Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние десятилетия значительно возрос интерес к биополимерам, активно участвующим во взаимодействиях макро- и микроорганизмов (различные формы симбиоза, инфекции и связанные с ними патологические процессы, иммунный ответ). Гликополимеры клеточной поверхности проявляют широкий спектр биологической активности, в том числе являются основными антигенами клетки и играют ключевую роль в процессах межклеточного узнавания. В практическом плане перспективным оказалось использование биогликанов в качестве компонентов вакцин, адъювантов, противоопухолевых препаратов, неспецифических стимуляторов, а также применение их для решения экспериментальных задач в лабораторных исследованиях и в биопромышленности (Васильев с соавт., 1984; Ryan et al., 2001; Valiante et al., 2003).
Особое внимание уделяется поиску новых природных иммуномодули-рующих веществ, среди которых перспективны микробные полисахариды (ПС) в силу большого разнообразия их строения и свойств. Благодаря способности к многоточечному взаимодействию с поверхностью клеток, полисахаридсодер-жащие полимеры могут обеспечивать выраженную стимуляцию различных этапов иммуногенеза (Feizi, 2000; Medzhitov and Janeway, 2000). В медицинской практике уже применяются препараты на основе бактериальных липополисаха-ридов (ЛПС) - пирогенал, продигиозан, сальмозан; экзополисахаридов (ЭПС) -ксантан, леваны, маннаны; растительных ПС - транслам, зостерин, декстраны, дрожжевой ПС - зимозан, которые значительно повышают устойчивость макроорганизма к бактериальным и вирусным инфекциям и обладают противоопухолевым действием (Хаитов и Пинегин, 2004; Ryan et al, 2001). Широко исследованы механизм и последствия воздействия на организм человека и животных ЛПС патогенных бактерий, так как они являются наиболее мощными индукторами локальной и генерализованной реакций, включая септический шок, что остается одной из серьёзных проблем современной медицины при инфекциях, вызванных грамотрицательными бактериями. В то же время характер и последствия воздействия ЛПС и других ПС непатогенных бактерий на организм человека и животных изучены крайне слабо. Многие микроорганизмы активно экс-кретируют ПС поверхности в окружающую среду, среди них ризобии, бациллы, псевдомонады и азоспириллы, которые широко распространены в природе и в последние годы используются как компоненты бактериальных удобрений (Lucy et al, 2004). Гликополимеры имеют сложную химическую структуру, большое количество функциональных групп и являются медиаторами взаимодействия бактерий с различными объектами, в связи с этим изучение характера их влияния на эукариотические организмы представляется актуальным. Важно это и с точки зрения выявления стимулирующего воздействия малых доз ПС на индукцию неспецифической резистентности макроорганизма.
В связи с этим целью данной работы явилась оценка влияния полисаха-ридсодержащих полимеров бактериального происхождения на функциональ-
ную и метаболическую активность лейкоцитов и ключевых ферментов обмена веществ в организме экспериментальных животных.
Для достижения цели были поставлены и решались следующие задачи:
Выделить ЛПС из внешней мембраны трех видов бактерий рода Azos-pirillum - A. irakense КВС1, A. lipoferum Sp59b, A. brasilense Sp245, Sp245.5, SRI 5 и S17 - и оценить их токсичность по отношению к эукариотическим организмам.
Исследовать влияние ЛПС азоспирилл и ЭПС Paenibacillus polymyxa 1465 in vitro на активность перитонеальных макрофагов мышей при фагоцитозе бактериальных клеток и индукцию основных провоспалительных цитокинов клетками крови человека.
Изучить индукцию медиаторов кислородзависимого и кислороднеза-висимого киллинга в лейкоцитах мышей и человека для оценки их метаболического статуса на фоне действия in vitro ЛПС азоспирилл и ЭПС P. polymyxa 1465.
Оценить пролиферацию спленоцитов мышей в реакции бласттранс-формации лимфоцитов в присутствии полисахаридсодержащих полимеров бактерий.
Установить влияние in vivo ЛПС A. brasilense Sp245 на активность ключевых ферментов белкового, углеводного и липидного обменов в организме белых мышей.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование действия полисахаридсодержащих полимеров ризобактерий in vitro и in vivo на функционально-метаболическую активность лейкоцитов и ключевых ферментов метаболизма в организме экспериментальных животных. Показано, что ЛПС, выделенные с поверхности почвенных ассоциативных бактерий A. irakense КВС1, A lipoferum Sp59b, A. brasilense Sp245, Sp245.5, SR15 и S17, обладают слабой токсичностью по отношению к эукариотическим организмам.
Установлено, что ЛПС азоспирилл и ЭПС P. polymyxa 1465 in vitro значительно стимулируют фагоцитоз бактериальных клеток и метаболические процессы в лейкоцитах мышей и человека. Показано умеренное индуцирующее влияние исследуемых ЛПС азоспирилл на продукцию ведущих провоспалительных цитокинов ИЛ-ір и ФНО-а клетками цельной крови и фагоцитирующими мононуклеарами человека. ЭПС P. polymyxa 1465 преимущественно индуцируют образование ИЛ-10 мононуклеарами и незначительно - ФНО-а.
Впервые показана значительная митогенная активность препаратов ЛПС A. brasilense Sp245, A. irakense КВС1 и A. lipoferum Sp59b в отношении мышиных спленоцитов.
Доказано, что ЛПС A. brasilense Sp245 in vivo не оказывает эндотоксиче-ского действия на протекание белкового, углеводного и липидного обменов у белых мышей, но значительно стимулирует механизмы кислородзависимого киллинга в макрофагах, что позволяет рассматривать этот препарат как потенциальный иммуномодулятор.
Практическая значимость работы. Полученные результаты исследования биологической активности разных по строению бактериальных липо- и эк-
зополисахаридов в отношении эукариотических клеток необходимы для понимания и прогнозирования уровня, характера и последствий воздействия биомакромолекул непатогенных бактерий на организм человека и животных.
Скрининговые данные о биологической активности ряда полисахаридсо-держащих биополимеров в отношении механизмов клеточной резистентности могут быть использованы при выборе наиболее перспективных препаратов для дальнейшего изучения в плане возможного использования в качестве иммуно-модуляторов в медико-биологической практике. Отобраны препараты для дальнейшей химической модификации с целью нивелирования негативных эффектов при сохранении проявленной ими биологической активности. Важным положительным моментом при возможном промышленном производстве препаратов на основе гликополимеров непатогенных бактерий является их полная безопасность для персонала.
По материалам диссертационной работы опубликовано пособие «Методические рекомендации по изучению биологической активности биогликанов в отношении эукариотических клеток» (в соавторстве с С.А. Конновой и В.В. Игнатовым, 2009 г.) для практических занятий студентов старших курсов, а также для работы аспирантов и научных работников, специализирующихся в области биохимии, микробиологии и иммунохимии, рекомендованные Учебно-методической комиссией и одобренные Ученым советом биологического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (протокол № 10 от 1 июля 2009 г.). Результаты диссертационной работы используются в преподавании студентам биологического и химического факультетов СГУ курсов: «Основы гликологии» и «Химия и биохимия углеводов».
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
Гликополимеры ризобактерий (ЛИС бактерий рода Azospirillum и ЭПС P. polymyxa 1465) in vitro активируют процесс фагоцитоза бактериальных клеток, усиливают метаболизм лейкоцитов человека и животных и оказывают умеренное стимулирующее действие на продукцию провоспалительных цитокинов клетками цельной крови и мононуклеарами человека.
ЛИСА brasilense Sp245, A. irakenseKBCl и A. lipoferum Sp59b значительно и дозозависимо стимулируют пролиферативный ответ мышиных спле-ноцитов.
ЛИС A. brasilense Sp245 индуцирует изменение биохимических и гематологических показателей в сыворотке крови белых мышей, не проявляя при этом эндотоксического действия; стимулирует продукцию нитрогенных и ок-сидазных форм радикалов в макрофагах.
Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором и в совместной работе с сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН. Выделение ЛИС азоспирилл выполнено совместно с сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН. Исследования методом хемилюминесценции образования реактивных форм кислорода, постановка ИФА для определения индукции цитокинов клетками цельной крови и оценка полисахарид-индуцированной пролиферации сплено-цитов проведены совместно с сотрудниками лаборатории иммунофармакологии
Государственного НИИ особо чистых биопрепаратов (г. Санкт-Петербург). Эксперименты по определению активности белкового, углеводного и липидно-го обменов в организме белых мышей проведены совместно с сотрудниками биохимической группы ГНУ Саратовской научно-исследовательской ветеринарной станции РАСХН. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей.
Апробация работы. Основные результаты и положения работы представлены на: I и II объединенном иммунологическом форуме (Россия, Екатеринбург, 2004 г. и Санкт-Петербург, 2008); научных конференциях молодых ученых «Исследования молодых ученых и студентов в биологии» (Россия, Саратов, СГУ, 2006, 2008, 2009 гг.); XI и XIII Всероссийских научных форумах с международным участием им. академика В.И. Иоффе (Россия, Санкт-Петербург, 2007, 2009 гг.); I конференции молодых ученых медико-биологической секции Поволжской ассоциации государственных университетов (Россия, Ульяновск, 2007 г.); 4-ой Межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Россия, Саратов, ИБФРМ РАН, 2008 г.); VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Беларусь, Минск, 2008 г.); XLVII Международной научной конференции «Студент и научно-технический прогресс», посвященной 50-летию НГУ (Россия, Новосибирск, 2009 г.); Scientific Conference Biologically active substances: Fundamental and Applied Problems (Ukraine, Novy Svet, 2009 г.).
Работа частично поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований в 2005-2007 гг. № 05-04-48123, руководитель д.б.н., проф. Игнатов В.В.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 работ, из них 2 статьи и 3 публикации материалов конференций в журналах из перечня, рекомендованного Высшей аттестационной комиссией Российской Федерации.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 259 источников, в том числе 109 зарубежных. Работа изложена на 149 страницах, иллюстрирована 14 рисунками и содержит 17 таблиц.
