Введение к работе
Актуальность проблемы. Сукцинатдегидрогеназа (СДГ, КФ 1.3.99.1) обеспечивает выполнение нескольких важнейших функций. Фермент обеспечивает протекание реакций цикла трикарбоновых кислот, который, как известно, поддерживает энергетический баланс клетки. Катализ ферментов окисления сукцината до фумарата необходим не только для протекания цикла Кребса, но и является важной реакцией одного из этапов глюконеогенеза. СДГ является уникальным ферментом, который одновременно обеспечивает функционирование, как дыхательной цепи митохондрий, так и цикла трикарбоновых кислот. Регуляция сукцинатдегидрогеназной активности на экспрессионном уровне осуществляется
под действием факторов транскрипции, кроме того важную роль в этом процессе
2+
играют различные вторичные мессенджеры, такие как Са , G-белки, ц-АМФ. В последнее время значительный интерес исследователей был сосредоточен на важной роли универсального посредника двухвалентного иона кальция (Ca2 ) в механизмах передачи внутриклеточных сигналов, начиная с восприятия начального стимула и заканчивая окончательным адаптивным ответом. Многочисленные наблюдения свидетельствуют, что концентрация кальция, в основном цитозольная, изменяется в ответ на множество абиотических или биотических стрессов (Kudla et al. 2010; McAinsh and Pittman, 2009; Ng and McAinsh, 2003; Sanders et al., 2002; Schroeder et al., 2001; Scrase-Field and Knight, 2003; White and Broadley, 2003). Большой интерес вызывает роль ионов кальция и других факторов, оказывающих действие на экспрессию генов сукцинатдегидрогеназной системы. Особое место в механизме влияния вторичного мессенджера кальция на ферментативную активность сукцинатдегидрогеназы занимает его внутриклеточный транспорт, в частности, перемещение из цитоплазматических и других фондов в ядро для создания действующей концентрации этого иона. Малоизученными остаются вопросы трансдукции фитохромного сигнала, активирующего сукцинатдегидрогеназную активность в растениях, а также реализация стрессовых стимулов (пищевая депривация, аллоксановый диабет и др.), вызывающих активирование глюконеогенеза и повышение активности сукцинатдегидрогеназы в животных клетках. В связи с этим необходимы исследования биохимических механизмов, осуществляющих экспрессионную регуляцию сукцинатдегидрогеназы в растениях и животных в стрессовых условиях. Отдельного внимания требует изучение роли внутриядерных транскрипционных факторов, индуцируемых изменением концентрации кальция и обуславливающих скорость образования энзима сукцинатдегидрогеназы.
Цель работы. Целью данной работы являлось исследование роли ионов кальция и транскрипционных факторов в регулировании активности сукцинатдегидрогеназы при адаптивной реакции метаболизма в клетках растений и животных.
В соответствии с заданной целью были поставлены следующие задачи:
-
Получить с помощью многостадийной очистки электрофоретически гомогенные препараты сукцинатдегидрогеназы из листьев Zea mays L., Arabidopsis thaliana L. и печени Rattus rattus L. и исследовать с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-200 и денатурирующего электрофореза четвертичную структуру фермента.
-
Изучить возможное прямое действие различных концентраций двухвалентных катионов кальция на функциональную активность препаратов сукцинатдегидрогеназы из животных и растительных объектов.
-
Выяснить роль катионов кальция в биохимическом механизме трансдукции фитохромного сигнала в листьях кукурузы и арабидопсиса.
-
Исследовать действие специфического нигибитора ионных каналов - рутения красного и хелатирующего блокатора ЭГТА на изменение концентрации кальция в ядерной фракции растений под действием стрессовых факторов.
-
Установить возможную коррелятивную зависимость между величиной концентрации ионов кальция и экспрессией гена, кодирующего транскрипционный фактор PIF3 у растений.
-
Исследовать скорость функционирования сукцинатдегидрогеназы в печени крыс и ее изоферментный состав в норме и при пищевой депривации.
-
Изучить зависимость между изменением концентрации двухвалентных ионов кальция и экспрессией гена, кодирующего сукцинатдегидрогеназу, в печени крыс в норме и при пищевой депривации.
Научная новизна. Полученные данные углубляют знания о структурных характеристиках сукцинатдегидрогеназы из растений и животных. Показано, что катионы Са2+ являются посредником в реализации ответа на сигнал от стресс- индуцирующих факторов. Изменение содержания кальция в ядрах клеток растений Zea mays L. и Arabidopsis thaliana L. вызывает активацию фитохром- индуцирующего фактора PIF3, осуществляющего контроль уровня экспрессии гена субъединицы А сукцинатдегидрогеназы. Установлено, что в условиях пищевой депривации изоферментный состав сукцинатдегидрогеназы постоянен и представлен одной формой. В трансдукции внутриклеточного сигнала, вызванного депривацией, принимают участие катионы кальция, активирующие транскрипцию гена sdha посредством ядерных факторов транскрипции. Показано, что индукция активности СДГ в условиях пищевой депривации обусловлена увеличением скорости ее синтеза.
Практическая значимость. Получение электрофоретически гомогенных препаратов исследуемого энзима может использоваться в научно- исследовательских лабораториях, как вспомогательный фермент при каскадном способе определения других ферментов. Кроме того, препараты СДГ можно применять для аналитического определения концентрации янтарной кислоты в биологических образцах. Использование чистых препаратов фермента может найти применение в пищевой промышленности при исследовании качества продуктов.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, по физиологии растений, по спецкурсам по энзимологии, биоэнергетике, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Положения, выносимые на защиту.
-
-
На гомогенных препаратах сукцинатдегидрогеназы, очищенных из арабидопсиса, кукурузы и печени крыс, показано, что исследуемый энзим является гетеротетрамером, состоящим из четырех различных по молекулярной массе субъединиц.
-
На высокоочищенных препаратах сукцинатдегидрогеназы было показано, что Ca2+ в физиологических концентрациях не оказывали прямого регулирующего действия на ферментативную активность фермента.
-
В механизме трансдукции фитохромного сигнала в листьях кукурузы и арабидопсиса играет важную роль кальциевая сигнальная система. Внутриядерная реализация фитохромного сигнала обеспечивается транскрипционным фактором PIF3, индукция экспрессии которого коррелирует с изменением концентрации катионов кальция.
-
Пищевая депривация вызывает усиление активности сукцинатдегидрогеназы в печени крыс. Установлено, что при этом наблюдается внутриклеточное перераспределение Са2+, обеспечивающее его накопление в ядрах клеток печени. В трансдукции внутриклеточного сигнала, вызванного депривацией, принимают участие катионы кальция, активирующие транскрипцию гена sdha.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 14-ой международной Пущинской конференции молодых учёных «Биология - наука 21-ого века» (Пущино, 2010); Международной научной конференции «Ломоносов-2011» (Москва, 2011); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011); IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011); VI съезде общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных технологий» (Нижний Новгород, 2011); межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина "Организация и регуляция физиолого- биохимических процессов" (Воронеж, 2011, 2012, 2013).
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 11 публикациях - 8 статьях и 3 тезисах.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах
Похожие диссертации на Роль ионов кальция в экспрессионной регуляции сукцинатдегидрогеназы при адаптивной реакции клеточного метаболизма у растений и животных
-
