Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Система глутатиона 11
1.1.1. Глутатион 11
1.1.2. Глутатионтрансферазы 17
1.1.3. Глутатионредуктаза 21
1.1.4. Глутатионпероксидазы 23
1.2. Противоопухолевые препараты и окислительный стресс 25
1.3.Химиопротекторы 35
2. Материал и методы исследования 41
2.1. Материал 41
2.2. Методика проведения опытов 41
2.3. Биохимические методы 42
2.4. Статистический анализ результатов 44
3. Результаты исследования 45
3.1. Влияние противоопухолевых препаратов различных групп на систему глутатиона 45
3.1.1. Влияние 5-фторурацила на состояние системы глутатиона в печени мышей 45
3.1.2. Влияние метотрексата на состояние системы глутатиона в печени мышей 48
3.1.3. Сравнительная характеристика влияния 5-фторурацила и метотрексата на состояние системы глутатиона в печени, почках, селезенке и сердце мышей 51
3.1.4. Влияние циклофосфамида на состояние системы глутатиона в печени мышей 54
3.1.5. Влияние карбоплатина на состояние системы глутатиона в печени мышей 57
3.1.6. Влияние эпирубицина на состояние системы глутатиона в печени мышей 59
3.2. Влияние а-липоевой кислоты и 2 меркаптоэтансульфоната на состояние системы
глутатиона в органах мышей при введении противоопухолевых препаратов различных групп 62
3.2.1. Влияние а-липоевой кислоты на состояние системы глутатиона в печени мышей 62
3.2.1.1. Влияние а-липоевой кислоты на состояние системы глутатиона в печени мышей при введении цитостатиков различных групп 66
3.2.2. Влияние 2-меркаптоэтансульфоната на состояние системы глутатиона в печени и почках мышей 73
3.2.2.1. Влияние 2-меркаптоэтансульфоната на состояние системы глутатиона в печени и почках мышей при введении метотрексата 76
3.2.3. Сравнительная характеристика влияния 2-меркаптоэтансульфоната и липоевой кислоты на систему глутатиона в печени мышей 83
3.2.4. Влияние 2-меркаптоэтансульфоната и а-липоевой кислоты на состояние системы глутатиона в печени и почках мышей при введении оксазофосфоринов 86
3.2.4.1. Влияние 2-меркаптоэтансульфоната на состояние системы глутатиона в печени и почках мышей при введении циклофосфамида 86
3.2.4.2. Влияние 2-меркаптоэтансульфоната на состояние системы глутатиона в печени и почках мышей при введении ифосфамида 90
3.2.4.3. Влияние а-липоевой кислоты на состояние системы глутатиона в печени и почках мышей при введении ифосфамида 94
4. Обсуждение полученных результатов 99
Выводы 112
Литература 114
- Глутатионтрансферазы
- Биохимические методы
- Сравнительная характеристика влияния 5-фторурацила и метотрексата на состояние системы глутатиона в печени, почках, селезенке и сердце мышей
- Влияние 2-меркаптоэтансульфоната на состояние системы глутатиона в печени и почках мышей
Введение к работе
Актуальность проблемы. Противоопухолевые препараты занимают одно из центральных мест в лечении опухолей. Они обладают рядом существенных недостатков, основными из которых являются малая избирательность действия, высокая токсичность (Donnelly J.G., 2004) и узкий терапевтический индекс (Gamelin E. et al., 2007; Walko C.M. et al., 2009). Токсические эффекты препаратов схем химиотерапии часто более выражены в интактных тканях, чем в опухолевых клетках (Donnelly J.G., 2004). Выраженное побочное действие химиопрепаратов часто ограничивает возможность проведения адекватного курса химиотерапии. Механизмы токсического действия химиопрепаратов различны. Противоопухолевые препараты часто имеют прооксидантные свойства, вызывая окислительный стресс, как в клетках опухоли, так и в интактных здоровых тканях (Conklin K.A., 2000, 2004).
Токсическое действие радикал-образующих химиопрепаратов (таких как антрациклины) сопряжено с развитием окислительного стресса в интактных органах их тропной токсичности (Galetta F. et al., 2010; Guven A. et al., 2007; Kebieche M. et al., 2009). С прооксидантным действием связывают побочные эффекты противоопухолевых препаратов других групп: антиметаболитов 5-фторурацила (Numazawa S. et al., 2011; Ray S. et al., 2007) и метотрексата (Cetin A. et al., 2008; Hemeida R.A. et al., 2008), алкилирующих препаратов ифосфамида (Zhang J. et al., 2007) и циклофосфамида (Ayhanci A. et al., 2010; Tripathi D.N. et al., 2010), препарата платины карбоплатина (Giustarini D. et al., 2009).
Развитие окислительного стресса при введении химиопрепаратов различных групп позволяет рассматривать его как один из общих механизмов токсического действия противоопухолевых препаратов.
Защиту тканей от окислительного стресса осуществляют эндогенные антиоксиданты и в первую очередь система глутатиона, участвующая в различных уровнях защиты (Кулинский, Колесниченко, 1990, 2009). Описано влияние химиопрепаратов, вызывающих прооксидантное действие в интактных органах, на отдельные показатели системы глутатиона. Большая часть публикаций описывает снижение уровня глутатиона в органах тропной токсичности (Giustarini D. et al., 2009; Numazawa S. et al., 2011; Sener G. et al., 2006). В отдельных работах сообщают об изменении активности ферментов метаболизма глутатиона: глутатионтрансфераз (Arafa H.M., 2009; Chen N. et
Список используемых сокращений:
АФК – активные формы кислорода, ГПО – глутатионпероксидаза, ГР – глутатионредуктаза, ГТ – глутатионтрансфераза, ДГЛК – дигидролипоевая кислота, ИФ – ифосфамид, КП – карбоплатин, ЛК – -липоевая кислота, МДА – малоновый диальдегид, МТ – метотрексат, ПОЛ – перекисное окисление липидов, ТБК – тиобарбитуровая кислота, ФУ – 5-фторурацил, ЦФ – циклофосфамид, ЭР – эпирубицин, GSH – восстановленный глутатион.
al., 2008; Conklin D.J. et al., 2009), глутатионредуктазы (Babiak R.M. et al., 1998) и глутатионпероксидаз (Husain K. et al., 2004; Oktem F. et al., 2006).
Изменение отдельных показателей системы глутатиона в органах тропной токсичности в условиях интоксикации химиопрепаратами различных групп позволяет выдвинуть гипотезу о её универсальной роли в развитии токсических эффектов цитостатиков. Однако данные литературы сообщают об изменениях отдельных показателей системы глутатиона в отдельно взятые сроки. Для объективной оценки значения изменений в системе глутатиона в развитии токсических эффектов химиопрепаратов необходимо проведение комплексного исследования показателей системы глутатиона в динамике. Также необходима сравнительная характеристика изменений системы глутатиона, вызываемых противоопухолевыми препаратами различных групп. Токсикологические аспекты влияния цитостатиков на систему глутатиона на уровне организма находятся на стадии изучения (Estrela J.M. et al., 2006). Актуальным является исследование влияния противоопухолевых препаратов на динамику состояния системы глутатиона в органах тропной токсичности, в том числе печени – главном органе детоксикации ксенобиотиков и центральном органе межтканевого и межорганного транспорта глутатиона (Estrela J.M. et al., 2006).
Исследование закономерностей изменения показателей системы глутатиона в условиях химиотерапии определяется необходимостью поиска универсальных средств регуляции побочных токсических эффектов химиопрепаратов. В качестве препаратов коррекции системы глутатиона были исследованы два низкомолекулярных тиола: -липоевая кислота и 2-меркаптоэтансульфонат (месна). В настоящее время -липоевая кислота не используется в качестве химиопротектора. Однако в силу сочетания антиоксидантных свойств (Бустаманте Д. и др., 2001; Han D. et al., 2008) и описанных противоопухолевых эффектов (Moungjaroen J. et al., 2006; Simbula G. et al., 2007; Wenzel U. et al., 2005) -липоевая кислота является перспективным средством коррекции токсических эффектов цитостатиков. 2-Меркаптоэтансульфонат применяется в качестве уропротектора при интоксикации оксазофосфоринами (Чу Э. и др., 2008), в литературе описаны его антиоксидантные эффекты в различных тканях и органах (El-Medany A. et al., 2005; Sener G. et al., 2006; Ypsilantis P., 2009).
Целью настоящей работы является исследование изменений показателей системы глутатиона при введении противоопухолевых препаратов различных групп (антиметаболитов, алкилирующих препаратов, препаратов платины и противоопухолевых антибиотиков) и определение обоснованности и эффективности применения низкомолекулярных тиолов для коррекции состояния системы глутатиона.
В ходе выполнения работы решались следующие задачи:
-
изучение динамики показателей системы глутатиона печени мышей при введении противоопухолевых препаратов различных групп: антиметаболитов 5-фторурацила и метотрексата, алкилирующих препаратов циклофосфамида и карбоплатина, противоопухолевого антибиотика эпирубицина;
-
определение влияния низкомолекулярных тиолов -липоевой кислоты и 2-меркаптоэтансульфоната на состояние системы глутатиона печени и почек мышей в условиях введения химиопрепаратов различных групп.
Новизна исследования:
проведено комплексное сравнительное исследование влияния антиметаболитов 5-фторурацила и метотрексата, алкилирующих препаратов циклофосфамида и карбоплатина, противоопухолевого антибиотика эпирубицина на систему глутатиона печени и почек мышей в динамике;
установлены основные патогенетические механизмы нарушения работы системы глутатиона химиопрепаратами различных групп;
установлена эффективность применения -липоевой кислоты в качестве препарата коррекции системы глутатиона в печени мышей в условиях интоксикации 5-фторурацилом, карбоплатином и эпирубицином;
обоснована эффективность применения -липоевой кислоты в качестве нефрогепатопротектора при введении ифосфамида;
установлена возможность использования 2-меркаптоэтансульфоната для предотвращения токсических эффектов метотрексата в тканях печени и почек.
Практическое значение
Обоснована возможность применения -липоевой кислоты в качестве корректора системы глутатиона в печени мышей в условиях интоксикации 5-фторурацилом, карбоплатином и эпирубицином, а также в качестве нефрогепатопротектора при введении ифосфамида.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
5-Фторурацил, метотрексат, циклофосфамид, карбоплатин и эпирубицин вызывают дестабилизацию системы глутатиона в печени мышей. Нарушение системы глутатиона при введении химиопрепаратов начинается со снижения активности глутатионредуктазы в ранние сроки (3-24 ч) с последующим уменьшением активности глутатионтрансфераз (кроме циклофосфамида) и глутатионредуктазы в поздние сроки (3-7 суток).
-
-Липоевая кислота при совместном введении с 5-фторурацилом увеличивает концентрацию восстановленного глутатиона и активность глутатионтрансфераз, глутатионредуктазы и глутатионпероксидаз, при введении с карбоплатином и эпирубицином предотвращает снижение активности глутатионтрансфераз в печени через 72 ч.
-
-Липоевая кислота при совместном введении с ифосфамидом вызывает увеличение глутатионпероксидазной активности и концентрации восстановленного глутатиона и в печени, и в почках и нормализует глутатионтрансферазную активность в почках, предотвращая активацию перекисного окисления липидов.
-
2-Меркаптоэтансульфонат при совместном введении с метотрексатом предупреждает активацию перекисного окисления липидов, увеличивая концентрацию восстановленного глутатиона в печени и почках, предотвращая снижение активности глутатионтрансфераз и глутатионредуктазы в печени и увеличивая глутатионпероксидазную активность в почках.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 72-76 итоговых научных студенческих конференциях СНО им. И.И. Мечникова ИГМУ (Иркутск, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009), Юбилейной студенческой научной конференции, посвященной 80-летию СПБГПМА (Санкт-Петербург, 2005), 69-й итоговой студенческой научно-практической конференции КрасГМА (Красноярск, 2005), The 7th Mongolian-Russian International Medical Symposium (Mongolia, 2006), Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии» (Москва, 2007), Пятой международной крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Судак, Крым, Украина, 2009), XV International Symposium on Atherosclerosis (Boston, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 работы, в том числе 4 статьи в российских рецензируемых и рекомендованных ВАК научных журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 28 рисунков, 22 таблицы. Список литературы представлен 307 источниками.
Глутатионтрансферазы
Межклеточный и межорганный транспорт глутатиона также отчасти обеспечивается окислением глутатиона до GSSG, как ферментативным, так и неферментативным, и последующим выделением его из клеток [198, 199]. В условиях выраженного окислительного стресса резко увеличивается уровень GSSG. В этом случае для поддержания соотношения GSH/GSSG (одного из важнейших показателей состояния внутриклеточной среды) GSSG быстро выводится из клетки [44].
Катаболизм глутатиона происходит внеклеточно [99] и инициируется у-глутамилтранспептидазой (у-ГТ), катализирующей перенос у-глутамильной группы глутатиона на акцептор, в качестве которого выступают аминокислоты, дипептиды и глутатион [94]. Цистеинил-глицин, образованный в реакции транспептидации, расщепляется дипептидазами до цистеина и глицина [94]. Расщепление внеклеточного глутатиона обеспечивает клетки цистеином, необходимым для синтеза внутриклеточного глутатиона (рис. 2) [44, 128, 218]. у-Глутамилтранспептидаза представляет собой гликопротеин, связанный с внешней поверхностью плазматической мембраны клеток различных типов [138]. Высокая экспрессия гена у-глутамилтранспептидазы наблюдается в клетках проксимальных трубочек почек, селезенки, легких, эпителия тонкокишечных ворсинок, ресничного тела, придатка яичка [82, 94, 138], то есть в тканях и органах, подверженных токсическим эффектам различных ксенобиотиков, что определяет особую значимость состояния системы глутатиона печени и межорганного транспорта глутатиона в условиях выраженного токсического воздействия.
Глутатион взаимодействует с электрофилами, образуя конъюгаты, которые быстро выводятся из организма. Путем сшивания глутатионтрансферазами ксенобиотиков с глутатионом обезвреживаются тысячи различных соединений, в том числе цитостатики, канцерогены и мутагены [11]. В процессе конъюгации клетка необратимо расходует глутатион [176].
GSH вместе с глутатионпероксидазой, глутатионтрансферазой, глутатионредуктазой и НАДФН образуют глутатионовую антипероксидную систему [11]. Функционирование данной системы приобретает особую значимость в условиях развития окислительного стресса различного генеза. Антипероксидная система глутатиона способна инактивировать как активные формы кислорода, так и вторичные продукты окисления [11]. Метаболизм глутатиона является одним из главных механизмов защиты клетки от препаратов, вызывающих развитие окислительного стресса — ксенобиотиков-прооксидантов. Глутатион принимает участие в предотвращении окислительного стресса на различных уровнях путем инактивации свободных радикалов, восстановления перекисей и непосредственно конъюгации с электрофильными веществами [122].
Глутатион может вступать в реакцию с белковыми сульфгидрильными группами, образуя смешанные дисульфиды. Данный процесс называется глутатионилированием и сопровождается модификацией белков, что влияет их на структуру и функцию. Образование дисульфидов между глутатионом и тиоловыми группами белков обеспечивает защиту ключевых остатков цистеина белка от необратимого окисления [53, 105], может как инактивировать, так и активировать ферменты [44, 127]. Регуляция некоторых путей передачи сигнала в клетке осуществляется путем глутатионилирования редокс-зависимых транскрипционных факторов (таких как АР-1 и NF-KB) [18, 53, 105, 222, 306] и протеинкиназ [285].
Одна из функций глутатиона - обеспечение пула цистеина, так как эта аминокислота нестабильна во внеклеточной среде и быстро самоокисляется до цистина [261]. В качестве источника цистеина глутатиону позволяет служить у-глутамильный цикл (рис. 1) [93, 176].
Глутатион является главным регулятором внутриклеточного тиолового редокс-статуса, его активная сульфгидрильная группа имеет восстановительные и нуклеофильные свойства [11].
Глутатион, выполняя свои функции, повышает резистентность клеток к вредным воздействиям — как химическим, так и физическим [11]. В условиях химиотерапии организм подвергается выраженному токсическому воздействию. Отдельные химиопрепараты и их метаболиты являются электрофилами, например, метаболиты таких алкилирующих препаратов, как оксазофосфорины [37]. Механизм действия других химиопрепаратов сопряжен с образованием активных форм кислорода. Примером являются антрациклины доксорубицин и эпирубицин [37]. В обоих случаях, нормализация уровня глутатиона сопровождается предотвращением токсических эффектов цитостатиков в клетках, тканях и органах [23, 39, 148, 206].
Значение глутатиона в условиях лечения опухолей не ограничивается увеличением резистентности к токсическому действию химиопрепаратов на интактные ткани и органы. Глутатион участвует в регуляции канцерогенеза, как предотвращая [74, 145, 151, 227], так и усиливая его [112, 130, 306]. Множественная лекарственная и радиационная устойчивость во многих опухолях по сравнению с нормальными тканями связана с высоким уровнем GSH [94]. Глутатион принимает участие в развитии резистентности опухолевых клеток к таким химиопрепаратам, как препараты платины, алкилирующие препараты и антрациклины [20, 22, 37]. Увеличение уровня глутатиона в опухолевых клетках сопровождается развитием резистентности к цитотоксическим препаратам [181, 186], таким как доксорубицин [36, 197, 205], препараты платины [71, 292], оксид мышьяка (III) [72, 156], паклитаксел [185]. Глутатион участвует в регуляции пролиферации [119, 181, 201, 208, 248] и метастазирования [210] опухолевых клеток. Глутатион как непосредственно, так и опосредованно участвует в репарации ДНК [159, 181].
Во многих опухолевых клетках увеличена экспрессия гена у-глутамилцистеинсинтетазы, что сопряжено с развитием лекарственной устойчивости [176]. Повышение чувствительности опухолевых клеток к химиопрепаратам достигается различными ингибиторами у-глутамилцистеинсинтетазы, в том числе Ь-бутионин-(8Д)-сульфоксимином (BSO) [165, 180, 266]. BSO и другие истощающие глутатион препараты неспецифичны, значительное истощение GSH in vivo вызывает повреждения в большинстве интактных тканей [94]. Вызванное В SO неселективное истощение GSH может приводить к делециям ДНК, тем самым провоцируя канцерогенез [226].
С высокой экспрессией гена у-глутамилтранспептидазы часто связывают увеличение уровня глутатиона в клетках опухолей [78, 219], таких как меланома [49], карцинома яичника [211], рабдомиосаркома [65, 209], гепатома [163], индуцированные у лабораторных животных саркомы [128]. Повышение активности фермента обеспечивает поступление в опухолевые клетки цистеина, лимитирующего синтез глутатиона (рис. 2) [44]. Значение у-глутамилтранспептидазы в прогрессии, инвазии и развитии лекарственной устойчивости опухолей [78] определяет её в качестве мишени противоопухолевой терапии.
Биохимические методы
В ходе эксперимента 35 мышам однократно внутрибрюшинно вводили гепатотоксический антиметаболит 5-фторурацил в терапевтической дозе 40 мг/кг. Изучали динамику показателей системы глутатиона в печени мышей через 3, 12, 24, 72 ч, 7 и 14 суток.
В ранние сроки (через 3-24 ч) после введения 5-фторурацила не происходит значимых изменений концентрации GSH (таблица 2). Через 72 ч уровень GSH понижается на 23%. В поздние сроки (7-14 сутки) отмечается стойкое повышение концентрации GSH. Через 7 суток концентрация GSH увеличивается на 25% и остается повышенной через 14 суток (на 24%).
Таким образом, в ответ на введение 5-фторурацила за снижением, следует стойкое компенсаторное увеличение концентрации GSH. Снижение концентрации GSH в ранние сроки предрасполагает к развитию гепатотоксических эффектов. Повышение концентрации восстановленного глутатиона в ответ на введение цитостатика в отдаленные сроки (вплоть до 14 суток) может служить фактором увеличения резистентности к алкилирующим препаратам, препаратам платины и антрациклинам [22].
Глутатионтрансферазная активность в печени при введении 5-фторурацила изменяется уже в ранние сроки (таблица 2). Через 3 ч активность увеличивается на 43%. Через 12 ч наблюдается пик увеличения активности ГТ (на 162%). Через 24 ч активность ГТ остается повышенной на 34%). К 72 ч происходит нормализация. Через 7 суток активность ГТ снижается на 57%. К 14 суткам активность ГТ нормализуется.
Динамика активности ГТ отражает защитную реакцию системы глутатиона на введение ксенобиотика, способного вызывать развитие окислительного стресса в тканях печени. Активация ГТ в ранние сроки предполагает возможность интерференции 5-фторурацила в схемах химиотерапии с цитостатиками, резистентность которых непосредственно зависит от состояния системы глутатиона.
Выраженное снижение активности ГР сопровождается синхронным снижением активности ГПО в оба срока (12 ч и 7 сутки). Одновременное снижение активности обоих ферментов антипероксидной системы предрасполагает к развитию выраженного окислительного стресса в тканях печени. Данные сдвиги определяют один из патогенетических механизмов развития гепатотоксического действия 5-фторурацила.
Наибольшее влияние 5-фторурацил оказывает на глутатионпероксидазную активность (таблица 2). Уже через 3 ч после введения 5-фторурацила отмечается увеличение активности ГПО на 38%, но через 12 часов оно резко сменяется снижением активности на 42% (таблица 2). Активность ГПО понижается на длительное время через 3-7 суток: через 72 часа она снижена на 31%, через 7 суток — на 52%.
Активность ГПО снижается как в ранние (12 ч), так и в отдаленные (72 ч и 7 суток) сроки. Данные сдвиги нарушают работу антипероксидной системы печени. Даже через 7 суток после однократного введения терапевтической дозы 5-фторурацила наблюдается дестабилизация системы ГР/ГПО в печени.
Сдвиги показателей системы глутатиона, выявленные при однократном введении 5-фторурацила в дозе 40 мг/кг, определяют один из патогенетических механизмов развития гепатотоксического действия препарата. Дестабилизация системы глутатиона начинается с выраженного нарушения антипероксидной системы печени через 12 ч после введения препарата. Затем нарушение системы глутатиона печени наблюдается через 72 ч, когда снижается концентрация GSH и активность ГПО. Через 7 суток происходит угнетение активности ГТ на фоне повторного синхронного понижения активности ферментов редокс-циклизации глутатиона
В ходе эксперимента 63 мышам однократно внутрибрюшинно вводили нефрогепатотоксический антиметаболит метотрексат в терапевтической дозе 150 мг/кг. Изучали динамику показателей системы глутатиона в печени мышей через 3,12, 24, 72 ч, 7 и 14 суток. При введении метотрексата концентрация GSH снижается через 12 ч на 16%, остается пониженной через 24 ч на 13% и через 72 ч на 8% (таблица 3). Через 7 суток показатель нормализуется и не изменяется до конца исследования. Данные стойкие сдвиги концентрации GSH согласуются с гепатотоксическим действием метотрексата.
Примечание: данные представлены в виде среднее ± стандартная ошибка среднего; в таблице приняты следующие обозначения: а - р 0,05, b - р 0,01, с - р 0,001; активность ферментов выражена в нмоль/мин на 1 мг белка; концентрация глутатиона выражена в мкмоль на 1 г ткани. Понижение концентрации восстановленного глутатиона согласуется с изменениями активности ферментов его метаболизма и происходит во время пикового повышения активности ГТ и одновременного снижения активности ферментов его редокс-циклизации через 12 ч.
Введение метотрексата сопровождается увеличением активности глутатионтрансфераз уже через 3 ч на 52% (таблица 3). Пик увеличения активности на 151% определяется через 12 ч после введения препарата. Через 24 ч показатель остается повышенным на 32%. Выраженное увеличение активности ГТ сменяется стойким её снижением на 3 и 7 сутки: соответственно на 26 и 66%. Только на 14 сутки происходит нормализация показателя.
Динамика активности ГТ позволяет сделать ряд выводов. Раннее увеличение активности ГТ в ответ на введение гепатотоксичного препарата является адекватной защитной реаіщией. Данный эффект метотрексата необходимо учитывать в схемах химиотерапии, в связи с потенциальным увеличением химиорезистентности в ранние сроки 3-24 ч. С 3 по 7 сутки отмечается нарушение детоксикационной функции печени, что предполагает увеличение токсического действия препаратов.
Изменение активности глутатионредуктазы метотрексатом носит сложный разнонаправленный характер и представляет собой двукратное чередование повышения активности фермента с понижением (таблица 3). Через 3 ч происходит увеличение активности фермента на 32%, затем активность его через 12 ч снижается на 32%. Вновь активность ГР повышается через 24 ч на 35% и понижается через 72 ч. Через 7 суток активность ГР остается пониженной на 58%. Нормализация показателя происходит через 14 суток. Сложные изменения активности фермента могут быть связаны как с непосредственными эффектами метотрексата, так и развитием окислительного стресса и нарушением окислительно-восстановительного статуса гепатоцитов. Метотрексат вызывает резкое снижение глутатионпероксидазной активности через 12 ч на 64% (таблица 3). Но уже через 24 ч происходит нормализация активности ГПО, сохраняющаяся во все последующие сроки исследования.
Изучение динамики показателей системы глутатиона позволяет сделать следующие выводы. При введении гепатотоксического антиметаболита метотрексата наблюдается дестабилизация системы глутатиона в печени. Нарушения в системе глутатиона носят двухфазный характер. В данном случае, как и при введении 5-фторурацила, через 12 ч наблюдается нарушение антипероксидной системы печени, когда происходит одновременное снижение активности ГПО и ГР. Кроме того, через 12 ч снижается концентрация GSH. Через 3-7 суток наблюдается снижение активности ГТ и повторное снижение активности ГР.
Сравнительная характеристика влияния 5-фторурацила и метотрексата на состояние системы глутатиона в печени, почках, селезенке и сердце мышей
Ифосфамид в дозе 400 мг/кг при однократном введении через 24 ч снижает активность ферментов системы ГР/ГПО: на 31% и 42% соответственно, что сопровождается активацией ПОЛ (таблица 19). Через 72 ч наблюдается адекватный защитный ответ системы глутатиона, предотвращающий активацию перекисного окисления липидов — выраженное увеличение активности ГПО в 5 раз по сравнению с 24 ч, и на 193% по сравнению с контрольными значениями (таблица 20). Несмотря на снижение активности ГР (на 38%), резкое повышение активности ГПО и отсутствие изменений других показателей системы позволяет избежать увеличения интенсивности ПОЛ.
В печени через 24 ч введение 2-меркаптоэтансульфоната с ифосфамидом увеличивает концентрацию GSH на 10% по сравнению с контролем, но не предотвращает снижения активности ГР (на 38%) и ГПО (на 56%) (таблица 19). Изменения в системе глутатиона печени при введении ифосфамида с 2-меркаптоэтансульфонатом и без него значимо не отличаются. Наблюдается снижение концентрации ТБК-активных продуктов на 74% в сравнении с группой, которой вводили только химиопрепарат (р 0,01). Данный эффект предотвращения развития ПОЛ в печени объясним с позиций окислительно-восстановительных преобразований больших количеств 2-меркаптоэтансульфоната в плазме. Восстановление дисульфидов плазмы (в том числе цистина) сопровождается повышенным захватом цистеина клетками, в том числе и гепатоцитами [116], что, вероятно, объясняет увеличение концентрации GSH и снижение концентрации ТБК-активных продуктов.
Введение 2-меркаптоэтансульфоната совместно с ифосфамидом через 72 ч не предотвращает снижение активности ГР (таблица 20). Активность ГПО нормализуется после снижения в ранний срок. Однако увеличения активности ГПО, происходящего при введении одного ифосфамида, не наблюдается. Отсутствие компенсаторного увеличения ГПО, вероятно, связано с подавлением 2-меркаптоэтансульфонатом ПОЛ в тканях печени уже в ранние сроки (через 24 ч).
Влияние 2-меркаптоэтансульфоната (месны) на состояние системы глутатиона и концентрацию ТБК-активных продуктов в печени при введении ифосфамида (ИФ) в дозе
Примечание: данные представлены в виде среднее ± стандартная ошибка среднего; в таблице приняты следующие обозначения: а - р 0,05, Ь-р 0,01,с-р 0,001 в сравнении с контрольной группой; 1 - р 0,01 в сравнении с группой, которой вводили ИФ. Активность ферментов выражена в нмоль/мин на 1 мг белка; концентрация глутатиона выражена в мкмоль на 1 г ткани; концентрация ТБК-активных продуктов выражена в нмоль МДА на 1 г ткани. В тканях почек ифосфамид через 24 ч вызывает активацию перекисного окисления липидов, более чем в два раза увеличивая концентрацию ТБК-активных продуктов (таблица 21). Кроме того, отмечается значимое снижение активности ГР на 35%. Через 72 ч, хотя и отмечается некоторое снижение уровня продуктов ПОЛ, их концентрация остается повышенной, что свидетельствует о стойком прооксидантном эффекте ифосфамида в тканях почек (таблица 22). Несмотря на снижение активности ГТ (на 38%) и по-прежнему умеренно сниженную активность ГР (на 25%), наблюдается адаптационная реакция в ответ на развитие ПОЛ: увеличение концентрации GSH (на 25%) и выраженное увеличение активности ГПО (на 133%). Таким образом, отмечается статистически значимая тенденция к снижению уровня ПОЛ; но в виду того, что компенсаторная реакция развивается отсроченно, к 72 ч окислительный стресс в почках не преодолен.
2-Меркаптоэтансульфонат в почках не предотвращает общую картину дестабилизации системы глутатиона ифосфамидом через 24 ч. Хотя уровень ТБК-активных продуктов увеличивается менее выраженно в сравнении с введением только ифосфамида (р 0,001) (на 42% вместо 132%), полностью активация ПОЛ не преодолена (таблица 21). Активность ГР остается сниженной (на 42%). Кроме того, по отношению к контролю снижается активность ГТ (на 37%), но по сравнению с введением ифосфамида без 2-меркаптоэтансульфоната активность ГТ не изменяется.
Через 72 ч после введения ифосфамида и 2-меркаптоэтансульфоната происходит нормализация активности ГТ, которая снижается при введении одного ифосфамида. Активность ГПО выраженно увеличена (на 224%). Несмотря на незначительное снижение концентрации GSH (на 13%), концентрация ТБК-активных продуктов снижается до уровня контроля (таблица 22).
Ранее было описано отсутствие нефропротекторного эффекта 2-меркаптоэтансульфоната при введении ифосфамида [252]. Предлагается следующее объяснение. 2-Меркаптоэтансульфонат не способен Таблица 21. Влияние 2-меркаптоэтансульфоната (месны) на состояние системы глутатиона и концентрацию ТБК-активных продуктов в почках при введении ифосфамида (ИФ) в дозе
Примечание: данные представлены в виде среднее ± стандартная ошибка среднего; в таблице приняты следующие обозначения: а - р 0,05, b - р 0,01, с - р 0,001 в сравнении с контрольной группой; к - р 0,05, m - р 0,001 в сравнении с группой, которой вводили ИФ. Активность ферментов выражена в нмоль/мин на 1 мг белка; концентрация глутатиона выражена в мкмоль на 1 г ткани; концентрация ТБК-активных продуктов выражена в нмоль МДА на 1 г ткани. предотвратить развитие ПОЛ в тканях почки через 24 ч, когда происходит наибольшее увеличение концентрации ТБК-активных продуктов. Процесс пероксидации запускается, за ним следует индукция синтеза ГПО и нормализация уровня маркеров ПОЛ. Но на ранних стадиях химиопротектор не предотвращает нефротоксического действия ифосфамида
Введение а-липоевой кислоты на фоне ифосфамида через 24 ч не влияет на активность ГР в печени, которая остается сниженной на 28%. Но а-липоевая кислота через 24 ч трехкратно увеличивает активность ГПО и концентрацию GSH на 36%. Активность ГПО увеличивается по сравнению с введением только химиопрепарата в 5,1 раза (р 0,001). Данные сдвиги сопровождаются снижением концентрации ТБК-активных продуктов на 46% по сравнению с контролем и на 64% по сравнению с введением ифосфамида без а-липоевой кислоты (рис. 23). Через 72 ч после введения а-липоевой кислоты совместно с ифосфамидом отмечается увеличение активности ГПО,
Влияние а-липоевой кислоты (ЛК) на концентрацию восстановленного глутатиона, глутатионпероксидазную активность и концентрацию ТБК-активных продуктов в печени при введении ифосфамида (ИФ) в дозе 400 мг/кг через 24 часа. Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение; - р 0,05, - р 0,01, _ р 0,001 в сравнении с контрольной группой; ++ - р 0,01, +++ - р 0,001 в сравнении с группой, которой вводили ИФ; концентрация ТБК-активных продуктов выражена в нмоль МДА на 1 г ткани. как и при введении ифосфамида отдельно. Также увеличивается концентрация GSH на 28% по сравнению с контролем. Уровень ТБК-активных продуктов значимо не изменяется (рис. 24).
В ранние сроки (через 24 ч) после введения ифосфамида происходит дестабилизация глутатионовой антипероксидной системы в печени, проявляющееся снижением активности как ГПО, так и ГР. Адаптационный ответ - выраженное увеличение активности ГПО - определяется через 72 ч. а-Липоевая кислота предотвращает нарушение работы антипероксидной системы в ранние сроки, увеличивая активность ГПО и концентрацию GSH в печени уже через 24 ч.
Влияние 2-меркаптоэтансульфоната на состояние системы глутатиона в печени и почках мышей
Выявленный эффект снижения концентрации GSH при совместном введении а-липоевой кислоты с метотрексатом определяет возможность развития окислительного стресса в печени, что обусловливает необходимость поиска гепатопротектора, лишенного этого эффекта. В качестве препарата коррекции системы глутатиона печени в условиях интоксикации метотрексатом был исследован 2-меркаптоэтансульфонат.
Метотрексат через 72 ч активирует ПОЛ в печени, понижая концентрацию GSH, активность ГТ и ГР. 2-Меркаптоэтансульфонат предотвращает снижение метотрексатом концентрации GSH и нормализует активность ГТ и ГР, предупреждая активацию ПОЛ. Данный эффект 2-меркаптоэтансульфоната подтверждает, во-первых, значение системы глутатиона в реализации антиоксидантных эффектов 2-меркаптоэтансульфоната, во-вторых, роль снижения активности ГР и ГТ в развитии прооксидантных гепатотоксических эффектов цитостатиков. Результаты указывают на потенциальную возможность использования 2-меркаптоэтансульфоната в качестве гепатонефропротектора при интоксикации метотрексатом.
Полученные в ходе исследования данные о снижении активности ГР печени при введении циклофосфамида и увеличении активности ферментов системы глутатиона при введении 2-меркаптоэтансульфоната представляют интерес для исследования эффектов их совместного введения. 2-Меркаптоэтансульфонат сохраняет свое действие на фоне введения циклофосфамида, нормализуя сниженную активность ГР в печени (таблица 15). 2-Меркаптоэтансульфонат применяют для предотвращения развития геморрагического цистита, возникающего при интоксикации оксазофосфоринами циклофосфамидом и ифосфамидом [37, 102]. Ифосфамид в отличие от циклофосфамида имеет нефротоксическое действие [89, 252], которое связывают с его метаболитом хлорацетальдегидом [88, 152, 257]. Нефротоксичность ифосфамида сопряжена с истощением тиолов клетки, в том числе GSH [304], и снижением активности ГТ [70]. 2-Меркаптоэтансульфонат не предотвращает нефротоксического действия ифосфамида [102, 190, 252].
Комплексное исследование системы глутатиона почек в условиях интоксикации ифосфамидом свидетельствует о выраженной активации ПОЛ, сопряженной со снижением активности ферментов метаболизма глутатиона (таблицы 21, 22). Дестабилизация системы глутатиона в почках начинается с уменьшения активности ГР через 24 ч (таблица 21), к которому через 72 ч присоединяется снижение активности ГТ (таблица 22), что сопровождается увеличением уровня ТБК-активных продуктов. 2-Меркаптоэтансульфонат при совместном введении с ифосфамидом не предотвращает снижения активности ГР и активации ПОЛ в почках через 24 ч (таблица 21). Полученные данные определяют возможную причину отсутствия нефропротекторного действия 2-меркаптоэтансульфоната при интоксикации ифосфамидом.
В условиях введения оксазофосфоринов регуляторный эффект 2-меркаптоэтансульфоната изменяется, а именно: снижается при введении циклофосфамида и полностью нивелируется при введении ифосфамида. Выявленные эффекты согласуются с данными о метаболизме оксазофосфоринов. Одним из токсичных метаболитов оксазофосфоринов является акролеин; 2-меркаптоэтансульфонат связывает и обезвреживает его (рис. 28) [22]. Расходом 2-меркаптоэтансульфоната в реакциях детоксикации акролеина, вероятно, объясняется снижение или отсутствие потенцирующего влияния тиола на активность ферментов метаболизма глутатиона.
2-Меркаптоэтансульфонат не предотвращает дестабилизации системы глутатиона и активации ПОЛ в почках при интоксикации ифосфамидом, что обусловливает необходимость поиска более адекватного препарата. В качестве препарата коррекции системы глутатиона почек и печени при введении ифосфамида была исследована а-липоевая кислота. а-Липоевая кислота при совместном введении с ифосфамидом полностью предотвращает активацию ПОЛ в печени и почках, вызывает раннее выраженное увеличение активности ГПО и концентрации GSH и в печени (рис. 23, 24), и в почках (рис. 25, 26). По сравнению с данными группы мышей, которым вводили только химиопрепарат, активность ГПО в печени увеличивается в 5,1 раза, в почках — в 2,6 раза. Кроме того, а-липоевая кислота нормализует активность ГТ в почках. а-Липоевая кислота, в отличие от 2-меркаптоэтансульфоната, на фоне введения ифосфамида сохраняет потенцирующее действие на систему глутатиона, предотвращая активацию ПОЛ в тканях печени и почек. Следует отметить, что в условиях интоксикации ифосфамидом и развития ПОЛ в исследуемых органах механизм действия а-липоевой кислоты изменяется. На первый план выходит резкое увеличение активности ГПО и концентрации GSH.
Увеличение содержания GSH при введении а-липоевой кислоты, видимо, связано как с восстановлением цистина плазмы до цистеина и увеличением его переноса в клетки (рис. 27) [116], так и индукцией синтеза глутатиона [101]. Повышение активности ГПО, вероятно, сопряжено с индукцией экспрессии генов ферментов путем активации редокс-чувствительных транскрипционных факторов [143, 297].
Потенцирование системы глутатиона и предотвращение активации ПОЛ в печени и почках позволяют рассматривать а-липоевую кислоту в качестве возможного нефрогепатопротектора в условиях интоксикации ифосфамидом.
