, экспрессия которых тесно связана с сохранением плюрипотентного потенциала ЭСК, а также факторах среды, регулирующих эти процессы. Несмотря на достижения в области молекулярной биологии, остаются не решенными две основных проблемы; 1) поддержание плюрипотентного потенциала ЭСК in vitro и 2) индукция дифференцировки в клетки определенного фенотипа.
Главная задача состоит в том, чтобы научиться получать in vitro популяции ЭСК, обогащенные определенными типами функционально активных клеток. Решение этой задачи связано с разработкой эффективных методов по отсортировыванию клеток нужного фенотипа от клеток с другим типом дифференцировки, а также недифференцированных предшественников, которые могут нести потенциальную угрозу образования опухолей в организме реципиента. Однако до сих пор не обнаружено соединений, оказывающих индуцирующее действие на все клетки одной популяции ЭСК и заставляющих их дифференцироваться в одном направлении.
Поиск специфических индукторов дифференцировки и активаторов роста ЭСК продолжается и в настоящее время. Как правило, для этой цели применяют различные приемы культивирования, а также индукторы химической природы, в том числе факторы роста и цитокины, блокаторы и активаторы сигнальных путей, факторов транскрипции (Wobus et al., 1997; Гривенников, Мануйлова, 2003; Мануйлова и др., 2003). Ионному составу сред не уделяется должного внимания, хотя в последние годы в этих исследования наметился прогресс, в связи с изучением роли ионов кальция и кальциевых каналов в процессах развития ЭСК (Quinlans et al., 2003; Асташкин и др., 2005; Lin et al., 2005; Loeb et al., 2005; Zahanich et al, 2005). Ионы Ca2+ как вторичные мессенджеры являются теми ионами, концентрация которых оказывается высокоэффективным сигналом для запуска дифференцировки, пролиферации и прохождения G\ стадии клеточного цикла (Rubin et. al., 1976; Kamineet. al., 1976; Осипенко и др., 2006, 2007).
Фактором неинвазивного влияния на процессы клеточной пролиферации и
з >А
дифференцировки являются слабые магнитные поля (МП), в частности, «нулевое» МП или же комбинированное МП со сверхслабой переменной компонентой, настроенной на резонансные условия для спинов ядер водорода. Действие таких МП детально исследовано в основном на моделях примитивно организованных беспозвоночных животных - планариях (Леднев и др., 1996; Новиков и др., 2007; Леднев и др., 2007; Novikov et al., 2008). Однако остается открытым вопрос о том, могут ли слабые МП влиять на ранний эмбриогенез, а также развитие ЭСК млекопитающих in vitro. Поэтому нам представлялось весьма интересным изучить возможность воздействия таких полей на процессы пролиферации и дифференцировки ЭСК и ранних зародышей.
Цель исследования
Основной целью настоящей работы было исследование роли ионов кальция в регуляции пролиферативной активности и дифференцировки плюрипотентных клеток мыши и человека, а также эффектов слабых МП на процессы дифференцировки этих типов клеток в культуре in vitro.
Задачи исследования
Оценка пролиферативной и метаболической активности ЭСК при изменении вне- и внутриклеточной концентрации ионов кальция.
Исследование фосфоинозитольной сигнальной системы в регуляции процессов развития ЭСК в культуре.
Выявление типа и направления дифференцировки ЭСК в зависимости от концентрации цитоплазматического кальция.
Подбор и оптимизация условий для культивирования ЭСК и ранних зародышей в экспериментах с использованием слабых МП.
Исследование морфофункциональных характеристик ЭСК и ранних зародышей при развитии в слабых МП. Оценка возможности использования таких МП для индукции процессов цитодифференцировки in vitro.
Научная новизна и практическая значимость работы
Установлено, что шпорипотентные линии ЭСК мыши и человека различаются по своей зависимости от содержания свободного кальция в среде культивирования. Однако эти виды объединяет одно общее свойство - способность к пролиферации при значительном снижении (10"5 М) концентрации кальция в среде культивирования и переход к суспензионному типу развития, что является характерным для иммортализованных линий соматических клеток.
Показано, что фосфоинозитольная сигнальная система является доминирующей для поддержания высокого уровня пролиферативной и метаболической активности ЭСК человека в
условиях in vitro. Спонтанная дифференцировка ЭСК человека при развитии в колониях повторяет события раннего эмбриогенеза, связанные с эпителиалыю-мезенхимальным переходом и последующей дифференцировкой в фибробласто-подобные нестин-позитивные клетки, являющиеся производными эмбриональной нейроэктодермы. Показано, что в колониях ЭСК человека все три типа эпителиальной, мезенхимальной и фибробластной морфологии различаются как по клеточным маркерам, так и исходной концентрации внутриклеточного кальция и активности Са2+-транспортирующих систем. Эти результаты могут представлять интерес для идентификации и отбора ЭСК с определенным типом дифференцировки для последующего использования в медицинских целях.
Установлено, что 250-ти кратное экранирование геомагнитного поля («нулевое» МП, 0.2 мкТл) является биологически активным фактором, негативно влияющим на эмбриональные клетки и, в целом, на процессы раннего эмбриогенеза. В «нулевом» МП нарушаются барьерные свойства плазматических мембран, происходит реорганизация цитоскелета, что приводит к гибели зародышей на ранних стадиях развития. Эти данные свидетельствуют о важной роли геомагнитного поля в обеспечении процессов регуляции эмбриогенеза млекопитающих.
Впервые установлено, что ЭСК человека могут размножаться колониями и дифференцироваться под влиянием комбинированного МП со сверхслабой переменной компонентой, настроенной на резонансные условия для спинов ядер атомов водорода. Выявлено индуцирующее действие такого магнитного поля на процессы нейроэктодермальной дифференцировки in vitro. Метод культивирования ЭСК человека в комбинированном магнитном поле со сверхслабой переменной компонентой, настроенной на резонансные условия для спинов ядер водорода может быть использован для получения нейроэктодермальных клеток для регенеративной медицины и трансплантологии.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены в виде устных и стендовых докладов на 10, 11 и 12 Международных школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006-2008), на Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006), на 2-ом съезде общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007), на Британско-Российском симпозиуме "Stem cells: Policy, Research, and Innovations. European Union - Russian Federation Perspectives" (Москва, 2007).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них две статьи в реферируемых журналах, 7 тезисов докладов на международных и отечественных конференциях.
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов, заключения и списка цитируемой литературы. В диссертации приведены 2 таблицы и 30 рисунков, список цитированных работ включает 194 источника.
