Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 7
2.1. Становление представлений о клеточной смерти. Типы клеточной смерти ... 7
2.2. Механизмы ПКС 12
2.2.1. Роль протеаз 14
2.2.2. Роль эндонуклеаз 18
2.2.3. Участие протеинкиназ 19
2.3. АФК и их роль в ПКС 20
2.4. Роль митохондрий в ПКС...—... 28
2.4.1. Митохондрии как АФК-генерирующие системы 28
2.4.2. Митохондрии как поставщики апоптогенных факторов 31
2.5. Хлоропласты как энергопреобразующие и сигналпередающие системы. Косвенные данные об участии хлоропластов в ПКС... 33
2.5.1. Фотосинтетическая электронтранспортная цепь. Общие представления 33
2.5.2. Хлоропласты как АФК-генерирующие системы 37
2.5.3. PQ-зависимые ПК хлоропластов 38
2.5.4. Косвенные данные об участии хлоропластов в ПКС 39
2.6. Акцепторы электронов фотосинтетической ЭТЦ и игибиторы
электронного транспорта... 40
2.7. Модели для изучения ПКС у растений... . 42
3. Экспериментальная часть 43
3.1. Цель и задачи исследования 43
3.2. Объекты и методы исследования... .43
3.2.1. Исходные сорта и мутаны гороха, использованные в работе 43
3.2.2. Проращивание гороха и выделение абаксиального эпидермиса листа... 45
3.2.3. ЭПР-спектроскопия 46
3.2.4. Оксиметрия 48
3.2.5. Спектрофотометрия 48
3.2.6. Кондуктометрия 48
3.2.7. Создание анаэробных условий 49
3.2.8. Приготовление гематоксилина Карацци 49
3.2.9. Инфильтрация реагентов 50
3.2.10. Условия инкубации с реагентами 50
3.2.11. Окрашивание препаратов, микроскопия и получение фотографий 51
3.2.12. Статистическая обработка данных 52
3.2.13. Обоснование экспериментальных подходов, использованных в работе 53
3.3. Результаты исследования..55
3.3.1. Подбор условий инкубации 55
3.3.2. Подбор режима инфильтрации 56
3.3.3. Проверка активности ферментов, используемых для создания ана эробных условий в среде инкубации 57
3.3.4. Кондуктометрические опыты 57
3.3.5. Влияние CN"Ha ядерный аппарат клеток эпидермиса из листьев гороха 58
3.3.6. Влияние освещения на Г-индуцированное разрушение ядер в усть-ичных и эпидермальных клетках из листьев гороха 58
3.3.7. Влияние интенсивности света и его спектрального состава на CN~-HH-дуцированное разрушение ядер в устьичных клетках из листьев гороха 61
3.3.8. Влияние антиоксидантов и анаэробиоза на С>Г-индуцированное разрушение ядер в клетках эпидермиса листьев гороха 64
3.3.9. Действие акцепторов электронов на СЇГ-индуцированное разрушение клеточных ядер 69
3.3.10. Влияние ингибиторов фотосинтетического переноса электронов DCMU, DNP-INT и стигмателлина на С>Г-индуцированное разрушение ядер 73
3.3.11. Действие ингибиторов протеинкиназы С и протеаз 75
3.3.12. CNT-индуцированное разрушение ядер в клетках эпидермиса мутантов гороха 76
3.3.12.1. ЭПР-спекроскопия листьев гороха 76
3.3.12.2. Световая микроскопия устьичных клеток 78
3.3.12.3. Действие DCMU и метилвиологена на СТ^Г-индуцированный апоптоз устьичных клеток 78
3.4. Обсуждение результатов... 83
3.5. Выводы... 91
4. Литература 93
- Становление представлений о клеточной смерти. Типы клеточной смерти
- Фотосинтетическая электронтранспортная цепь. Общие представления
- Обоснование экспериментальных подходов, использованных в работе
- Влияние освещения на Г-индуцированное разрушение ядер в усть-ичных и эпидермальных клетках из листьев гороха
Введение к работе
Актуальность проблемы. В клетках животных, растений, грибов, а также у прокариот существует специальный механизм саморазрушения, называемый программированной клеточной смертью (ПКС). Трудно переоценить значение этого процесса для многоклеточных организмов и в том числе для растений. Начиная с ранних стадий эмбриогенеза, ПКС сопровождает организм в течение всей его жизни. Осенний листопад, формирование сосудов ксилемы и флоэмы, иммунный ответ на атаку патогена - лишь некоторые проявления ПКС. У растений механизм ПКС изучен в меньшей степени, чем у животных. Однако имеющиеся данные позволяют судить о наличии универсальных путей в осуществлении этого процесса, хотя у растений существуют и свои уникальные возможности реализации ПКС. Ключевую роль в реализации апоптоза у животных и у растений играют митохондрии как источники АФК и ряда апоптогенных факторов. Не могут ли и хлоропласти, подобно митохондриям, участвовать в ПКС у растений? Результаты настоящей работы позволяют утвердительно ответить на поставленный вопрос.
Цель и задачи исследования. Цель исследования - выяснение роли хлоропластов в апоптозе устьичных клеток эпидермиса листьев гороха.
Задачи исследования:
-
Исследовать влияние ОТ как индуктора ПКС у растений на состояние ядерного аппарата устьичных и эпидермальных клеток нижнего эпидермиса листьев гороха.
-
Выяснить влияние света на ОГ-индуцированное разрушение
Список сокращений и обозначений: АФК- активные формы кислорода, БІТ- 3,5-ди-/ире7и-бутил-4-гидрокситолуол (ионол), БХ — и-бензохинон, ДАД - диаминодурол (2,3,5,6-тефаметил-п-фенилендиамин), ДФИФ - 2,6-дихлорфенолиндофенол, ИА - иодацетамид, MB - метилвиологен, ПКС -программированная клеточная смерть, ТМФД - N,N,N',N'-TeTpaMenui-H-фенилендиамин, ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид, ФС - фотосистема, ЭТЦ - электронтранспортная цепь, DCMU - 3-(3',4'-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевина, DNP-INT - динитрофениловый эфир иоднитротимола, NEM - N-этилмалеимид, PQ - пластохонон
*»ос национальная}
БИБЛИОТЕКА I CMvHMyptfy J
» Щ*ЖЛ
2 ядер.
-
Выяснить влияние антиоксидантов на CN'-индуцированное разрушение ядер.
-
Исследовать влияние акцепторов электронов (MB, менадиона, БХ, ТМФД, ДАД, ДФИФ) на СМ~-индуцированное разрушение ядер в клетках эпидермиса из листьев гороха
-
Исследовать влияние ингибиторов фотосинтетической ЭТЦ (DCMU, DNP-INT, стигмателлина) на CN'-индуцированное разрушение ядер в клетках эпидермиса из листьев гороха.
-
Исследовать влияние ингибитора протеинкиназы С (стауроспо-рина) и ингибиторов протеаз (ИА, NEM, ФМСФ) на CNT-индуцированный апоптоз клеток эпидермиса из листьев гороха.
-
Исследовать влияние CN~, освещения и MB на состояние ядерного аппарата в устьичных клетках из нижнего эпидермиса листьев мутантов гороха, дефектных по ФС II и/или ФС I.
Научная новизна работы. Исследован апоптоз у растений. Предложена удобная модель для изучения роли хлоропластов в апоптозе у растений - ОГ-индуцированный апоптоз клеток нижнего эпидермиса из листьев гороха. CN~ вызывает синхронную массовую гибель клеток: разрушение ядер в эпидермальных и устьичных клетках гороха с промежуточной стадией их фрагментации, характерной для апоптоза. Свет ускоряет CN-индуцированное разрушение ядер, в устьичных, содержащих хлоропласта и митохондрии, но не в эпидермальных клетках, содержащих митохондрии, но не хлоропласта. Антиоксиданты и анаэробиоз подавляют С>Г-индуцированное разрушение ядер в клетках обоих типов. Акцепторы электронов (MB и менадион), восстанавливающиеся компонентами фотосинтетической и дыхательной ЭТЦ и спонтанно окисляющиеся 02 с образованием Ог-", как и БХ, ДАД, ТМФД и ДФИФ, восстановленные формы которых не окисляются (или' окисляются медленно) Ог, подавляют СТ>Г-индуцированное разрушение ядер в устьичных, но не в эпидермальных клетках. ОГ-индуцированное
з разрушение ядер в освещенных устьичных клетках подавляется DCMU, ингибитором транспорта электронов между первичным (QA) и вторичным (Qb) пластохинонами в ФС II хлоропластов, а также DNP-INT и стигмателлином, конкурентными ингибиторами окисления пластохино-ла на участке Q0 й^цитохромного комплекса хлоропластов. Ингибитор протеинкиназ стауроспорин и ингибиторы протеаз NEM, ИА и ФМСФ предотвращают ОГ-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток на свету и в темноте. Полученные результаты позволяют предполагать, что инициация апоптоза устьичных клеток зависит от комбинированного действия двух факторов - АФК и восстановленного пластохи-нона на участке Qo Ь^цитохромного комплекса хлоропластов. В целом, результаты свидетельствуют об участии хлоропластов в ПКС у растений.
Практическое значение работы. Полученные в работе данные -шаг к выяснению механизмов клеточной смерти у растений. Результаты могут быть использованы в лекциях и семинарских занятиях по биохимии, физиологии и клеточной биологии растений, а также косвенно помочь в решении проблемы повышения устойчивости сельскохозяйственных растений к патогенам.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на международной конференции «Физиология растений - наука III тысячелетия» (Москва. 1999): VI Международной конференции аспирантов и студентов по фундаментальным наукам «Ломоносов-99» (Москва, 1999); школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000); Международной конференции «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода» (Пущино, 2000); Международной конференции «Автотрофные микроорганизмы» (Пущино, 2000); V Пущин-ской конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (2001); III съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001); Международной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск, 2001); Международных курсах «Свободные радикалы, оксид азота и
воспаление: молекулярные, биохимические и клинические аспекты» (Турция, Анталия, 2001); III съезде биохимического общества (С.-Петербург, 2002); заседании кафедры физиологии микроорганизмов МГУ (Москва, 2002); на заседании Московского биоэнергетического семинара, возглавляемого академиком В.П. Скулачевым (Москва, 2002).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 13 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 114 страницах, иллюстрирована 25 рисунками и 6 таблицами.
Становление представлений о клеточной смерти. Типы клеточной смерти
По степени разрушения клетки ПКС у растений можно разделить на 3 типа: — селективный (частичный) автолиз содержимого протопласта, способствующий разрушению лишь некоторых органелл и компонентов цитоплазмы (например, разрушение ядра и части цитоплазмы при дифференцировке клеток ситовидных элементов флоэмы), — полный автолиз протопласта, не затрагивающий клеточную стенку, которая при этом может упрочняться за счет лигнификации и образования целлюлозных утолщений (примером такой формы ПКС может служить ксилогенез), — полный автолиз клетки, при котором разрушаются и протопласт, и клеточная стенка (например, при аэренхимогенезе). Морфология ультраструктурных изменений, сопровождающих ПКС у растений во многом сходна с таковыми у животных. Так, образование пузырковидных выступов ЦПМ — характерный для апоптоза признак — является одним из ранних событий при ПКС у растений, ЦПМ отделяется от клеточной стенки. Разрушаются межклеточные десмосомальные контакты — у растений это плазмодесмы, объединяющие протопласты соседних клеток в единую систему — симпласт. Особенно значимо это событие для ПКС при ГО, ведь плазмодесмы могут являться мостиками для беспрепятсвенного перемещения вирусов или бактерий из зараженной клетки в соседние. ПКС растений сопровождается конденсацией хроматина (Не et al., 1996; Koukalova et al., 1997), олигонуклеосомальной фрагментацией ядерной ДНК (Filonova et al., 2000; Schussler and Longstreth, 2000; Gunawardena et al., 2001). Завершающим этапом ПКС у животных является поглощение останков разрушенной клетки, в том числе апоптозных телец, с помощью специальных клеток - макрофагов и нейтрофилов. Растения лишены такой возможности, у них нет таких специализированных клеток, да и клеточная стенка препятствовала бы фагоцитозу. Поэтому автолиз - гидролиз клеточных структур до мономеров — единственно возможный способ завершения клеточного саморазрушения. Образовавшиеся мономеры утилизируются соседними клетками. Исключение составляет ГО. Погибшие клетки могут нести в себе вторгшийся патоген и быть все еще потенциально опасными для соседних клеток. Поэтому финальным шагом при ГО является образование демаркационных, отторгнутых, тканей. Хотя образование апоптозных телец — не характерный, в общем, для ПКС растений признак — однако его можно наблюдать, например, при ксилогенезе и аэренхимогенезе. Апоптозные везикулы у растений в таком случае претерпевают дальнейшее разрушение, подобно, видимо, спонтанному разрушению апоптозных телец у животных in vitro в культуре клеток (Новожилова и соавт., 1996; Jones, 2001).
Уникальной чертой для ПКС растений является существенная роль вакуолей — литических компартментов, подобных лизосомам животных (Henics and Wheatley 1999). Автолиз протопласта или целой клетки осуществляется посредством разрыва вакуолей (Swanson et al., 1998; Kuriyama, 1999; Obara et al., 2001). Активная вакуолизация клетки, образование обширной центральной литической вакуоли - общий признак для всех вариантов ПКС у растений. Однако разрыв вакуоли с последующим автолизом клетки может быть как ранним, так и поздним событием при ПКС у растений. В первом варианте, примером которого может служить ксилогенез, морфологическая картина ПКС напоминает некроз, ибо последствиями раннего автолиза является разрушение мембран, органелл. Во втором варианте, который имеет место при эмбриогенезе, старении, аэренхимогенезе, вакуоль до разрыва может выполнять аутофагию - поглощать цитоплазматическое содержимое. При таком типе ПКС сохраняются органеллы и ЦПМ, что свойственно апоптозу.
Видеосъемка автолиза клеток дифференцирующихся трахеидных элементов показала (Groover et al., 1997), что разрушение вакуоли совпадает с остановкой цитоплазматических потоков (см. http://www.unc.edu/depts/joneslhp/pcd/). Остановку цитоплазмы ряд исследователей предлагает считать моментом клеточной гибели (Jones, 2001; Самуилов, 2001). Цитоплазматические потоки замедляются и останавливаются до разрушения протопласта также при ГО (вследствие инфицирования клеток гифами гриба) и при старении органов растений (Jones, 2001). С другой стороны интактный актиновый цитоскелет необходим для индукции ГО (Heath, 2000). Одним из наиболее быстро индуцируемых белков у растений в ответ на вторжение бактерий является белок цитоскелета — центрин (Cordeiro et al., 1998). Считается, что цитоскелет связан с сигналпередающими системами в клетках растений (Тарчевский, 2002) и его изменения являются частью защитного механизма против грибов и бактерий при ГО. Однако вирусы могут использовать микротрубочки цитоскелета для передвижения от клетки к клетке через плазмодесмы (Heinlein et al., 1995), и в таком случае цитоскелет в большей мере способствует инфицированию растения, а не его защите. Хотя следует заметить, что при внедрении вирусов происходит разрыв плазмодесм (Heath, 2000; Polverari et al., 2000; Самуилов и др., 20006).
ПКС включает ряд последовательных этапов: инициацию, эффекторную фазу и клеточную деструкцию (Depraetere and Golstein, 1998; Самуилов и др., 20006).
На первом этапе клетка получает извне или возникший в самой клетке сигнал к гибели. Если клетка оказалась компетентной к распознаванию поступаемой информации, сигнал воспринимается рецептором (находящимся в цитоплазме или мембраносвязанным) и интерпретируется как летальный. От рецепторов или их сочетания полученный сигнал последовательно передается молекулам-посредникам (мессенджерам) различного порядка, и в конечном итоге, достигает ядра, где происходит активация летальных и/или репрессия антилетальных генов (Mittler et al., 1998, 1999a,b; Hoeberichts et al., 2001). Однако существование ПКС в безъядерных системах (цитопластах — клетках, лишенных ядра) показывает, что наличие ядра не является обязательным для реализации процесса.
Одним из существенных отличий ПКС от некроза, является то, что это регулируемый процесс (Новожилова и др., 1996; Jones, 2001). Проинициированную программу клеточной смерти можно предотвратить (как в фазе инициации, так и в эффекторной фазе), тогда как некроз, начавшийся как неспецифическое разрушение клетки в ответ на деструктивный сигнал, такой регуляции не поддается, является необратимым процессом разрушения клеток. Возможность регуляции ПКС особенно важна в фармакологических исследованиях и позволяет находить способы лечения ряда заболеваний, связанных с нарушением механизма ПКС.
Существуют различные внутриклеточные и внеклеточные, биотические и абиотические, физиологические и фармакологические сигналы, способные влиять на реализацию ПКС. Некоторые из индукторов и ингибиторов апоптоза являются универсальными для растенияй и животных. Так, обработка химическими индукторами апоптоза у животных (камптотецином, стауроспорином, фумозином В) приводила к апоптозу суспензионной клеточной культуры томатов (Lycopersicon esculentum Mill) (De Jong et al., 2000,2002; Asai et al., 2000; Stone et al., 2000). Инициация ПКС. Клетка многоклеточного организма получает множество сигналов: от соседних клеток, из межклеточного объема, из окружающей среды. Какие факторы определяют включение программы гибели? Важным принципом регуляции ПКС как у животных, так и у растений является специфичность к сигналу. Один и тот же агент может в одном случае включать, а в другом - ингибировать ПКС. Так, пониженное содержание 02 в клетках стимулирует аэренхимогенез (Не et al., 1996; Gunawardena et al., 2001), но блокирует ГО в клетках табака (Pennell and Lamb, 1997). NO вызывает ПКС у А. thaliana (Clarke et al., 2000), но подавляет ПКС в листьях картофеля, индуцированной метилвиологеном (Beligni and Lamattina, 1999).
Фотосинтетическая электронтранспортная цепь. Общие представления
Электронный транспорт, осуществляемый при фотосинтезе у высших растений, вовлекает последовательно фотосистему II, цитохромный комплекс и фотосистему I. Между этими надмолекулярными комплексами восстановительные эквиваленты переносят подвижные низкомолекулярные переносчики: пластохинон (PQ) и пластоцианин (PC). В результате работы фотосинтетической ЭТЦ осуществляется перенос электронов от воды к NADP+. Пернос электронов схематически можно изобразить так:
Расположение электронтранспортных комплексов в тилакоидной мембране и их взаимодействие схематически изображены на рис. 3. ФС II — многокомпонентный пигмент-белковый трансмембранный комплекс, функционально представляющий собой светозависимую Н20:пластохинон-оксидоредуктазу. Структурно основу реакционного центра ФС II составляет гетеродимер белков D1 и D2. Перенос электронов в ФС II начинается с возбуждения реакционного центра Р680, димера хлорофилла а. От Р680 электрон переносится через промежуточную молекулу мономерного хлорофилла а и феофитин на молекулу первичного пластохинона QA, прочно связанную с белком D2 ФС И. Затем электрон переносится на молекулу вторичного пластохинона QB. Молекула QB , последовательно приняв 2 электрона от QA захватывает 2ІҐ" из стромального пространства: QB2 + 2Н"1"—QBH2. Гидропластохинон покидает место связывания и диффундирует внутри липидного бислоя тилакоидной мембраны, пополняя фонд восстановленного QP. Место QBH2 В ФС II занимает окисленный хинон мембранного фонда.
Окисленный реакционный центр ФС II Р680+ является сильным окислителем, благодаря чему происходит окисление воды. КВК (кислородвыделяющий комплекс) содержит неорганический кластер МщСаіОх (Renger, 2001; Balaban et al., 2002). Ионы Mn КВК передают электроны на Yz — донор электронов для Р680+. Тирозин Yz входит в состав белка D1, имеется также тирозин YD, входящий в белок D2 (Tang et al., 1996). При этом перенос электрона от Yz на Р680+ происходит в наносекундном диапазоне, в то время как YD окисляется за секунды. В окисленном состоянии оба компонента обладают характерными, различающимися ЭПР-сигналами. В темноте сигнал YD+ (IIsi0w) стабилен часы, сигнал Yz+ (Hvery fast) исчезает за 0,1-5,0 мкс (Miller and Brudvig, 1991).
б Цитохромный комплекс - аналог 6с/-цитохромного комплекса митохондрий — является пластохинол:пластоцианин-оксидоредуктазой. Работа комплекса описывается Q-циклом Митчелла (Berry and Rumberg, 1999). Комплекс имеет 2 участка связывания пластохинона: это участок Q; (MH С), находящийся ближе к строме, и участок Q0 (или г) - со стороны внутритилакоидного пространства. Пластохинол, восстановленный ФС II, связывается с Qo и окисляется, при этом 2НҐ выходят в люмен. Один электрон через FeS-центр Риске (Roberts et al., 2002) и цитохром /поступает на пластоцианин, а другой через гемы b/ и Ьн восстанавливает пластохинон участка Q;.
От А цитохромного комплекса через водорастворимый Си-содержащий белок пластоцианин, способный быстро перемещаться внутри тилакоида, электроны переносятся к ФС I, поступая непосредственно к окисленному реакционному центру Р700. ФС I - пигмент-белковый комплекс, состоящий из 11 (12) субъединиц и содержащий более 100 кофакторов (Fromme et al., 2001; Kuhlbrandt, 2001; Kievit and Brudvig, 2001). Реакционный центр P700 представлен 2 молекулами хлорофилла (Kass et al., 2001). Первичный акцептор электрона от Р700 - молекула хлорофилла а (А0), вторичные акцепторы - молекула филлохинона (АО и 3 FeS-протеина (Fx, FA, FB), у которых в активном центре находятся атомы железа и серы (Fe4S4). Электронный поток осуществляется последовательно Fx —FA —FB (Fromme et al., 2001). В переносе электронов от FB к NADP+ участвуют растворенный в строме белок ферредоксин (Fd) и связанный с мембраной FNR (ферредоксин-МАВР+-редуктаза), функционирующие на внешней стороне тилакоидной мембраны.
Представления о светсобирающих комплексах. Самым первым актом фотосинтеза является поглощение света молекулами специального пигмент-белкового комплекса, называемого светсобирающим комплексом (ССК). ССК -макромолекулярный комплекс, предназначенный для эффективного светосбора и направления энергии возбуждения к реакционным центрам (Ruban et al., 2003). В фотосинтетической ЭТЦ различают ССК I и ССК II, служащие антеннами для реакционных центров ФС I и II, соответственно.
Светсобирающий комплекс фотосистемы I представлен четырьмя белками, связывающими около двух сотен молекул хлорофилла а и тесно взаимодействующими с реакционным центром.
Обоснование экспериментальных подходов, использованных в работе
Для максимального приближения к физиологическим условиям в качестве объекта исследования мы использовали не культуры клеток, как это имеет место во многих работах по ПКС, а эпидермальные пленки из листьев (Самуилов и др., 2000а; Allan and Fluhr, 1997). Преимущества пленок: 1) они представляют собой монослой клеток, что удобно для микроскопических исследований; 2) пленки состоят из клеток двух типов - устьичных (содержат хлоропласты и митохондрии) и эпидермальных (содержат только митохондрии), что позволяет на одном и том же объекте исследовать значение фототрофного и хемотрофного типов питания в ПКС.
В сравнении с естественными индукторами ПКС химические и физические воздействия методически привлекательнее, поскольку вызывают синхронный апоптоз с высоким выходом погибших клеток, что облегчает последующий анализ результатов. Как вариант химического воздействия нами (Самуилов и др., 2000а) применена обработка цианидом. Цианид индуцирует ПКС с характерной для апоптоза животных олигонуклеосомальной фрагментацией ДНК в протопластах и листочках томатов (Wang et al., 1996), а также листьях вигны китайской (Ryerson and Heath, 1996). CN" оказывает множественное действие на метаболизм клетки, являясь ингибитором гемовой кагалазы и пероксидаз, митохондриальной цитохром с-оксидазы и хлоропластной рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы.
Цианид не является соединением, чужеродным для мира растений. Многие растения синтезируют цианогенные гликозиды (амигдалин, прунасин и их изомеры: неоамигдалин, самбунигирин) в качестве защитных метаболитов от патогенных возбудителей, для отпугивания травоядных животных (цианогенные гликозиды - яд для животных), а также как транспортируемые формы восстановленного азота (Banea-Mayambu et al., 2000; Campa et al., 2000; Chiwona-Karltun et al., 2000; Vetter, 2000). При гидролизе этих соединений с помощью соответствующих ферментов высвобождается HCN. Растений, содержащих цианогенные гликозиды, насчитывают по крайней мере 2500 видов (Vetter, 2000). Множество из них принадлежит семействам Fabaceae, Rosaceae, Linaceae, Compositae и др. Цианогенные гликозиды содержаться в семенах яблок, персиков, миндаля, вишни (Campa et al., 2000). Среди цианогенных растений, имеющих большое сельскохозяйственное значение, выделяется маниок Manihot esculenta (Vetter, 2000; Chiwonova-Karltun et al., 2000) — основной источник углеводного питания населения тропических стран. Производство маниока превышает 150 млн т в год. Все ткани этого растения содержат цианогенные гликозиды линамарин и лотаустралин (приблизительно в соотношении 9:1), содержание линамарина в листьях в расчете на 1 кг достигает 5 г.
В настоящее время разработан ряд методов для регистрации ПКС. Чаще других используют электрофоретическое разделение фрагментов ДНК. "Лесенка" ДНК считается классическим признаком апоптоза. Однако "лесенка" не всегда является атрибутом ПКС. Так, апоптоз, индуцированный митохондриальным флавопротеином AIF у животных, не ведет к образованию "лесенки" (Daugas et al., 2000а). Другой распространенный прием — определение каспазной активности, но ПКС возможна и без участия каспаз (Daugas et al., 2000а). Существуют и другие методы, однако все они не дают однозначного ответа. Прямой микроскопический метод наблюдения позволяет получить гарантированную информацию о состоянии клетки и клеточного ядра - структуры, на которую непосредственно направлены процессы апоптоза. У животных апоптоз ведет к разрушению ядра и полному исчезновению клетки в результате фагоцитоза. У растений так же, как и у животных, апоптоз приводит к разрушению и исчезновению клеточного ядра, но клеточная стенка при этом сохраняется или подвергается гидролизу на более поздних стадиях процесса. Таким образом, наличие клеток, утративших ядро, но сохранивших клеточную стенку, позволяет надежно регистрировать клеточную смерть у растений.
Чтобы выбрать оптимальный состав среды инкубации для пленок эпидермиса из листьев гороха, были испытаны следующие растворы: 25 мМ К2НР04 + 50 мМ КС1, рН7,2; 25 мМ Na2HP04 + 50 мМ NaCl, рН 7,2; ЮмМ Tris-HCl + 50 мМ КС1, рН 7,2; 0,9%-ный раствор NaCl (физиологический раствор). Все эти растворы оказались непригодными для длительной инкубации эпидермальных пленок гороха: через 24 ч инкубации в 100% эпидермальных клеток происходило разрушение и исчезновение ядер; в большей или меньшей степени (до 12%) этот процесс затрагивал и устьичные клетки.
Между тем в кусочках эпидермиса, инкубируемых в дистиллированной воде без добавок солей и рН-буферных соединений, ядра в устьичных клетках сохранялись вплоть до 10 суток инкубации. Поэтому инкубацию кусочков эпидермиса в последующих опытах проводили в дистиллированной воде. Разрушение и исчезновение ядер в эпидермальных и устьичных клетках через 24 ч инкубации кусочков эпидермиса в дистиллированной воде обычно не превышало 15 и 0,5%, соответственно.
Тщательному анализу была подвергнута методика фиксации клеток из листьев гороха. Так, наряду с фиксатором Батталья, были испытаны другие фиксаторы: 96%-ный этанол, фиксатор Кларка (96%-ный спирт и уксусная кислота в соотношении 3:1)- все они дали сходные результаты. Равнозначность в применении растворов для отмывания от фиксатора получена при использовании 96%-ного этанола (10 мин) и метода последовательного проводения по спиртам уменьшающейся концентрацией: 4 раза смена 80%-ного этанола по 10 мин, затем 70% - 10 мин, далее 50% - 10 мин, и, наконец, 30% -10 мин.
Для введения реагентов в клетки растений мы использовали метод инфильтрации вакуумированием. Чтобы подобрать наиболее физиологичный режим инфильтрации 2-дневные проростки гороха подвергли 1-, 2-, 3- и 5-минутному вакуумированию в дистиллированной воде. Далее эти проростки вновь высаживали и выращивали вместе с контрольными (необработанными) растениями гидропонным способом в стандартных условиях. Полученные данные представлены в табл. 4.
Влияние освещения на Г-индуцированное разрушение ядер в усть-ичных и эпидермальных клетках из листьев гороха
Мы исследовали апоптоз клеток у растений. Нижний эпидермис листьев гороха, являющийся монослоем клеток, - удобный объект для исследований с использованием световой микроскопии. Наличие клеток двух типов — фототрофных (устьичных) и хемотрофных (эпидермальных) - позволяет сравнивать вклад разных типов метаболизма в наблюдаемый процесс клеточной смерти. У животных завершающим этапом апоптоза является дробление клетки на отдельные везикулы (апоптозные тельца), впоследствии поглощаемые соседними клетками или специализированными фагоцитами. В результате клетка исчезает. У растений дело обстоит по-иному: погибшие клетки надежно детектируются благодаря клеточным стенкам, что удобно при проведении массового анализа.
При выборе инкубационной среды для эпидермальных пленок мы остановились на дистиллированной воде без добавления солей и рН-буферных растворов (раздел 3.3.1). Будучи помещены в дистиллированную воду, клетки животных претерпевают гипотонический шок, набухают, и клеточные стенки, не выдерживая давления поступающей внутрь клетки воды, разрываются. Прочные клеточные стенки бактерий и растений позволяют выдержать большое тургорное давление (давление оказываемое поступившей в клетки водой на клеточные стенки) и предотвращает их разрыв в дистиллированной воде. Известны работы, в которых бактериальные клетки при проведении экспериментов инкубировали в стерильной дистиллированной воде (Fisher et al., 2000). Проблема длительного хранения микроорганизмов сводится к максимальному достижению условий анабиоза, в которых происходит замедление обменных процессов, в том числе процессов, ведущих к разрушению наследчтвенного аппарата. Клетки бактерий сохраняют жизнеспособность при хранении в дистиллированной воде до нескольких лет, в особенности под вазелиновым маслом (Аркадьева, 1989). Сходная ситуация, по-видимому, возникает в эпидермальных пленках, инкубируемых в дистиллированной воде. Клетки могут долгое время пребывать в таком состоянии.
Как регистрировать апоптоз? Существует несколько способов:, выявление с помощью аннексина V появления фосфатидилсерина в наружном монослое плазматической мембраны, регистрация каспазной активности и др. У растений имеются цистеиновых протеазы, участвующие в апоптозе, — метакаспазы. Часто при исследовании апоптоза проводят гель-электрофорез с целью выявления "лесенки" ДНК (раздел 2.2.2). Однако известны примеры апоптоза, не характеризующиеся олигонуклеосомальной фрагментацией ДНК. Применительно к используемому в наших исследованиях объекту — эпидермальным пленкам, состоящим из разнородных асинхронно погибающих клеток, метод представляется непригодным.
Морфологическая картина клеточной смерти, позволившая впервые (Kerr et al., 1972). различить апоптоз и некроз, по сей день остается одним из важнейших критериев при определении наблюдаемого типа клеточной смерти. Одним из характерных признаков апоптоза является конденсация хроматина и дробление ядра на фрагменты. В этом процессе участвуют эндонуклеазы, специфически расщепляющие ДНК. В пленках из эпидермиса листьев гороха при обработке QST, индуктором апоптоза у растений (Wang et al., 1996; Ryerson and Heath, 1996), происходит разрушение ядер эпидермальных и устьичных клеток (Самуилов и др., 2000а,б, 2002). Промежуточной стадией разрушения является характерная для апоптоза фрагментация ядра. Погибающую клетку характеризует нарушение проницаемости мембран и выход из нее ионов в раствор со средой инкубации. В нашей работе для регистрации проницаемости мембран мы предполагали использовать метод кондуктометрии - измерение электропроводности среды инкубации (раздел 3.2.6). Однако метод оказался непригодным, поскольку применяемые в исследовании реагенты (ОТ, MB и др.) создают довольно высокую фоновую электропроводность. Кроме того электропроводность среды инкубации монослойных эпидермальных пленок, удельная масса которых незначительна по отношению к общему объему среды (2 мл), изменяется не существенно, поэтому метод может быть использован только на целых листьях.
Устьичные клетки значительно устойчивее к CN", чем эпидермальные (раздел 3.3.5). Более высокая устойчивость устьичных клеток в сравнении с эпидермальными была продемонстрирована ранее в ответ на обработку листьев табака (Allan and Fluhr, 1997) белковым элиситором криптогеином, продуцируемым Phytophthora cryptogea, субстратом NO-синтазы L-аргинином, салициловой кислотой, ультрафиолетом или ксантином+ ксантиноксидазой в качестве Н202-генерирующей системы. Особое внимание обращает на себя 100%-ное разрушение эпидермальных клеток за 1-2 ч. Быстрое разрушение ядер наблюдали и другие исследователи. Так, 100%-ное разрушение клеточных структур, и в том числе ядер, протопластов из алейроновых клеток ячменя наблюдалось уже через 55 мин после обработки УФ-А и гиберелловой кислотой (Bethke and Jones, 2001). При дифференцировке трахеидных элементов разрушение хроматина в ядрах клеток происходит еще быстрее - за 15 мин (Obara et al., 2001). Причины быстрой гибели эпидермальных клеток могут стать предметом дальнейших исследований. В нашей работе нас более интересовали содержащие хлоропласты устьичные клетки.
Освещение ускоряет С Г-индуцированное разрушение ядер в устьичных, содержащих хлоропласты, но не в эпидермальных клетках (раздел 3.3.6). Действие света возрастает с увеличением его интенсивности (рис. 12). В устьичных клетках мутантов гороха, имеющих нарушения в ФС I и ФС II, свет не вызывал какого-либо эффекта на СЫ -индуцированное разрушение ядер. Данные указывают на зависимость наблюдаемого процесса от функционирования хлоропластов.
На освещение в клетках растений, кроме хлоропластов, могут реагировать также и специальные фоторецепторы - фитохромы, представляющие собой серин/треониновые ПК (Frankhauser, 2000, 2001; Shinomura et al., 2000). Поглощая красный свет, фитохром переходит в активную форму (Рг, Х = 660 нм), способную поглощать дальний красный свет (Pfr, Х» =730 нм). Фитохром Pfr индуцирует в клетке обширный ряд физиологических изменений, а также изменение генной экспрессии. Дальний красный свет способствует обратному переходу Pfr в Рг. Фитохромы, как известно, действуют по принципу «все или ничего». Наблюдаемая зависимость разрушения ядер от интенсивности света указывает на нефитохромный характер протекания процесса. Дополнительные исследования с использованием красных светофильтров показали, что устранение области светового спектра, активирующего фитохром, не вызывало какого-либо эффекта на ОС-индуцированное разрушение ядер в клетках эпидермиса. Эффект света, пропускаемого через красный светофильтр, тоже зависит от его интенсивности (рис. 13). Такое действие света указывает на отсутствие связи наблюдаемого процесса с участием фитохромов и на его обусловленность фотосинтетической активностью хлоропластов.
