Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы "фосфолипаза d растений" 8
1.1. Введение 8
1.2. История исследования фосфолипазы D растений 8
1.3. Реакции, катализируемые фосфолипазой D. Гидролазная и
трансферазная активности фермента 11
1.4. Методы исследования фосфолипазы D 13
1.5. Распространение фосфолипазы D среди низших и высших растений 15
1.6. Тканевое и внутриклеточное распределение фосфолипазы D 16
1.7. Свойства фосфолипазы D 21
1.8. Регуляция активности фосфолипазы D в условиях in vivo 35
1.9. Физиологическая роль фосфолипазы D растений 39
1.10. Практическое значение растительной фосфолипазы D 51
1.11. Заключение 52
Экспериментальная часть 54
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 54
2.1. Объекты исследования 54
2.2. Реактивы и материалы 57
2.3. Приборы и оборудование 57
2.4. Приготовление пластинок для микро-ТСХ 58
2.4.1. Приготовление силикагеля для микро-ТСХ 5 8
2.4.2. Получение золя кремневой кислоты 58
2.4.3. Приготовление пластинок 58
2.5. Разделение липидов методом микро-ТСХ 59
2.6. Обнаружение липидов на хроматограммах 59
2.6.1. Неспецифическое обнаружение веществ на хроматограммах 59
2.6.2. Специфическое обнаружение веществ на хроматограммах 60
2.6.2.1. Приготовление универсального молибдатного реагента (УМР) 60
2.6.2.2. Молибдатный реагент для обнаружения фосфолипидов на хроматограммах 60
2.6.2.3. Обнаружение фосфолипидов реагентом на основе малахитового зеленого 60
2.6.2.4. Обнаружение фосфолипидов и других веществ со свободной аминогруппой 61
2.6.2.5. Обнаружение холинсодержащих соединений 61
2.7. Разработка реагента для обнаружения и быстрого разложения фосфолипидов на пластинках для микро-ТСХ 61
2.7.1. Рекомендуемая процедура 62
2.8. Количественное определение фосфолипидов 62
2.9. Выделение фосфатидилхолина из яичных желтков 63
2.10. Определение активности фосфолипазы D 64
2.10.1. Трансферазная активность 64
2.10.2. Гидролазная активность 65
2.11. Поиск ингибиторов и активаторов фосфолипазы D в побегах растений 65
ГЛАВА 3. Определение активности фосфолипазы D в растениях 67
3.1. Быстрый способ разложения фосфолипидов на ТСХ-пластинках 68
ГЛАВА 4. Распространение фосфолипазы D в крупных таксонах растений 77
ГЛАВА 5. Фосфолипаза D покоящихся семян покрытосеменных растений 82
ГЛАВА 6. Участие фосфолипазы D в физиологических процессах у растений 90
6.1. Влияние поражения растений повиликой (Citscnta japonica Choisy) на активность фосфолипазы D в них 91
6.2. Фосфолипаза D прорастающих семян 97
6.3. Изменение активности фосфолипазы D в побегах растений в течение вегетационного периода 102
ГЛАВА 7. Ингибиторы и активаторы фосфолипазы D в побегах растений 110
Заключение 116
Выводы 118
Литература
- История исследования фосфолипазы D растений
- Приготовление пластинок для микро-ТСХ
- Быстрый способ разложения фосфолипидов на ТСХ-пластинках
- Влияние поражения растений повиликой (Citscnta japonica Choisy) на активность фосфолипазы D в них
Введение к работе
Фосфолипаза D (фосфатидилхолин-фосфатидилгидролаза, НФ 3.1.4.4.) является одной из четырех фосфолипаз, способных расщеплять сложноэфирные связи в молекулах глицерофосфолипидов (рис. 1). фосфолипаза Ai Ч\. О фосфолипаза А2 | \ СН2—О+С—R1 R2—сЧ-о—с—н о
О СН2—0-(-Р + О—СН2— СН2— N(CH3)3 /1\ фосфолипаза С фосфолипаза D
Рис. 1. Связи в молекуле фосфатидилхолина, атакуемые фосфолипазами.
Особенностью этого фермента, отличающей его от других фосфолипаз, является трансфосфатидилазная активность - способность переносить фосфатидильную часть молекулы на акцептор, содержащий гидроксильную группу. Образование фосфатидилпроизводных спиртов в результате трансферазной реакции может служить убедительным доказательством присутствия фермента в биологических образцах и нашло применение для определения его активности [1]. Благодаря трансферазной активности фосфолипазу D используют как "инструмент" для получения редких фосфолипидов и фосфатидилпроизводных различных соединений [2].
Фосфолипаза D впервые была обнаружена в растениях [3] и долгое время ее исследовали как фермент этой группы организмов. Однако позже выяснилось, что фосфолипаза D широко распространена в природе. В 60-70-е годы этот фермент был найден в бактериях [4, 5], красной микроводоросли [6], тканях млекопитающих [7], слизевике [8], дрожжах [9].
До середины 80-х годов количество работ, посвященных фосфолипазе D, не превышало десятка-полутора в год, большинство из них относилось к ферменту из растений. Ситуация резко изменилась во второй половине 80-х, когда число публикаций, обсуждающих фермент, быстро достигло нескольких сотен в год и продолжало сохраняться на высоком уровне на протяжении 90-х годов. Однако при этом главным объектом исследований стала фосфолипаза D животных. За последние 10
6 лет появились многие сотни экспериментальных статей и несколько десятков обзоров, освещающих различные аспекты исследований фосфолипазы D. Полагают, что фермент участвует во многих физиологических процессах, обнаружены разнообразные пути регуляции его активности [10-12]. Основную роль для фосфолипазы D животных отводят в передаче клеточных сигналов, что можно видеть из заголовков ряда обзоров [1,13-15].
В настоящее время фосфолипаза D растений привлекает заметно меньшее внимание мировой науки, она оказалась во многих аспектах менее исследованной, чем этот фермент животных. Однако следует напомнить, что многие важные открытия при изучении фосфолипазы D выполнены на препаратах фермента, выделенных из растений [16]. Некоторые авторы рассматривают ее, как ключевой фермент катаболизма фосфолипидов в мембранах растений [17-19]. Возросший интерес к фосфолипазе D животных в 90-е годы отразился также на исследованиях этого фермента из растений, о чем говорит появление в последнее время нескольких обзоров [20-23].
Все сказанное выше говорит о необходимости дальнейших исследований растительной фосфолипазы D. Для России эта проблема особенно актуальна, так как в нашей стране исследованиями фермента в последнее десятилетие занимались очень мало. Ведущий научный коллектив СССР по изучению фосфолипазы D растений, возглавляемый М.М. Рахимовым, оказался ныне за рубежом.
Наше внимание к фосфолипазе D растений привлек не только всплеск интереса к нему в мировой науке, но, главным образом, отсутствие информации или противоречивые литературные данные по многим важным вопросам. Так, хорошо известно, что фермент присутствует в покрытосеменных растениях, но не было четких представлений о его распространении в других отделах высших и низших растений. Физиологическая роль этого фермента в растениях до сих пор не выяснена [24].
Решению вопроса о физиологической роли фосфолипазы D в растениях во многом препятствовало отсутствие знаний о механизмах регуляции активности фермента в живых клетках, хотя возможности регуляции его активности в условиях in vitro известны относительно давно [16].
С целью выяснить распространение фосфолипазы D и ее участие в физиологических процессах у растений мы провели исследования в трех направлениях. Во-первых, проверили, присутствуют ли в других отделах сосудистых растений, кроме покрытосеменных, фосфолипаза D, проявляющая гидролазную активность наряду с трансфертной. Кроме того, на примере семян покрытосеменных растений мы
7 попытались выяснить, существует ли зависимость активности фермента от систематического положения растений на уровне крупных и мелких таксономических единиц. Во-вторых, используя быстрый и надежный метод определения активности фосфолипазы D, модифицированный в ходе этой работы, мы проанализировали изменения активности фермента в растениях при разных физиологический состояниях: при поражении паразитическим растением, при прорастании семян и в ходе развития побегов в течение вегетационного периода. В-третьих, провели предварительный поиск природных регуляторов активности фосфолипазы D. Помимо экспериментальных исследований мы уделили большое внимание сбору информации о фосфолипазе D растений.
История исследования фосфолипазы D растений
В этом разделе в соответствии с темой обзора представлены основные этапы исследования фосфолипазы D растений. Краткая история исследования фосфолипаз D из разных групп организмов изложена в обзоре [27].
Как уже было сказано выше, фосфолипаза D была обнаружена в конце 40-х годов Д. Ханаханом и И. Чайкоффом [3, 32]. Они первыми продемонстрировали, что именно ферментативная активность является причиной снижения уровня азота в фосфолипидах при их инкубировании с водной вытяжкой из растительного материала.
Заметным вкладом в исследовании фермента явилась серия работ, опубликованных в 50-е годы М. Кейтсом [33-38]. Он изучал свойства фосфолипазы D, связанной с субклеточными частицами. М. Кейтс обнаружил, что активатором этого фермента является диэтиловый эфир [33], а затем проверил способность изменять активность фосфолипазы D большого числа органических растворителей и поверхностно-активных веществ [37].
Важным шагом в изучении фосфолипазы D стало открытие, сделанное Ф. Дэвидсон с соавторами [39] и независимо от них Э. Эйнсетом и У. Кларком [40] -активирование фермента ионами кальция. Добавление солей этого металла позволило обнаруживать фосфолипазу D не только в гомогенатах или фракциях частиц, где некоторое количество кальция присутствовало, но и в растворимой фракции или растворах очищенных препаратов фермента [39].
Первую попытку получить очищенную фосфолипазу D предприняли X. Тукей и А. Боллс [41]. Им удалось в 80 раз очистить фермент из семян хлопка. Однако классическим способом очистки этого фермента можно назвать процедуру, предложенную Ф. Дэвидсон и С. Лонг [39] для препарата из листьев капусты. Этот метод или его модификации и сейчас используют в качестве первых этапов очистки препаратов фосфолипазы D. Впервые гомогенный препарат фермента получили М. Хеллер с соавторами [42] из семян арахиса, для чего они использовали другую методику очистки.
Одним из главных событий в истории исследования фосфолипазы D было обнаружение трансфосфатидилазной активности фермента [43], когда в присутствии спиртов в реакционной среде наблюдали образование фосфатидилпроизводного соответствующего спирта (рис. 2).
В течение 20 лет после открытия все исследования фосфолипазы D ограничивались покрытосеменными растениями. Только в 60-е годы канадские исследователи осуществили поиск этого фермента в водорослях [44]. Первая попытка обнаружить фермент в низших растениях была неудачной, но в 1970 году эта же группа опубликовала работу, в которой описали фосфолипазу D из красной микроводоросли [б].
Изучение физиологической роли фосфолипазы D началось с исследования изменений активности фермента в прорастающих семенах, поскольку высокая активность фосфолипазы D была обнаружена во многих покоящихся семенах [45].
Определенный ущерб интересу исследователей к фосфолипазе D нанесла работа П. Рафэна и С. Слэка [46], которые поставили под сомнение существование фосфолипазы D как фермента, имеющего физиологическое значение, и высказали предположение, что это мембранный белок растений, который проявляет ферментативную активность только после разрушения тканей.
Тем не менее, в 70-е и 80-е годы появились работы, обсуждающие катаболическую роль этого фермента в растениях в ходе старения, а также под действием неблагоприятных факторов [47-51]. Более детальное изучение механизмов деградации фосфолипидов в мембранах растений с участием фосфолипазы D проводила группа канадских исследователей под руководством Д. Томпсона. Они показали, что с микросомальными мембранами ассоциирован комплекс гидролаз, последовательно разрушающих фосфолипиды [17,18].
Во второй половине 80-х - начале 90-х годов интерес к фосфолипазе D значительно вырос. Некоторое увеличение числа публикаций было связано с использованием этого фермента, в том числе из растений, в препаративных целях [52, 53]. Однако основным направлением в это время стало изучение физиологической роли фосфолипазы D у животных, поскольку было обнаружено, что фермент участвует в передаче биологических сигналов у этой группы организмов [13, 28].
Хотя в конце 70-х и на всем протяжении 80-х продолжались исследования свойств фосфолипазы D растений с использованием очищенных препаратов этого фермента [54-58], всплеск работ, посвященных изучению растительных фосфолипаз D, приходится на 90-е годы. Это объясняется развитием методов биохимии и молекулярной биологии и, главным образом, появлением новых данных о важной роли этого фермента у животных. Большой вклад в этот процесс вносят американские ученые под руководством К. Вонга. Они выделили ген, кодирующий фосфолипазу D, из семян клещевины и клонировали его [59, 60]. Это позволило им обнаружить новые формы этого фермента [61-63], исследовать его участие и механизмы регуляции в различных физиологических процессах [64-67].
Другим важным стимулом для расширения исследований растительной фосфолипазы D в 90-е годы, стало открытие, что фосфолипаза D, возможно, участвует в передаче клеточных сигналов не только у животных, но и у растений [20].
Из отечественных исследователей наибольший вклад в исследование фосфолипазы D внесли узбекские ученые во главе с М.М. Рахимовым - учеником школы Н.Н. Семенова - И.В. Березина. Более чем за двадцать лет ими проведен большой объем работы в различных направлениях изучения этого фермента: от получения этимологических характеристик [68, 69] и выяснения физиологической роли фосфолипазы D [70] до прикладного ее использования [71].
Приготовление пластинок для микро-ТСХ
Для получения золя кремневой кислоты 25 мл канцелярского силикатного клея разводили дистиллированной водой до объема 500 мл, раствор пропускали через колонку с 100 см3 ионообменной смолы КУ 2x8. Смолу в колонке предварительно отмывали от солей железа и переводили в БҐ-форму 5%-й соляной кислотой, а затем промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод. рН кислого элюата, полученного после пропускания через колонку раствора силикатов, доводили до рН 7,0 исходным раствором силикатного клея. Полученный раствор упаривали в 1,5-2 раза при слабом нагреве на электроплитке в течение 2-3 часов.
В качестве подложки для хроматографических пластинок использовали стеклянные пластинки 6x6 см, вырезанные из использованных фотопластинок, с которых щелочным раствором смывали желатиновый слой. С бывших в употреблении хроматографических пластинок слой силикагеля смывали водой. Вымытые пластинки помещали в стакан с горячей хромовой смесью на 1-2 часа, охлаждали, споласкивали водопроводной и дистиллированной водой и высушивали в вертикальном положении на воздухе. Слой силикагеля закрепляли на пластинках золем кремневой кислоты [220].
Для приготовления пластинок в стаканчик отбирали порцию суспензии силикагеля для микро-ТСХ из расчета 1 мл на одну пластинку, через час-полтора водный слой сливали, а к силикагелго приливали равный объем раствора силиказоля, смесь тщательно перемешивали на магнитной мешалке и наносили пипеткой на пластинки по 1 мл суспензии. Пластинки с нанесенным слоем силикагеля помещали на тщательно выровненную по уровню горизонтальную поверхность и высушивали в течение 12 часов при комнатной температуре. После этого их использовали для хроматографии чаще всего без предварительного активирования или активировали, выдерживая 2 часа в сушильном шкафу при 120 .
Полярные липиды разделяли методом двумерной ТСХ в системе растворителей: хлороформ - метанол - бензол - 28% NH4OH (65:30:10:6, по объему) - 1-е направление и хлороформ - метанол - уксусная кислота - ацетон - бензол - вода (70:30:4:5:10:1) - 2-е направление [221].
Нейтральные липиды разделяли одномерной ТСХ в системе растворителей: гексан - диэтиловый эфир - уксусная кислота (70 : 30 : 1, по объему) [222].
После разделения в системах растворителей хроматограммы высушивали в токе теплого воздуха и опрыскивали 10% (по объему) серной кислотой в метаноле или этаноле и нагревали на электроплитке при температуре 200-240 С. Органические вещества при этом обугливались и давали черные пятна на светлом фоне.
В некоторых опытах неспецифическое обнаружение липидов на ТСХ-пластинках проводили, помещая тщательно высушенные хроматограммы в сосуд с парами иода.
Солянокислый гидразин (0,4 г) растворяли в 14 мл 4 М раствора НС1. Молибдат натрия (10 г) растворяли в 60 мл 4 М раствора НС1. Оба раствора смешивали, смесь нагревали на кипящей водяной бане в течение 15 мин (до полного прекращения выделения пузырьков азота из раствора). После охлаждения к смеси добавляли 14 мл концентрированной серной кислоты и общий объем реагента доводили до 100 мл дистиллированной водой.
Реагент устойчив при хранении в склянке при комнатной температуре неограниченно долгое время.
Один объем УМР растворяли 3 объемами дистиллированной воды. Хроматограммы опрыскивали этим раствором, фосфолипиды проявлялись в виде синих пятен на светлом фоне.
Быстрый способ разложения фосфолипидов на ТСХ-пластинках
Разложение фосфолипидов до неорганического фосфата используют для их количественного определения или обнаружения чувствительными реагентами на основе трифенилметановых красителей, например малахитовым зеленым. При определении количества фосфолипидов их разложение обычно проводят в пробирках, куда снимают зоны силикагеля с хроматограмм, добавляют небольшие количества хлорной кислоты и нагревают пробирки [84]. Каховкова и Одавич [226] предложили разрушать фосфолипиды прямо на ТСХ-пластинках, обработанных серной кислотой, нагреванием при 180С в течение 1 часа. Использование этого метода требует слишком много времени для сжигания. Быстрое разложение фосфолипидов достигали нагреванием хроматограмм, предварительно обильно опрысканных хлорной кислотой, при 250-300С [223]. Недостатком этого способа является испарение больших количеств токсичной и коррозийной хлорной кислоты.
Подбирая оптимальный способ обработки хроматограмм смесей фосфолипидов, мы исходили из необходимости предварительного обнаружения фосфолипидов и последующего их быстрого разложения при нагревании после обработки пластинок сильным окислителем [223]. При этом ставилась задача подобрать такие условия разложения, которые позволяли бы определять количественно образовавшиеся фосфаты удобным методом [84]. Мы старались разработать процедуру, которая бы упростила анализ фосфолипидов и сократила время обработки проб. Разложение фосфолипидов до неорганического фосфата непосредственно на ТСХ-пластинках позволяет исключить манипуляции с каждой пробиркой при добавлении хлорной кислоты, снижает возможные ошибки определения фосфора, связанные с неправильно добавленным объемом хлорной кислоты. При этом также отпадает необходимость в специальном блоке для нагревания пробирок.
Реагент, пригодный для разрушения фосфолипидов на ТСХ-пластинках, должен был отвечать следующим критериям: 1) обнаруживать фосфолипиды, 2) обеспечивать быстрое и полное разрушение фосфолипидов до неорганического фосфата, 3) давать воспроизводимые результаты не уступающие по точности применяемому ранее методу.
Для специфического обнаружения фосфолипидов на ТСХ-пластинках мы использовали реагент для опрыскивания на основе универсального молибдатного реагента [84]. Чтобы сократить время разрушения фосфолипидов брали более сильные по сравнению с серной кислотой окислители - хлорную кислоту и перекись водорода. О полном распаде фосфолипидов судили по исчезновению в ходе нагревания ранее обнаруженных их пятен.
Мы взяли молибдатный реагент за основу для приготовления смеси, позволяющей быстро разлагать фосфолипиды, не только из-за его способности обнаруживать фосфолипиды на хроматограммах. Известно, что соединения молибдена катализируют гидролиз фосфорорганических связей [227, 228]. В ходе опытов мы убедились, что молибдатный реагент способствует разложению фосфолипидов, так как последовательная обработка хроматограмм молибдатным реагентом и хлорной кислотой или их смесями ведет к полному разложению фосфолипидов после нагревания (табл. 6, пп. 2, 6, 7), тогда как взятые поодиночке эти реагенты не разлагают фосфолипиды полностью (табл. 6, пп. 1 и 5). Мы нагревали хроматограммы при более низкой температуре (220-240 С), чем в работе [223] (250-300 С). Возможно, из-за этого даже обильное опрыскивание хроматограмм хлорной кислотой не вело к полному исчезновению пятен фосфолипидов. Из веществ, входящих в состав молибдатного реагента, именно молибдат обеспечивал более глубокое разрушение фосфолипидов (табл. 6, п. 3), а не серная кислота (табл. 6, п. 4). Хотя раствор молибдата в смеси с хлорной кислотой разлагал фосфолипиды хуже, чем смеси на основе УМР.
Перекись водорода дала плохие результаты в качестве окислителя, так как при нагревании сильно повреждался слой силикагеля. Кроме того, значения оптического поглощения для проб с фосфором и холостых (зоны силикагеля, не содержащие фосфолипидов) после использования перекиси были слишком завышенными (рис. 5). Смесь УМР, воды и перекиси водорода не позволяла обнаружить фосфолипиды перед нагреванием (табл. 6, п. 9). Таким образом, наиболее оптимальной оказалась процедура обработки хроматограмм реагентом для опрыскивания на основе УМР и хлорной кислотой с последующим нагреванием пластинок.
Условия разрушения фосфолипидов на ТСХ-пластинках, обработанных молибдатным реагентом и хлорной кислотой, оценивали по величине оптической плотности, которая отражает количество выделившегося из фосфолипидов неорганического фосфата, согласно методу [84]. Пластинки нагревали до прекращения выделения паров хлорной кислоты (3 мин при 170 С и 2 мин при 220 С), или в течение вдвое большего времени (6 мин при 170 С и 4 мин при 220 С) (рис. 3). Нагревание хроматограмм при 170С, вероятно, не обеспечивало полного разрушения фосфолипидов даже в течение б мин, что отражалось на величине оптической плотности зон силикагеля, содержащих ФХ (рис. 3). Двухминутное нагревание при
С также было недостаточным для распада ФХ. Однако нагревание в течение 4 мин при той же температуре приводило к полному разложению ФХ, так что обнаруженная величина оптической плотности для данного количества ФХ соответствовала величине, полученного прежним методом для такого же количества этого фосфолипида.
Влияние температуры (Т) и времени сжигания (t) на величину оптической плотности, выражающую эффективность разложения ФХ.
Хроматограмму опрыскивали молибдатным реагентом, отмечали пятна ФХ, затем опрыскивали НСЮ4 и сжигали при 220С 4 мин. Оптическую плотность определяли, как описано в разделе 2.8. "Контроль" - зоны силикагеля свободные от фосфолипидов, "ФХ" - зоны силикагеля, содержащие одинаковые количества ФХ. Представлены средние арифметические значения 4 повторностей и их стандартные ошибки.
Предварительная обработка хроматограмм молибдатным реагентом и хлорной кислотой может влиять на величину оптической плотности при определении фосфора. На рис. 4 показано, как изменение количества одного из этих реагентов при постоянном количестве другого влияет на этот показатель. Опрыскивание ТСХ-пластинок малым количеством молибдатного реагента приводило к заниженным результатам, тогда как обильное опрыскивание не влияло на величину оптической плотности (рис. 4 а). При обработке хроматограмм хлорной кислотой максимальные значения оптической плотности для ФХ достигались при небольших ее количествах. Обильное смачивание ТСХ-пластинок кислотой вело к некотором} снижению величин оптической плотности (рис. 4 б). Таким образом, для получения воспроизводимых результатов необходимо обильное смачивание молибдатным реагентом для опрыскивания при небольшом количестве хлорной кислоты.
Влияние поражения растений повиликой (Citscnta japonica Choisy) на активность фосфолипазы D в них
В качестве модели для изучения роли фосфолипазы D в процессе заражения растений фитопатогенными организмами мы выбрали удобную, на наш взгляд, систему растение-хозяин, пораженное цветковым паразитом повиликой (Cusciita japonica Choisy). Во-первых, повилика является облигатным паразитом и во взрослом состоянии живет только за счет ресурсов хозяина. Во-вторых, по размерам повилика соизмерима с хозяином, может быть легко отделена от него, что позволяет исследовать паразита и его хозяина отдельно.
Активность фосфолипазы D при поражении растений повиликой уже служила предметом исследований индийских ученых [195]. Они определяли изменения состава липидов при паразитизме повилики Cusciita reflexa Roxb. на четырех видах культурных растений (Medicago sativa L., Helianthus armims L., Pisitm sativum L., Lontana camara L.) и тестировали в них гидролазную активность фосфолипазы D.
В отличие от этих авторов, которые использовали для каждого анализа полностью растения повилики и стебель с черешками растения-хозяина, мы специально измеряли активность фосфолипазы D в местах контактов хозяина и паразита - в области присосок повилики. Другое отличие нашей работы состоит в том, что мы тестировали трансферазную активность фермента. Как уже обсуждали в главе 3, это избавляет от ошибок, связанных с изменениями активности других ферментативных систем, способных влиять на содержание продуктов гидролазной активности фосфолипазы D.
Изменения активности фосфолипазы D при поражении повиликой четырех видов растений показаны на рис. 7. В большинстве случаев активность фермента была более высокой у пораженных растений, причем не только в местах проникновения гаусторий паразита, но и в соседних участках, как это показано для леспедеци (рис. 7 б). Однако все эти различия не были существенными на 0,05 уровне значимости, кроме эксперимента 2 с полынью (рис. 7 г). У ивы и полыни в эксперименте 3 активность фермента была выше в непораженных побегах, чем в пораженных (рис. 7 а и г), причем в последнем случае различия были существенными на 0,05 уровне значимости.
Таким образом, при поражении повиликой у разных видов растений активность фосфолипазы D изменялась неодинаково. Более того, для одного вида растения обнаружены в разных опытах значительные, но противоположные изменения активности фермента. Мы не знаем причины этих коренных различий, хотя можно предположить, что они обусловлены степенью поражения. Вероятно, установить причину помогли бы исследования динамики активности фосфолипазы D у растений-хозяев с начала поражения и в течение продолжительного времени.
Большие различия активности фосфолипазы D в стеблях полыни мы обнаружили и у непораженных паразитом растений (рис. 7 г). Так как мы брали растения из естественных мест обитания, то, возможно, это объясняется отличиями в стадиях развития растений, взятых в каждом из экспериментов, времени сбора, условиями произрастания. Тем не менее, в рамках каждого эксперимента мы брали пораженные и контрольные растения на одной стадии развития, в непосредственной близости произрастания и примерно одинаковые участки стеблей.
Наши результаты отличаются от полученных индийскими исследователями [195], которые выявили простую закономерность: в пораженных растениях активность фосфолипазы D была существенно выше по сравнению с контрольными растениями. Обнаруженная ими более высокая активность подтверждалась увеличением доли ФК среди общих фосфолипидов. Хотя они также не определяли изменения активности фермента в процессе развития патогенеза.
Кроме паразитизма повилики, в литературе также описано влияние бактериального [66, 193] и грибного [193, 194] заражений на активность фосфолипазы D растений- хозяев. Правда, в двух из этих работ [193, 235] активность фосфолипазы оценивали по образованию фосфата, растворимого в кислоте, что отражает возможное действие нескольких фосфолипаз, а также активность других ферментов, например фосфатазы ФК.
При заражении растений табака вирулентными и невирулентными штаммами бактерии Erwinia amylovora происходило значительное выделение фосфата уже через 1-2 часа после инфильтрации, а также накапливался свободный холин [193]. В половинках листьев фасоли, зараженных грибом Uromyces phaseoli, выделение фосфата увеличивалось только на 4-6-е сутки после инокуляции, что, вероятно, связано с развитием болезни [235]. В этом случае нельзя исключать действие собственных ферментов паразита, расщепляющих фосфолипиды, поскольку в незараженных половинках листьев активации фосфолипаз не наблюдали [235].
Неоднозначный характер изменений активности фосфолипазы D обнаружили индийские исследователи [194] при заражении листьев пшеницы расами гриба Риссіпіа recondita. Заражение растений любой из этих рас, различающихся по вирулентности, вело к повышению активности фермента в течение первых суток, которое сменялось сильным снижением на вторые сутки и новым ростом активности к концу третьих суток. .Активность фосфолипазы D была выше при инокуляции растений вирулентными расами по сравнению с невирулентными [194].
С. Янг с соавторами [66] обнаружили усиление синтеза мРНК, кодирующей фосфолипазу D, в результате инфицирования растений риса бактериями Xanthomonas oryzae pv oryzae. Однако при устойчивом взаимодействии паразита и хозяина содержание этих мРНК снижалось на пятые сутки до первоначального уровня, а при восприимчивом взаимодействии они исчезали вместе с гибелью клеток. Повышенный синтез мРНК, кодирующей фосфолипазу D, протекал на фоне усиленного обмена фермента, как было выяснено при определении его содержания иммуноблоттингом [66].
Таким образом, хотя имеющиеся литературные данные демонстрируют увеличение активности фосфолипазы D в растениях, зараженными разными патогенами, динамика этого увеличения зависит от характера взаимодействия паразита и хозяина (устойчивое или восприимчивое) и фазы патогенеза. Это еще раз подтверждает необходимость исследований активности фермента во времени при поражении растений повиликой.
Активность фосфолипазы D повилики в местах присосок варьировала в очень широких пределах (рис. 7). На первый взгляд кажется, что активность фермента у паразита зависела от его активности у хозяина. Действительно, в тех случаях, когда растения-хозяева имели невысокую активность фосфолипазы D, активность фермента в присосках повилики также была ниже (рис. 7 а, б, г) и наоборот (рис. 7 в, г). Однако побеги повилики на стадии созревания семян (рис. 7 а) и во время цветения (рис. 9),
