Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Особенности метаболических процессов и адаптация животных в антенатальный период развития и в момент родов 12
1.2. Метаболические адаптации в ранний период постнатального онтогенеза животных 23
1.3. Формирование колострального иммунитета у новорожденных животных 32
1.4. Пероксидное окисление липидов и система антиоксидантной защиты организма животных 36
1.5. Заключение по обзору литературы 53
2. Объекты и методы исследования 56
2.1. Объекты исследования 56
2.2. Методы исследования 58
2.2.1. Получение биологического материала, сроки и дозы введения препарата 58
2.2.2. Методы биохимических исследований 59
2.2.2.1. Определение содержания диеновых конъюгатов и кетодиенов в крови 59
2.2.2.2. Определение содержания малонового диальдегида в крови 60
2.2.2.3. Определение содержания флуоресцирующих оснований Шиффа в крови 60
2.2.2.4. Определение активности супероксиддисмутазы в крови 61
2.2.2.5. Определение активности каталазы в крови 63
2.2.2.6. Определение активности глутатионпероксидазы в крови 64
2.2.2.7. Определение активности глутатионредуктазы в крови 66
2.2.2.8. Определение содержания восстановленного глутатиона в крови 67
2.2.2.9. Определение содержания витамина Е в крови 67
2.2.2.10. Определение ферроксидазной активности церулоплазмина в крови 69
2.2.2.11. Определение антиокислительной активности плазмы крови..70
2.2.2.12. Определение содержания общих липидов в сыворотке крови 71
2.2.2.13. Определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови 72
2.2.2.14. Определение содержания пировиноградной кислоты в крови 73
2.2.2.15. Определение содержания молочной кислоты в крови 74
2.2.2.16. Определение сорбционной способности эритроцитов 75
2.2.2.17. Определение показателей биохемилюминесценции плазмы крови 76
2.2.2.18. Определение содержания лигандных форм гемоглобина 77
2.2.2.19. Определение показателей кислотно-основного состояния и газового состава крови 77
2.3. Статистическая обработка результатов 77
3. Результаты собственных исследований 78
3.1. Оксидантно-антиоксидантный статус у телят в период ранней постнатальной адаптации 78
3.1.1. Динамика свободнорадикального окисления липидов в крови телят разного возраста 78
3.1.2. Состояние неферментативного звена антиоксидантной системы в крови телят разного возраста 88
3.1.3. Активность ключевых ферментов антиоксидантной системы в крови телят разного возраста 89
3.1.4. Взаимосвязь между основными антиоксидантными системами крови телят разного возраста 93
3.2. Закономерности становления кислотно-основного гомеостаза и газового состава крови телят в период ранней постнатальной адаптации... 101
3.3. Роль кислотно-основного состояния в формировании колострального иммунитета у новорожденных телят 108
3.3.1. Кислотно-основное состояние и газовый состав крови новорожденных телят при компенсированном и некомпенсированном ацидозе 108
3.3.2. Всасывание колостральных иммуноглобулинов у новорожденных телят при компенсированном и некомпенсированном ацидозе 113
3.4. Влияние Селекора на оксидантно-антиоксидантный статус и интенсивность всасывания колостральных иммуноглобулинов у новорожденных телят 119
3.4.1. Влияние Селекора на систему антиоксидантной защиты в крови телят разного возраста 119
3.4.2. Влияние Селекора на процессы пероксидации липидов в крови телят разного возраста 122
3.4.3. Влияние Селекора на структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов у телят разного возраста 130
3.4.4. Влияние Селекора на динамику накопления колостральных иммуноглобулинов в крови телят в первые сутки после рождения 132
3.4.5. Производственная апробация эффективности применения Селекорадля профилактики желудочно-кишечных заболеваний у новорожденных телят 134
4. Обсуждение полученных результатов 137
Выводы 163
Практические предложения 166
Список использованной литературы 167
- Особенности метаболических процессов и адаптация животных в антенатальный период развития и в момент родов
- Определение активности супероксиддисмутазы в крови
- Динамика свободнорадикального окисления липидов в крови телят разного возраста
- Влияние Селекора на процессы пероксидации липидов в крови телят разного возраста
Введение к работе
Актуальность проблемы. Первые часы и дни жизни животного, в связи с переходом из условий антенатального периода развития к постнатальной стадии онтогенеза, характеризуются комплексом адаптивных реакций со стороны жизненно важных систем. Новорожденный реализует генетически детерминированную стратегию биохимической адаптации, которая позволяет успешно приспособиться к изменившимся условиям окружающей среды (Хочачка П., Сомеро Дж., 1988; Савельева Г.М. с соавт., 2004).
Защитно-приспособительные реакции, лежащие в основе метаболической адаптации новорожденного к внеутробному существованию, обеспечивают адекватный переход организма из одного гомеостатического состояния в другое (Озернюк Н.Д., Нечаев С.К., 2002).
В момент родов и неонатальную стадию онтогенеза адаптационно-компенсаторные механизмы матери и плода находятся в состоянии максимального напряжения (Соколова Н.И. с соавт., 1992). При этом скорость и направленность метаболизма обусловлена высоким биохимическим потенциалом фе-тальных тканей животных и зависит от систем адаптивной регуляции, определяющих качественное и количественное своеобразие приспособлений (Горохова В.Г. с соавт., 2004). Недостаточность адаптивных процессов приводит к перинатальным патологическим изменениям, которые проявляются в метаболических нарушениях разной интенсивности и длительности (Колчина А.Ф., 1999).
В состоянии родового акта и после рождения в организме животного преобладает каталитическая направленность метаболических процессов, связанная с перестройкой окислительно-восстановительных реакций на основе изменения кислородного режима и способа энергообеспечения клеток новорожденных (Мельничук Д.О. с соавт., 2000; Юровицкий Ю.Г., 2001). Смена во время родов относительной гипоксии разной длительности на относительную гипероксию связана с усилением процессов генерации активированных кислородных метаболитов (АКМ), которые инициируют in vivo пероксидное окисление липидов (ПОЛ) на фоне развития в момент рождения "неонатального окислительного
7 стресса" (Дубинина Е.Е. с соавт., 1997; Huertas J.R. et al., 1997; Robles R. et al.,
2001; Dani C. et al., 2004; Comporti M. et al., 2004). Этот важнейший класс биохимических реакций играет существенную роль в обеспечении процессов жизнедеятельности, как в норме, так и при адаптации к изменяющимся условиям внешней и внутренней среды (Кармолиев Р.Х., 2002; Сидоров И.В., Костромити-нов Н.А., 2003). Конечный эффект и модальность проявления биологического действия реактивных форм кислорода и продуктов пероксидной модификации биополимеров определяется состоянием оксидантно-антиоксидантного статуса организма как динамического равновесия между образованием и элиминацией свободных радикалов (Cordier J.F., 1993; McCord J.M., 1993; Delacourt С. et al., 1996; Lang J.D. et al., 2002; Yimaz A. et al., 2005).
Состояние антиоксидантной системы (AOC) перед родами и во время родового акта, степень ее активности в первые часы и сутки жизни животного обусловливает биохимический механизм свободнорадикальной патологии, которая лежит в основе этиопатогенеза постнатальных желудочно-кишечных и бронхолегочных заболеваний (Дубинина Е.Е. с соавт., 1990; Фукс П.П. с соавт., 1997; Томчук В.А., Мельничук Д.А., 2003). Поэтому интенсивность течения процессов свободнорадикального окисления (СРО) липидов и функциональное состояние системы антиоксидантной защиты (АОЗ) имеет исключительное значение в осуществлении организмом защитно-приспособительных реакций и поддержании гомеостаза (Архипенко Ю.В., Сазонтова Т.Г., 1996; Зенков Н.К. с соавт., 2001; Шаповал Г.С., Громовая В.Ф., 2003; Ahola Т. et al., 2004).
Вследствие кислородзависимой природы процесс липопероксидации тесно связан и с метаболической системой регуляции кислотно-основного состояния (КОС), и механизмами системной организации поддержания прооксидант-но-антиоксидантного равновесия на ранних этапах после рождения (Зинчук В.В. с соавт., 1995; Kinalski М. et al., 2001; Yamada Т. et al., 2003).
Знание метаболических основ формирования оксидантно-антиоксидантного статуса при осуществлении приспособительных реакций новорожденных позволяет понять механизм успешной реализации адаптивного потенциала в начальный
8 период постнатального онтогенеза. При этом наличие дисбаланса в течении ок-
сидантно-антиоксидантных процессов в силу различных причин (дефицита витаминов, микроэлементов, полиненасыщенных жирных кислот, стрессовых состояний и др.), приводящее прежде всего к резкому снижению резистентности организма за счет нарушения функционирования системы АОЗ является одним из факторов развития иммунодефицитных состояний (Журавлева Н.В., Родосская Н.К., 1988; Смирнов B.C., Фрейдлин И.С., 2000; Тутельян В.А. с соавт., 2002; Blum J.W. et al., 1997; Chelchowska M. et al., 2004), в том числе и недостаточности колострального иммунитета у новорожденных (Lacetera N. et al., 1996; Daniels J.T. et al., 2000; Ahmed L. et al., 2004).
Однако решению фундаментальных проблем биохимических механизмов постнатальной адаптации, комплексному изучению взаимосвязи процессов СРО и метаболического обеспечения кислотно-основного гомеостаза организма с состоянием иммунной резистентности у молодняка сельскохозяйственных животных уделяется недостаточно внимания, а имеющиеся данные носят единичный характер (Рецкий М.И. с соавт., 2004; Степанова И.П. с соавт., 2005).
В связи с указанным изучение закономерностей молекулярно-биохими-ческих механизмов становления оксидантно-антиоксидантного статуса и его роль в формировании колострального иммунитета является необходимым этапом исследований, направленных на разработку научно обоснованных методов управления процессами адаптации, средств и способов профилактики, терапии неонатальных заболеваний продуктивных животных (Шахов А.Г. с соавт., 2001; Мельничук Д.О. с соавт., 2002; Рецкий М.И. с соавт., 2005).
Указанные положения определили общую направленность работы, выбор экспериментальных моделей и методических подходов при проведении исследований.
Цель и задачи исследований. Целью данного исследования явилось изучение процесса пероксидного окисления липидов, состояния системы антиок-сидантной защиты, особенностей становления метаболической системы кислотно-основного гомеостаза и их взаимосвязи с формированием колострального иммунитета в период ранней постнатальной адаптации телят, а также
9 оценка влияния на эти процессы применения новорожденным телятам органического селенсодержащего препарата Селекор.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
изучить интенсивность процесса пероксидного окисления липидов и состояние системы антиоксидантной защиты в крови телят в течение первого месяца жизни;
изучить особенности становления метаболической системы кислотно-основного гомеостаза у телят в течение первого месяца жизни;
изучить роль кислотно-основного состояния и газового состава крови в формировании колострального иммунитета у новорожденных телят;
изучить влияние селенорганического препарата Селекор на возрастную динамику оксидантно-антиоксидантного статуса и формирование колострального иммунитета у новорожденных телят.
Научная новизна. Впервые комплексно изучен прооксидантно-антиокси-дантный статус, особенности становления кислотно-основного состояния и газового состава крови у телят в период ранней постнатальной адаптации. Выявлены возрастные закономерности формирования физиологически полноценной антиоксидантной системы новорожденных и ее значение в поддержании оксидантно-антиоксидантного баланса. Установлены особенности формирования колострального иммунитета у новорожденных телят при компенсированной и некомпенсированной формах неонатального респираторно-метаболического ацидоза в первые часы жизни. Впервые изучено действие селенорганического препарата Селекор на процессы свободнорадикального окисления липидов, состояние антиоксидантной системы и интенсивность накопления колостральных иммуноглобулинов у новорожденных телят.
Получено уведомление о положительном результате формальной экспертизы по заявке на патент РФ № 2005108481/14(010103).
Практическая значимость. Изучение взаимосвязи между оксидантно-антиоксидантным гомеостазом, кислотно-основным состоянием и иммунным статусом телят в период раннего постнатального развития позволяет углубить и
10 систематизировать современные представления о молекулярно-биохимических
механизмах адаптации новорожденного к новым условиям существования. Полученные данные можно использовать для оценки адаптационных возможностей организма новорожденного, устойчивости к заболеваниям, прогнозирования возникновения патологических состояний и разработки научно обоснованных методов управления процессами постнатальнои адаптации и комплексной профилактики неонатальных заболеваний телят.
Данные о влиянии Селекора на процессы свободнорадикального окисления, функциональное состояние системы антиоксидантной защиты и формирование колострального иммунитета могут быть использованы для разработки фармакологических средств коррекции окислительного стресса у новорожденных, совершенствования способов профилактики болезней телят и повышения их продуктивности.
Результаты исследований использованы при составлении Методических рекомендаций по диагностике, терапии и профилактике нарушений обмена веществ у продуктивных животных (протокол № 2 от 8 июля 2005 г.) и Методических рекомендаций по оценке и коррекции иммунного статуса животных (протокол № 3 от 21 сентября 2005 г.), которые рассмотрены, одобрены и рекомендованы к публикации секцией "Патология, фармакология и терапия" Отделения ветеринарной медицины РАСХН.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на Международной научно-практической конференции "Теоретические и практические аспекты возникновения и развития болезней животных и защиты их здоровья в современных условиях" (Воронеж, 2000); Межрегиональной конференции "Физиология и психофизиология мотиваций" (Воронеж, 2003); VIII Международной пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология -наука XXI века" (Пущино, 2004); Международной научно-практической конференции "Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных" (Воронеж, 2004); Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы болезней органов размножения и молочной железы у животных" (Воро-
неж, 2005), а также на ежегодных научных сессиях Воронежского государственного университета (2001 - 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ: 8 статей и 1 тезисы доклада.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Адаптация новорожденных телят к новым условиям существования со
провождается перестройкой и активизацией функционального состояния анти-
оксидантной системы в ответ на интенсификацию процессов свободноради-
кального окисления липидов.
Характер становления метаболической системы кислотно-основного гомеостаза после рождения является одним из факторов, определяющим формирование адекватного колострального иммунитета у новорожденных телят.
Применение селенорганического препарата Селекор оказывает стабилизирующее действие на оксидантно-антиоксидантный статус, снижает проявления окислительного стресса и способствует формированию более напряженного колострального иммунитета у новорожденных телят.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 206 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и практических предложений. Список использованной литературы содержит 414 источников, из них 272 отечественных и 142 иностранных. Иллюстративный материал включает 27 рисунков и 28 таблиц.
Особенности метаболических процессов и адаптация животных в антенатальный период развития и в момент родов
Одним из крупнейших достижений биохимии и молекулярной биологии является открытие ряда общих принципов и механизмов, лежащих в основе всех проявлений жизни. Механизмы преобразования энергии, катализа, кодирования и обработки генетической информации свидетельствуют о единстве жизни на молекулярном уровне. Но, несмотря на все успехи редукционистского подхода в биологии, актуальным в настоящее время остается один из важнейших вопросов, интересующий биологов - каковы основные механизмы приспособлений животных к отдельным экологическим факторам и различным типам природной среды на разных уровнях организации: от молекулярно-клеточного и биохимического до биоценотического и экосистемного. Постоянный интерес к данной проблеме связан, прежде всего, с тем, что способность к адаптации рассматривается как одно из основных свойств живых систем на всех уровнях организации (Озернюк Н.Д., 1992; Меерсон Ф.З., Малышев И.Ю., 1993).
Особого внимания заслуживают механизмы биохимической адаптации при переходе организма на новую стадию развития. При этом возникают новые метаболические задачи, для решения которых необходимы количественные и качественные преобразования ферментативных систем, лежащие в основе приспособления к иным условиям существования (Тюрин К.В., Ханин М.А., 2000).
Своего рода мостиком, благодаря которому удается ликвидировать пропасть между биохимией и физиологией эмбрионального и раннего постнатального развития является активно развиваемая в настоящее время общая теория адаптации (Озернюк Н.Д., Нечаев С.К., 2002). Распространение этой теории на биохимический уровень позволит перейти от фактов, доказывающих столь резкое различие между характером питания и потребностью в кислороде к пониманию природы основных приспособительных стратегий при переходе на новую стадию развития и объяснению элементарных адаптационных механизмов к экологическим условиям обитания на молекулярном уровне (Тютюнник Н.Н. с соавт., 2005). В литературе по вопросам адаптации чаще всего обсуждаются приспособления к новым условиям жизни на физиологическом, морфологическом, поведенческом и экологическом уровнях. В биохимическом подходе к проблемам адаптации внимание сосредоточено на механизмах изменения скорости физиологических и метаболических процессов. Подробный анализ "внутренних" адаптации, в основе которых лежат изменения окислительно-восстановительных реакций, постоянства внутренней среды, процессов газообмена и так далее, обычно ускользает от взгляда исследователей. Подобного рода приспособления можно обнаружить лишь после тщательного "биохимического препарирования" организма (Хочачка П., Сомеро Дж., 1988).
В процессе развития животных реализуются основные защитно-приспособительные механизмы, соответствующие определенному уровню адаптации. На метаболическом уровне действуют обратимые фенотипические адаптации, прямо не связанные с экспрессией генов: изменение скорости синтеза и деградации белков, их взаимодействие с лигандами, изменение вязкости мембранных липидов. Адаптации генотипической природы необратимого характера обусловлены генной экспрессией и соответствуют молекулярно-генотипическому уровню. Так, изменение экспрессии уже функционирующих генов, экспрессия новых генов и мутации влияют на свойства белков. Эти преобразования начинаются с оплодотворения яйцеклетки или дробления зиготы и обычно происходят постепенно. Однако в процессе развития совершаются резкие качественные перестройки (Озернюк Н.Д., Нечаев С.К., 2002).
В онтогенезе млекопитающие проходят пять стадий развития, четко отличающихся друг от друга способами получения питательных веществ и кислорода: зигота плод сосунок -отъемыш взрослое животное Ранее были предложены различные искусственные периодизации индивидуального жизненного цикла, основанные главным образом только на морфологических показателях и учитывающих состояние лишь одной функциональной системы или, наоборот, всех систем, но без анализа динамики, перио-дичности их активности, взаимосвязи между ними. Наибольшее распространение получили классификации периодов постнатального онтогенеза крупного рогатого скота, разработанные И.А. Лебедевым (1954), П.Д. Пшеничным (1961), А.В. Нагорным и В.Н. Никитиным (1963), К.Б. Свечиным (1976). Анализ существующих периодизаций постнатального роста и развития животных свидетельствует о том, что выделяемые стадии не отражают качественные характеристики, специфичность возрастных этапов внеутробной жизни. Выделяемые периоды физиологически недостаточно обоснованы, а сроки их наступления и продолжительность в ряде случаев являются ориентировочными, поскольку для сельскохозяйственных животных отсутствуют обобщенные данные о постнатальном росте и развитии функциональных систем. Рост и развитие, особенно на ранних этапах постнатальной жизни животных, протекает неравномерно для разных функциональных систем. В их развитии наблюдается значительный гетерохронизм. Одни органы и системы к моменту рождения фактически уже функционально зрелы, другие - созревают на ранних этапах постнатального развития. При этом некоторые органы и системы функционально активны лишь на определенных стадиях онтогенеза. Поэтому подразделять постнатальный онтогенез животных на отдельные периоды с четкими границами с охватом хотя бы всех основных систем органов представляется трудно выполнимой задачей (Раевский В.В., 2002). В настоящее время на основе анализа литературных данных по изучению комплексных морфологических, биохимических, физиологических и экологических исследований выделяют четыре группы основных периодов постнатального роста и развития млекопитающих: критические, доминирования, ретардации и стабилизации функциональных систем. Основанием для выделения названных периодов служили данные об уязвимости функциональных систем организма животных при действии факторов внешней среды, об отставании или доминировании тех или иных систем в росте и развитии относительно других и относительно самих себя в предшествующие периоды, о стабилизации их мор-фофункциональных параметров на уровне взрослого животного. Критические периоды наблюдаются, в основном, в ранние сроки постна тальной жизни, и уязвимыми при этом являются диверсные системы. В прикладном плане наиболее существенны следующие критические периоды: ри-билдинг, импринтинг, иммунодефицитный и депрессии стресс-реакции. Рибилдинг-период продолжается лишь несколько часов сразу после рождения, но значимость его огромна. Функция большей части систем в связи с переходом в новые условия существования перенапряжена. Самые уязвимые в это время дыхательная и пищеварительная системы. Критическое состояние в данном периоде может быть обусловлено также недостаточной иммунокомпетент-ностью, выражающейся в дефиците гуморального звена иммунитета.
Определение активности супероксиддисмутазы в крови
Метод основан на торможении супероксиддисмутазой восстановления бесцветных тетразолиевых солей в окрашенные соединения (формазаны) супероксидными анион-радикалами при их фотогенерации в системе рибофла-вин-тетраметилендиамин (ТЭМЭД) (Чумаков В.Н., Осинская Л.Ф., 1977).
К эритроцитарной массе, полученной после отмывания от плазмы 0,5 мл гепаринизированной крови, приливали 5,0 мл дистиллированной воды охлажденной до +1 ...+4С и оставляли в ледяной бане на 15 минут для более полного гемолиза. К 1,5 мл гемолизата для осаждения гемоглобина прибавляли 0,5 мл смеси хлороформ-этанол (в соотношении 5:3), перемешивали и оставляли на 10 — 15 минут в ледяной водяной бане. После центрифугирования в течение 15 минут при 3000 об/мин и температуре 0...+4С прозрачную надосадочную жидкость разбавляли дистиллированной водой в 20 раз. Половину полученного биологического материала оставляли в химических пробирках в ледяной водяной бане. Другую половину биоматериала помещали в постоянно кипящую водяную баню на 10 минут для инактивации фермента.
Для каждой пробы брали три химические пробирки (опыт, контроль и контроль на реактивы), ставили их в специальный закрытый штатив. В опытные пробирки последовательно вносили 1,0 мл 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,8), 1,0 мл 0,05 М раствор ТЭМЭДа, 1,0 мл 0,85 М раствора пара-нитротетразолия хлористого (п-НТХ), 5,0 мл дистиллированной воды, 0,2 мл инактивированного биологического материала и 2,0 мл 0,034 мМ раствора рибофлавина. Одновременно осуществляли постановку контрольных проб и проб "контроль на реактивы". При этом в контрольные пробы вместо интактного субстрата добавляли 0,2 мл инактивированного биоматериала. Контроль на реактивы состоял из смеси следующих веществ: 2,0 мл 0,1 М фосфатный буфер (рН 9,85), 1,0 мл 0,85 М раствора п-НТХ, 5,0 мл дистиллированной воды, 0,2 мл неинактивированного биоматериала и 2,0 мл 0,034 мМ раствора рибофлавина.
Содержимое пробирок тщательно перемешивали и устанавливали в штатив на расстоянии 20 см от лампы дневного света, которую предварительно прогревали в течение 10 минут. Открывали переднюю стенку штатива, облучали пробы по секундомеру в течение 5 минут и после этого ее закрывали. Во все пробирки как можно быстрее добавляли по 1,0 мл 1%-ного раствора йодистого калия для остановки реакции и сразу тщательно перемешивали. Измеряли оптическую плотность каждой пробы при длине волны 520 нм против дистиллированной воды. Количество гемоглобина в гемолизатах определяли гемоглобинцианидным методом с помощью набора НПО "Биохимреактив". Для расчета активности фермента вначале находили процент торможения супероксиддисмутазой образования формазана п-НТХ по формуле:Метод определения основан на способности перекиси водорода образовывать с молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс с максимумом поглощения при длине волны 410 нм (Королюк М.А. с соавт., 1988). Для приготовления основного гемолизата к 0,5 мл гепаринизированной крови приливали 3,5 мл бидистиллированной воды, тщательно перемешивали и оставляли на 5 - 10 минут при комнатной температуре. Далее к 0,2 мл основного гемолизата прибавляли 3,8 мл воды, тщательно перемешивали и получали рабочий гемолизат. В две химические пробирки вносили по 0,2 мл буферно-субстратной смеси (10,0 мл трис-HCl буфера рН 7,4 смешивали с 30,0 мл 0,044 Н раствора перекиси водорода) и преинкубировали в водяной бане при +37С в течение 10 минут. В одну из пробирок (опытную) добавляли 0,1 мл рабочего гемолизата, тщательно перемешивали и инкубировали в водяной бане при +37С в течение 3 минут. Реакцию останавливали добавлением в опытную пробу 2,0 мл 4,5%-ного раствора аммония молибденовокислого. Одновременно приливали в контрольную пробирку сначала 2,0 мл молибдата аммония, а затем 0,1 рабочего гемолизата. Оптическую плотность опытной и контрольной проб измеряли при длине волны 410 нм. В качестве раствора сравнения использовалась смесь из 1,0 мл буфера, 3,0 мл дистиллированной воды и 0,1 мл рабочего гемолизата. Активность каталазы рассчитывали по формуле:Активность глутатионпероксидазы определяется по уменьшению количества восстановленного глутатиона — донора водорода, который расходуется в ходе глутатионпероксидазной реакции (Бузлама B.C. с соавт., 1997). К 0,5 мл крови добавляли 3,5 мл дистиллированной воды, тщательно пе- ремешивали и оставляли в холодильнике на 10 - 15 минут для более полного гемолиза. В химическую пробирку приливали 1,0 мл 33,88 мМ раствора восстановленного глутатиона и прибавляли 1,0 мл гемолизата. Переносили по 0,5 мл смеси в две центрифужные пробирки (опытную и контрольную), помещали их в водяную баню при +37С и инкубировали в течение 5 минут. В опытную пробу добавляли 0,1 мл 3,8 мМ раствора перекиси водорода, интенсивно встряхивали и оставляли на водяной бане. Ровно через 1 минуту (по секундомеру) с момента внесения раствора перекиси водорода в опытную и контрольную пробу добавляли по 2,0 мл холодного 10%-ного раствора ТХУ для остановки реакции, после в контрольную пробу приливали 0,1 мл раствора перекиси водорода. Обе пробирки встряхивали и помещали на 10 минут в холодильник. После этого пробы центрифугировали при 3000 об/мин и температуре 0...+4С в течение 15 минут.
Динамика свободнорадикального окисления липидов в крови телят разного возраста
Поскольку процесс ПОЛ представляет собой последовательную ступенчатую деградацию жирных кислот с образованием нестойких радикальных интер-медиатов и стабильных молекулярных продуктов, активность и направление окислительного процесса оценивалась по совокупности наиболее характерных и специфических соединений, на количественном определении которых основаны широко употребляемые методы исследования пероксидации липидов (Каган В.Е. с соавт., 1986; Pompella A. et al., 1987).
Первая серия опытов была проведена на клинически здоровых телятах 3-х возрастных групп: в возрасте 1 (новорожденные, п = 10), 10 (п = 12) и 30 (n = 15) суток после рождения.
В настоящее время наиболее чувствительным и информативным методом обнаружения органических радикалов, а также изучения активности радикальных окислительных реакций в биологических субстратах является регистрация интенсивности хемилюминесценции (Журавлев А.И., 1983; Косолапое В.А. с соавт., 1999; Реммель Н.Н.Д 2003). Достоверность результатов этого метода дополняется соответствующими интегральными показателями, что позволяет дифференцированно проанализировать процесс пероксидации липдов.
В качестве индикаторов интенсивности свободнорадикального процесса использовали регистрацию образования липоперекисных радикалов, диеновых конъюгатов, кетодиенов, МДА и флуоресцирующих оснований Шиффа.
С помощью железоиндуцированной хемилюминесценции по показателю интенсивности быстрой вспышки у телят было установлено наличие проокси-дантных факторов в плазме крови на протяжении всего периода изучения. Это может свидетельствовать о возможности образования липопероксидов в результате развития цепных реакций СРО липидов (табл. 3).
Действительно, в первые сутки после рождения по светосумме медленной вспышки отмечался самый высокий уровень интенсивности пероксидации липидов, что характеризует в определенной мере функциональную недостаточность неферментативного звена АОС крови новорожденных. Об этом также свидетельствует низкая АОА плазмы крови в тот же возрастной период, оцениваемая по тангенсу угла наклона кинетической кривой. Однако к 10-дневному возрасту дисбаланс между образованием свободных радикалов и их утилизацией досто верно смещался в сторону наращивания мощности антирадикального потенциала. У животных на 28,7% повышалась АОА плазмы крови при одновременном снижении интенсивности пероксидной модификации липидов на 38,0% по сравнению с уровнем аналогичных показателей у однодневных телят (рис. 1).
О сбалансированности оксидантно-антиоксидантных процессов можно судить по значению коэффициента Кь рассчитанного как отношение imax/S и отражающего степень интенсивности пероксидации липидов. Согласно полученным результатам в условиях ранней постнатальнои адаптации телят значение данного коэффициента возрастало на 77,8% одновременно с увеличением АОА плазмы крови на 10-е сутки жизни и в дальнейшем сохранялось на постоянном уровне.
Несмотря на незначительное увеличение показателя Imax на 7,5% к концу первой декады постнатального развития, динамика увеличения АОА в данный возрастной период характеризуется максимальным нарастанием антиоксидантного потенциала организма. В крови телят отмечалось преобладание процессов детоксикации свободнорадикальных продуктов над интенсивностью окислительной деструкции липидов.
Данная закономерность сохранялась к 30-суточному возрасту, что способствовало снижению активности оксидантных процессов до минимальных значений и их дальнейшей стабилизации. Интенсивность пероксидации липи-дов на фоне постоянно протекающей инициации их СРО снижалась на 41,8%, а увеличение мощности антиоксидантных факторов защиты повышалось на 61,7% относительно исходного уровня новорожденных животных. При этом наличие стабильных оксидативных реакций в крови на протяжении изучаемого периода можно характеризовать как довольно устойчивый процесс, имеющий незначительную тенденцию к увеличению к концу третьей декады жизни. Это подтверждает отсутствие статистически значимых отличий между значениями показателя Imax у новорожденных и месячных телят.
По-видимому, в 30-суточном возрасте дисбаланс в системе ПОЛ-АОЗ по-стеменно сглаживается, а анализируемые показатели устанавливаются на уровне референтных величин, характерных для здоровых взрослых животных. При этом можно констатировать факт проявления компенсаторных механизмов у телят в неонатальный период развития, которые направлены на снижение избыточного уровня в крови радикальных окислительных процессов.
Для оценки сбалансированности оксидантно-антиоксидантного статуса и своевременного обнаружения оксидативного стресса у крупного рогатого скота предложено использовать отношение показателя АОА плазмы крови к интенсивности пероксидации липидов в качестве коэффициента сбалансированности К2 (go /S) (Степанова И.П., 2004). Данный показатель позволяет характеризовать процессы ПОЛ и состояние АОС крови, но в отличие от коэффициента Кь он отражает вклад внеклеточных антиоксидантов в становление антирадикального гомеостаза организма.
Значение коэффициента сбалансированности Кг у телят к концу первого месяца жизни повышалось в 2,1 раза по сравнению с новорожденными. Его снижение ниже референтных величин с учетом стадии индивидуального развития и физиологического состояния может указывать на состояние окислительного стресса в организме животных.
Исследование процессов ПОЛ у телят на стадии образования свободнора дикальных продуктов в условиях послеродовой адаптации свидетельствует об интенсификации окислительных реакций, протекающих в липидной фазе по радикальному механизму. Возрастное снижение интенсивности реакций подобного класса, очевидно, обусловлено деятельностью адаптационно-компенсаторных механизмов, направленных на подавление избыточного процесса окислительной деструкции биополимеров. В крови здоровых телят в ранний период постнаталь-ной адаптации устанавливалось равновесие в содержании антиоксидантов.
В качестве интегрального показателя активности ПОЛ в биологических субстратах служит определение концентрации МДА (Колесова О.Е. с соавт., 1984; Draper Н.Н. et al., 1993; Kosugi Н. et al., 1993). При всей простоте выполнения этот метод позволяет обнаружить радикальные окислительные процессы и оценить их активность по интенсивности возникновения окрашенных продуктов - хромофоров, динамика образования которых во времени тесно коррелирует с поглощением 02 и отражает накопление диальдегида (Vilim V., Wilhelm J., 1989).
Влияние Селекора на процессы пероксидации липидов в крови телят разного возраста
Возрастная динамика свободнорадикальных процессов у новорожденных взаимосвязана с окислительным метаболизмом материнского организма в период беременности, который сопровождается интенсификацией ПОЛ и увеличением АОА плазмы крови на фоне повышения мощности АОС организма. Однако при надежной работе антиоксидантных механизмов степень деградации биополимеров сохраняется на стационарном уровне (Леце А.Г. с соавт., 1999).
В основе интенсификации окислительных процессов, приводящих к росту продуктов ПОЛ в первые сутки жизни животных, по-видимому, лежат особенности метаболизма плода. В антенатальный период развития главным источником энергии для эмбриона и плода млекопитающих служит эндогенная глюкоза, а скорость окисления жирных кислот очень мала (Хочачка П., Сомеро Дж., 1988). После рождения происходит метаболическая адаптация новорожденного при переходе на жирное материнское молозиво и молоко, о чем свидетельствует закономерное повышение концентрации общих липидов на 166,7% к месячному возрасту. Наиболее значимым источником энергии в период от рождения до начала кормления становятся жировые запасы, которые откладываются у плода в процессе пренатального липогенеза. Это важнейшее метаболическое приспособление, требующее создания энергетических резервов для осуществления термогенеза в неонатальный период развития новорожденного.
Действительно, в течение первого месяца жизни у телят усиливается интенсивность метаболизма липидов, роль которых в основном обмене веществ непосредственно после рождения существенным образом возрастает в связи с тем, что они становятся главным источником энергии для новорожденного.
Вскоре после рождения в результате липолиза в крови резко возрастает концентрация свободных жирных кислот и глицерола (Аряев Н.Л., 1982). В это время более интенсивный катаболизм отмечен для жирных кислот (Blum J.W. et al., 1997), поскольку при их окислении образуется значительно больше энергии по сравнению с глицеролом. Липогенез, начинающийся в результате активации гормончувствительных липаз катехоламинами, приводит к образованию глице-рола и свободных жирных кислот и резкому увеличению их концентрация вскоре после рождения. Однако, в случае их расщепления с одинаковой скоростью, такое увеличение концентраций должно было бы находиться в стехиометриче-ском отношении 1:3. В действительности концентрация глицерола может увеличиваться почти в 5 раз, а свободных жирных кислот - только в 1,5 раза. Это может означать, что для свободных жирных кислот характерен более интенсивный катаболизм в начальный период жизни, поскольку их окисление по сравнению с глицеролом энергетически более выгодно (Хочачка П., Сомеро Дж., 1988).
Однако термогенез на основе высших жирных кислот в первые дни жизни создает необходимые условия для интенсификации свободнорадикальных процессов, что приводит к увеличению скорости липопероксидации. В результате концентрация диеновых конъюгатов, кетодиенов и ТБК-продуктов превышает аналогичные показатели животных месячного возраста на 37,5%, 94,3% и 267,2% соответственно, а образование органических радикалов увеличивается на 71,8%. Процессы ПОЛ у телят в период раннего постнатального онтогенеза имеют возрастную зависимость и характеризуются высокой интенсивностью окисления ПНЖК через сутки после рождения, значительно снижаясь к концу первого месяца жизни. При этом следует отметить наиболее выраженное снижение активности в начале второй недели неонатального развития.
Ведущим принципом организации АОС in vivo является снижение внутриклеточной концентрации кислорода (Скулачев В.П., 1995). Большое значение в сложной иерархии системы АОЗ имеют кислородсвязывающие свойства крови, определяющие величину парциального давления кислорода. Изменение КОС и сдвиг кривой диссоциации оксигемоглобина вправо повышает отдачу кровью кислорода тканям (Woodson R.D., 1979), что сопровождается активацией процессов СРО липидов и ослаблением механизмов АОС организма (Зинчук В.В. с соавт., 1996; Borisiuk M.V., Zinchuk V.V., 1995). Сдвиг кривой влево в условиях снижения эффективности использования кислорода может обладать адаптивным действием, ограничивая квоту кислорода, участвующего в генерации свободных радикалов и последующем инициировании процессов пероксидации липидов (Калиман П.А., Баранник Т.В., 2001). Ввиду кислородзависимой природы пероксидации липидов возникновение окислительного стресса тесно связано с кислородтранспортной функцией крови и регулирующими ее факторами системной организации поддержания прооксидантно-антиоксидантного равновесия организма (Зинчук В.В., 2001), что отражается в изменении КОС новорожденного. В течение первых часов постнатального развития телята пребывают в состоянии естественного респираторно-метаболического ацидоза, нормализация которого происходит через 24...48 часов после их рождения. При этом показатели КОС крови новорожденных в большей степени определяются особенностями метаболических превращений в период внутриутробного развития (Lechowski R., 1996). В частности, параметры кислотно-щелочного равновесия крови плода тесно взаимосвязаны с биохимическими процессами в тканях глубокостельных коров (Тупицька О.М. с соавт., 1997), протекающих на фоне нарушения условий их содержания и кормления, когда в рационе преобладают недоброкачественные кислые корма — силос, сенаж, а также вследствие перенесенных заболеваний. В результате метаболического ацидоза развивается состояние циркуляторной и тканевой гипоксии, снижается интенсивность потребления кислорода клетками плода, в тканях накапливаются недоокисленные продукты обмена веществ, прежде всего, молочная кислота (Захаренко Н.А. с соавт., 1995) и несколько позже - продукты пероксидации липидов (Рецкий М.И., 1996). Это предопределяет значительный дефицит буферных оснований, составляющий 166,7% по сравнению с телятами месячного возраста, что, в итоге, обусловливает рождение животных с низким щелочным резервом в состоянии глубокого метаболического ацидоза.
Кроме того, следует отметить, что в момент родов плод переживает значительный физиологический стресс (Немченко М.И., 1974; Бузлама B.C. с со авт., 1978; Нежданов А.Г., 1991). Сокращение матки в процессе родов предопределяет нарушение плацентарного кровообращения и тормозит поступление кислорода в ткани плода, что приводит к развитию сердечно-сосудистой гипоксии (Любецька Т.В., 2000). У новорожденных нарушения кислородного статуса могут сочетаться с развитием естественной полиорганной недостаточности, связанной с гемодинамической и дыхательной дисфункцией в первые часы после рождения. При нарушении кислородного баланса в организме накапливаются недоокисленные продукты, главным образом, молочная кислота, которая моментально разлагается на ионы водорода и лактат (Дементьева И.И., 2002). Адаптация новорожденных к дефициту кислорода обусловливает активацию гликолиза в первые часы жизни и накопление лактата в тканях, концентрация которого в крови на 69,9% превышает исходный фоновый уровень у телят месячного возраста.
