Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Пероксидное окисление липидов и антиоксидантная защита 11
1.1. Современные представления о механизме пероксидации липидов 11
1.2. Система антиоксидантний защиты организма 16
1.2.1. Ферментативный компонент системы антиоксидантной защиты клетки 17
1.2.2. Неферментативный компонент системы антиоксидантной защиты клетки 19
1.3. Фракционный и жирнокислотный состав липидов биомембран в физиологических условиях 21
1.4. Состояние процессов свободнорадикального окисления в патогенезе критических состояний организма 23
1.4.1. Состояние системы ПОЛ-АОЗ при некоторых патологиях 23
1.4.2. Особенности липидпероксидации у больных при хирургических вмешательствах 25
1.5. Анализ эффективности использования антиоксидантов в терапии некоторых патологических состояний 28
Глава 2. Материалы и методы исследований 34
2.1. Объем проведенных исследований 34
2.2. Методы определения показателей ПОЛ и АОЗ 39
2.2.1. Выделение липидов мембран эритроцитов, тромбоцитов и плазмы крови 39
2.2.2. Кинетический метод исследования параметров радикальной и антиоксидантной активности липидов 39
2.2.3. Определение содержания первичных продуктов ПОЛ 41
2.2.4. Определение концентрации общих липидов 42
2.2.5. Определение содержания фракций фосфолииидов и холестерина в липидах крови 43
2.3. Методы исследования показателей антиоксидантной системы эритроцитов 47
2.3.1. Определение активности супероксиддисмутазы 47
2.3.2. Определение активности каталазы 48
2.3.3. Определение содержания а-токоферола 49
2.4. Статистическая обработка результатов 49
Глава 3. Оценка метаболических эффектов комбинации анестетиков на процесс липидпероксидации крови на этапах хирургической операции 50
3.1. Исследование процесса пероксидации липидов эритроцитарных мембран 51
3.1.1. Особенности воздействия анестезии с пропофолом на уровень липидперокшдации 54
3.1.2. Влияние анестезии с кетамином на процесс липидпероксидации 57
3.2. Исследование процесса пероксидации липидов мембран тромбоцитов под влиянием анестезии с пропофолом или кетамином 59
3.3. Влияние анестезии с пропофолом или кетамином на уровень пероксидации липидов плазмы крови 61
Глава 4. Исследование характера влияния комбинации анестетиков на метаболизм фосфолипидов и холестерина крови на этапах хирургической операции 65
4.1. Метаболические эффекты анестезии с пропофолом на динамику липолиза мембранных и плазматических липидов крови 66
4.2. Характер влияния анестезии с кетамином на динамику липолиза мембранных и плазматических липидов крови 74
Глава 5. Оценка состояния системы антиоксидантной защиты эритроцитов при воздействии компонентов общей анестезии 83
5.1. Исследование характера влияния анестезии с пропофолом на активность СОД, каталазы и а-токоферола на этапах операции 84
5.2. Особенности влияния анестезии с кетамином на активность СОД, каталазы и а-токоферола на этапах операции 86
Глава 6. Анализ эффективности применения а-токоферола у больных при холицистэктомии 89
6.1. Влияние а-токоферола на процесс пероксидации и метаболизм мембранных и плазматических липидов крови в условиях анестезии с пропофолом 91
6.2, Воздействие а-токоферола на процесс пероксидации и метаболизм мембранных и плазматических липидов крови в условиях анестезии с кетамином 103
Заключение 113
Выводы 121
Практические рекомендации 122
Список литературы 123
- Современные представления о механизме пероксидации липидов
- Исследование процесса пероксидации липидов эритроцитарных мембран
- Метаболические эффекты анестезии с пропофолом на динамику липолиза мембранных и плазматических липидов крови
- Влияние а-токоферола на процесс пероксидации и метаболизм мембранных и плазматических липидов крови в условиях анестезии с пропофолом
Введение к работе
Актуальность исследовании. В последнее десятилетие, при изучении причин возникновения и формирования желчнокаменной болезни (ЖКБ), существенную роль отводят свободно-радикальным процессам липидов [21, 23, 174, 182, 248]. Одним из наиболее важных патогенетических механизмов, связанных с процессом пероксидации, является способность образующихся свободных радикалов взаимодействовать с фосфолипидами клеточных мембран. В результате наступают структурные изменения мембран, нарушается взаимосвязь функциональной активности системы ПОЛ - антиоксидантиоЙ защиты (АОЗ) [19, 34, 43, 71, 86, 100, 129, 174, 182], происходит накопление токсических продуктов окисления [73,156,175] и изменение метаболизма липидов в клетке [2, 23, 75, 100, 125]. Нарушение липидного обмена в мембранах характеризуется изменением соотношения между количеством фосфолипидов и холестерина, концентрация последнего значительно повышается [28, 32]. Существующая взаимообусловленность между скоростью окисления и изменением состава липидов рассматривается как физико-химическая основа гомеостаза процесса пероксидного окисления липидов [12, 27,44, 121].
Показана взаимосвязь между гемостазом и уровнем пероксидного окисления липидов и доказана возможность взаимоусиления этих процессов. Большая роль в этом отводится антиоксидантам [24, 36, 39, 47, 52, 57, 169].
При лечении ЖКБ наибольшее распространение получил метод лапароскопической холецистэктомии, который в свою очередь может вызвать дополнительную активацию ПОЛ, как ответ организма на хирургический стресс [21, 174]. Активацию ПОЛ могут индуцировать и препараты, используемые для анестезии. Показано прямое воздействие анестетиков, выражающееся в их ан-тиоксидантном или прооксидантном эффекте, и опосредованное влияние - путем изменения метаболизма липидов, активности ферментов, уровня гормонов, кровоснабжения тканей и органов [2, 60, 93, 111, 119, 154, 155]. Пропофол и кетамин являются представителями внутривенных анестетиков, для которых исследованы фармакокинетические параметры, эффекты на функцию сердечно-сосудистой системы [59, 60, 119]. Однако особенности влияния пропофола и кетамина на окислительный метаболизм липидов изучен недостаточно и имеющиеся в литературе данные единичны [2, 38].
Одним из факторов повышения интенсивности ПОЛ во время хирургической операции является гипоксия, а также гипероксия, которая часто возможна при применении эндотрахеального наркоза и интенсивной терапии с применением ИВЛ [54, 68]. В ряде работ авторами отмечается прямая зависимость выраженности гипоксии и интенсивности ПОЛ [112, 122, 123, 142]. Важным при хирургическом лечении является хирургический стресс, и введение больших доз биологически активных веществ за относительно короткий промежуток времени, которые могут повлечь за собой еще большее нарушение в системе ПОЛ-АОЗ. Лекарственные препараты, кроме основного фармакологического механизма воз/действия, могут оказывать двойное действие на процесс ПОЛ биомембраи. Антиоксидантные свойства обнаружены у противовоспалительных средств, спазмолитиков, антисептиков, противовирусных препаратов [4, 7, 9, 10, 131].
Знание динамики протекания процессов ПОЛ и АОЗ в ближайшие дни после операции, правильная оценка и своевременная коррекция этих изменений позволяет избежать более глубоких нарушений, которые могут наступить во время операции или в ближайшее время после ее окончания. Выяснение этого вопроса особенно значимо для практической деятельности анестезиологов и реаниматологов. Именно поэтому понимание характера изменений состояния системы ПОЛ-АОЗ под влиянием компонентов анестезии, может являться одним из маркеров, который определяет выбор компонентов для адекватного анестезиологического обеспечения хирургической операции.
Цель исследования. Оценить влияние пропофола и кетамина в составе поликомпонентной анестезии на состояние системы ПОЛ-АОЗ мембран эритроцитов, тромбоцитов и плазмы крови у больных ЖКБ при холецистэктомии и выявить возможность фармакологической коррекции процесса а-токоферолом.
Задачи исследования:
Исследовать метаболическое влияние анестезии с пропофолом на показатели системы ПОЛ-АОЗ плазмы крови, мембран эритроцитов и тромбоцитов у больных ЖКБ на этапах оперативного лечения.
Определить особенности влияния анестезии с кетамином на состояние системы ПОЛ-АОЗ плазмы крови, мембран эритроцитов и тромбоцитов у больных ЖКБ на этапах оперативного лечения.
Изучить особенности метаболизма липидов крови в условиях анестезии с пропофолом и кетамином, определить его взаимосвязь с выраженностью процесса ПОЛ.
Установить эффективность применения а-токоферола для коррекции процесса липидпероксидации крови у больных в условиях холецистэктомии.
Научная новизна работы. Впервые проведен периоперационный комплексный анализ состояния системы ПОЛ-АОЗ в условиях анестезии с пропофолом или кетамином при лечении ЖКБ методом лапароскопической холецистэктомии. Получены новые данные, существенно дополняющие сведения о метаболических нарушениях в мембранных и плазматических липидах крови на этапах интраоперационного влияния компонентов анестезии и процесса ре-оксигенации.
Установлен разнонаправленный эффект метаболического влияния исследованных компонентов анестезии на этапах операции. Окислительный метаболизм липидов характеризуется интраоперационным увеличением скорости окисления липидов и накоплением продуктов ПОЛ, при одновременном снижении концентрации общих липидов и активности компонентов АОЗ, ее ферментативного и неферментативного звена. Указанные изменения сопровождались активацией процесса липолиза мембранных и плазматических липидов.
Впервые показано, что анестезиологическое обеспечение с пропофолом стабилизирует состояние системы ПОЛ-АОЗ плазматических и мембранных липидов в условиях холецистэктомии. Диапазон метаболических изменений липидов крови под влиянием этой комбинации анестетиков на этапах хирургической операции менее выражен в сравнении с кетамином.
Полученные данные свидетельствуют о значительной индукции ПОЛ в условиях анестезии с кетамином, что подтверждается динамикой изменений в содержании первичных продуктов окисления липидов, фракций фосфолипидов и холестерина, разнонаправленным изменением коэффициента ОХС/ОФЛ на этапах исследования.
Установлено, что антирадикальный и мембранотропный эффект а-токоферола проявляется на предоперационном этапе и более выражен ин-траоперационно в условиях анестезии с пропофолом, сопровождается угнетением ПОЛ, увеличением содержания ОФЛ и снижением коэффициента ОХС/ОФЛ, при этом не получено достоверных различий указанных параметров в условиях анестезии с кетамином.
Выявлено, что при всех исследуемых условиях анестезиологического пособия операции холецистэктомии наиболее существенные изменения в системе ПОЛ-АОЗ установлены для липидов эритроцитов, чем тромбоцитов и плазмы крови.
Выявленные метаболические сдвиги в системе ПОЛ-АОЗ на этапах операции позволяют определить адекватность анестезиологического протокола, возможность ограничивать гомеостатические и гемокоагуляционные сдвиги путем введения в протокол анестезии а-токоферола, а также прогнозировать возможные направления послеоперационных осложнений.
Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты показали разнонаправленный характер влияния комбинаций анестетиков с пропофолом или кетамином на состояние системы ПОЛ-АОЗ крови при хирургическом лечении ЖКБ, что необходимо учитывать при анестезиологическом обеспечении операции с целью повышения компенсаторных возможностей организма.
Установленные нарушения состояния процессов ПОЛ и системы АОЗ в условиях лапароскопической холецистэктомии, дальнейшая активация на эта- пах лечения и их патогенетическая роль усиливают актуальность проблемы профилактики и коррекции этих нарушений антиоксидантами в период подготовки больного к операции, а так же во время операции и в ближайшее время после ее окончания.
Результаты исследования обращают внимание практикующих врачей на возможность ограничивать гомеостатические и гемокоагуляционные сдвиги путем введения в протокол анестезии пропофола в сочетании с а-токоферолом, что обеспечивает более высокую гемодинамическуго стабильность, нормализует метаболические процессы мембранных и плазматических липидов, улучшает АОЗ в клетке.
Основные положения, выносимые на защиту:
Хирургическое лечение ЖКБ сопровождается разнонаправленным изменением показателей состояния системы ПОЛ-АОЗ крови, динамика и диапазон изменений которых зависит от комбинации компонентов анестезии и этапа хирургической операции.
Специфический эффект действия комбинаций анестетиков на состояние системы ПОЛ-АОЗ (активация или угнетение) проявляется интраопераци-онно, усиливается на послеоперационном этапе и зависит от мембран клеток-мишеней (эритроцитов, тромбоцитов или плазмы крови).
Активацию липидпероксидации можно уменьшить путем введения в протокол анестезии а-токоферола, антирадикальный и мембранотропный эффект которого более выражен в условиях анестезии с пропофолом,
Внедрение результатов исследований в практику. Результаты диссертационной работы апробированы и внедрены в практическую работу анестезиологов-реаниматологов больниц г. Тюмени; комплексный анализ состояния системы пероксидного окисления липидов и антиоксидантной защиты клетки включен в рекомендательный протокол исследования больных при критических состояниях в отделения анестезиологии и реанимации ГЛПУ ТО «ОКБ №2»; в центр анестезиологии и реанимации ГЛПУ ТОКБ.
По материалам исследования подготовлены и опубликованы методические рекомендации «Комплексный анализ состояния системы пероксидного окисления и антиоксидантной защиты клетки» (Тюмень, 2005,- 70с. Соавторы С.Л. Галян, Г.Д. Кадочникова, В.В, Тихонова и др.), внедрены в работу анестезиологов-реаниматологов ГЛПУ ТО ОКБ №2 и ГЛПУ ТюмОКБ.
Полученные материалы внедрены в научные исследования и используются в учебном процессе кафедр биохимии, аналитической и органической химии ГОУ ВПО ТюмГМА Росздрава.
Апробация результатов исследования. Материалы и основные положения диссертации были доложены и обсуждены на Международном симпозиуме «Медицина и охрана здоровья», Тюмень, 2001; на Международном форуме « Аналитика и Аналитики », Воронеж, 2003; на 2-ом Международном симпозиуме «Проблемы биоритмов в естествознании», Москва, 2004; на 4-ой Межрегиональной научно-практической конференции «Фармация XXI века», Новосибирск, 2004; на научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной и клинической медицины, Тюмень, 2005; 2006.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 1.50 машинописных страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, глав собственных исследований и обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций. Работа представлена 29 таблицами и иллюстрирована 15 рисунками. Список литературы состоит из 180 отечественных и 84 иностранных источников.
Современные представления о механизме пероксидации липидов
В настоящее время не вызывает сомнений, что процесс пероксидации липидов (ПОЛ) играет чрезвычайно важную роль в жизнедеятельности клетки [5, 24, 25,30, 31, 34, 279, 250], т.к. отражает необходимые метаболические процессы [5, 11, 33, 146, 209], в том числе включает системы синтеза простаглан-динов, определяющие интенсивность ПОЛ в клетке [132, 162].
С другой стороны, повышенная интенсивность свободнордикального окисления (СРО) липидов во многих случаях является причиной более 100 заболеваний человека - от ревматоидного артрита, гепатита, инфаркта миокарда и др. до СПИДа [16, 20, 65, 77]. Свободным радикалом является любая молекула, содержащая один или более неспаренных электронов, например супероксид (02 ), гидроксид (НО). Свободные радикалы - крайне активные молекулы, способные вызывать повреждение и гибель клеток. Образующиеся свободные радикалы можно объединить в три большие группы: соединения реактивного азота; соединения реактивного хлора; соединения реактивного кислорода или активированные кислородные метаболиты (АКМ). Третья группа (АКМ) наиболее представительная и включает как радикальные, так и нерадикальные соединения кислорода [36, 114, 230, 233].
Одним из основных видов АКМ, генерируемых в различных участках клетки, является супероксидный радикал-анион, образующийся в результате одноэлектронной реакции восстановления кислорода в присутствии ферментов оксигеназ (ксантиноксидаза, митохондриальная цитохром-С-оксидаза, микро-сомальные монооксигеназы и др.). Среди неферментативных путей образования супероксидного радикала-аниона необходимо отметить аутоокисление гидрохинонов, лейкофлавинов, катехоламинов, тиолов, тетрагидроптеринов, ферридоксина [113, 118, 141]. Двухэлектронной формой восстановления кислорода является пероксид водорода (Н2О2), который не является радикалом, однако инициирует СРО и цитотоксичен [114]. Взаимодействие пероксида водорода с супероксидным радикалом-анионом или другими восстановителями, например, аскорбат, глутатион, цистеия, приводит к возникновению одного из активных клеточных инициаторов СРО-радикала гидроксила (НО) [118, 208]. Считается, что цитотоксичность АКМ крови проявляется в основном к эритроцитам, что ведет к увеличению содержания метгемоглобина, инициации процесса ПОЛ, а гемоглобин служит медиатором образования гидроксильных радикалов [79, 81, 115]. Активные формы кислорода способны реагировать с субстратами любой природы: белками, нуклеиновыми кислотами, углеводами и, прежде всего, полиненасыщенными жирными кислотами фосфолипидов биомембран [36, 72, 122]. Однако следует отметить, что отношение к АКМ в последнее десятилетие изменилось и они стали рассматриваться не только как цитотоксические деструктивные молекулы, но и как регуляторные соединения [220, 235]. В частности, АКМ отводится ведущая роль в индукции апоптоза [141, 210], в регуляции тонуса сосудов, микроциркуляции и коагуляции [207, 222].
Общеизвестно, что окисление липидов биомембран протекает по законам радикально-цепных процессов с вырожденным разветвлением. Имеются многочисленные варианты изложения теории цепных процессов применительно к биологическому окислению [26, 36, 166], Предлагаемый вариант отличается большим вниманием к вопросам механизма кинетики реакций пероксидного окисления липидов и к составу продуктов окисления. Пероксидация липидов это сложный, зависящий от многих факторов, процесс, который представляют собой ряд цепных реакций, включающих зарождение, продолжение, разветвление и обрыв цепей окисления [26, 114,229].
Зарождение цепей окисления: Зарождение цепей с образованием первичных радикалов (R) может быть вызвано как атакой АКМ, так и под действием экзогенных физических (ультрафиолет, радиация и др. излучения) и химических факторов (воздействие тетрахлорметана, пестицидов, ксенобиотиков, солей тяжелых металлов и др.) [12, 51,148].
На скорость инициирования процесса окисления имеют существенное влияние жирнокислотного состава (ЖКС) фосфолипидов, структурированность липидного бислоя, накопление металлсодержащих комплексов переменной валентности [34, 173], а также инактивации ферментных и неферментных антиоксидантних систем [24, 36, 178], Способ инициирования не влияет на характер кинетики процесса и отражается только на общей скорости окисления, длительности периода индукции.
Продолжение цепей окисления: В аэробных условиях алкильныЙ радикал взаимодействует с растворенным с среде молекулярным кислородом, в результате чего образуется пероксидный радикал (R02), который в свою очередь атакует молекулы липидов с образованием гидропероксида (ROOH) и нового радикала R , индуцирующего продолжение окислительной цепи; Скорость продолжения цепи окисления существенно зависит от степени ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов (ФЛ). Однозначно доказано, что линолеаты окисляются в 10-40 раз быстрее, чем олеаты, и примерно в 2 раза медленнее, чем линоленаты. ЖК состав ФЛ определяет большую устойчивость к окислению ФХ и СФМ, по сравнению с другими фракциями ФЛ, имеющих в составе больше ненасыщенных ЖК компонентов [26, 28], например, фосфатидилэтаноламина (ФЭА). При активации процесса окисления ля-пидов мембран изменяется соотношение содержания общего холестерина к сумме общих фосфолипидов (ОХС/ОФЛ), за счет увеличения уровня холестерина. Такого рода взаимосвязь между скоростью окисления и изменением состава липидов рассматривается как физико-химическая система гомеостаза ПОЛ [27, 28].
Исследование процесса пероксидации липидов эритроцитарных мембран
Определение общих фосфолипидов и отдельных фракций проводили после предварительного хроматографического разделения в тонком слое сорбента и последующего количественного определения на фотоколориметре по окрашенному продукту с малахитовым зеленым [53, 88, 107]. Для этого гептано-вый экстракт (9 мл) делили на две части (2/3- и 1/3-объема). Удаляли растворитель под вакуумом до сухого остатка. Первый сухой остаток растворяли в 0,2 мл. смеси хлороформ-метанол (2:1), для определения фосфолипидов, а второй - изопропиловом спирте, для определения холестерина.
Определение общих фосфолипидов в липидном экстракте.
Содержание фосфолипидов в биологическом материале оценивали по содержанию фосфора, так как один атом фосфора присутствует в каждой молекуле фосфолипида. После сжигания органической части в экстракте липи-дов, неорганический фосфор (Рн) определяли в реакции с малахитовым зеленым. Метод основан на образовании окрашенного комплекса малахитового зеленого с фосфомолибденовой кислотой.
Липидные экстракты сжигали в муфельной печи при температуре 400С в течении 1 часа. После охлаждения в каждую пробирку приливали 1 мл. воды и 2 мл. реактива «С» (0,45% водный раствор малахитового зеленого и 4,2% раствора молибдата аммония в 4 М хлористоводородной кислоте в соотношении 3:1, фильтровали и прибавляли 2% раствор тритона Х-100 из расчета 1 мл, раствора на 50 мл. фильтрата), перемешивали встряхиванием. Замеряли оптическую плотность (Е) при длине волны 660 нм против контроля. В контроле -1 мл. воды и 2 мл. реактива «С».
Количество неорганического фосфора определяли по калибровочной кривой (в ммоль/л) или по формуле: где: РЛИ[7- количество неорганического фосфора, Е - экстинкция, 0,32 - коэффициент пересчета на средне-молекулярную массу фосфолипидов. Определение фракций фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на сияикагеле.
Для разделения фосфолипидов использовали пластины для ТСХ «Силу-фол» без флуоресцирующих добавок (Лахема, Чехия) высотой не менее 15-20 см. и использовали систему содержащую хлороформ - метанол - аммиак концентрированный - вода в соотношении 65 : 25 : 3 : 1,5. Хроматографиче-скуго камеру предварительно насыщали. Затем готовили 1А объема смеси необходимой для разделения фосфолипидов и выливали в камеру. Фильтровальная бумага должна равномерно пропитаться реагентами, после чего их остатки выливали и в камеру заливали полный объем необходимый для работы. Сухой липидный экстракт растворяли в 0,2 мл. смеси хлороформ:метаиол (2:1). Полученный раствор полностью наносили на нижний край пластины в виде пятна диаметра около 1 см. Нанесенное пятно должно располагаться на расстоянии не менее 1 см от нижнего и бокового края пластины. Нанесение проводили специальной пипеткой-дозатором. Пластину с нанесенным и высушенным ли-пидным экстрактом помещали вертикально в хроматографическую камеру так, чтобы нижний край пластины находился в растворе на дне камеры, но уровень жидкости должен быть ниже места нанесения экстракта. Камеру герметично закрывали. Процесс хроматографии проводили до подъема фронта растворителей к верхнему краю пластины (не доходя 1-2 см до края). Затем пластину вынимали, отмечали фронт растворителя, хорошо высушивали и вновь помещали в ту же камеру для повторной разгонки до того же уровня. По окончании хроматографии пластину тщательно сушили до исчезновения паров аммиака. Для окраски и идентификации фракций хорошо высушенную пластину помещали на несколько минут в камеру насыщенную парами кристаллического йода. Фракции фосфолипидов окрашиваются желто-коричневый цвет. Для данной системы растворителей и используемой марки силикагеля расположение фракций, в соответствии с величинами Rf, следующее (снизу - вверх): 1- лизофос фатидилхолин, 2- фосфатидилсерин, 3- сфингомиелин, 4-фосфатидилхолин, 5-фосфатидилэтаноламин. Обнаруженные фракции фосфолипидов отмечали и пластину оставляли па воздухе до испарения йода (1-2 дня).
Для идентификации фракций фосфолипидов при отработке метода тонкослойной хроматографии использовали в качестве «свидетелей» анализируемые фосфолипиды. Для этого рядом с экстрактом на пластину наносили растворы «свидетелей», проводили хроматографическое разделение и затем окраску. По локализации пятна «свидетеля» судили о положении определенных фракций фосфолипидов в полученной хроматограмме экстракта.
Для количественного определения фосфолипидов после обесцвечивания пластин, слой силикагеля с соответствующими фракциями фосфолипидов счищали в чистые сухие пробирки. Пробирки укладывали в контейнер и помещали его в муфельную печь на 1 час при температуре 400С для сжигания органических веществ. Затем контейнер вынимали, охлаждали. Содержание фосфолипидов в пробах соответствует количеству неорганического фосфора, оставшегося после сжигания органического вещества, поэтому далее определяли содержание неорганического фосфора.
В каждую пробирку приливали 1,5 мл. воды, тщательно перемешивали встряхиванием, оставляли на 10-15 минут. Затем центрифугировали 10 мин. при 1500 об/мин и супернатаыт полностью переносили в другую пробирку. К пробам, освобожденным от силикагеля, приливали по 2 мл. реактива малахитового зеленого. Сразу фотометрировали против контроля при длине волны -660 им. Для контроля на Рн с использованной в работе пластины счищали участок силикагеля свободный от липидов (снизу или сбоку) и анализировали вместе с пробами. Количество неорганического фосфора определяли по формуле:
Метаболические эффекты анестезии с пропофолом на динамику липолиза мембранных и плазматических липидов крови
В настоящей главе представлены результаты исследования, которые выявляют характер действия комбинаций анестетиков на метаболизм фосфоли-пидов и холестерина у больных 1-ой и 2-ой клинических групп, характеристика которых представлена в главе 2. Экстракцию липидов крови проводили смесью растворителей гептан/изопропиловый спирт. В гептановом экстракте липидов оценивали метаболизм ФЛ и холестерина на этапах операции. Использование субстрата одной природы, для анализа параметров липидперокси-дации и фракционного состава липидов, позволило определить достоверные корреляционные связи между ними. Для оценки клеточного состава ФЛ мембран использовали эритроциты и тромбоциты, а также оценивали ФЛ состав плазмы крови.
Физико-химические свойства мембран во многом определяются жирно-кислотным составом фракций фосфолипидов. Мембраны клеток, формирующие различные органы, существенно не отличаются по фосфолипидному составу. Поэтому исследование мембран, особенно эритроцитарных, вполне отражает состав фосфолипидов в любом органе [18, 161].
В проведенном анализе собственных данных оценивалось соотношение следующих фосфолипидных фракций: фосфатидил этанол амин а (ФЭА), фосфа-тидилхолина (ФХ), сфингомиелина (СФМ), фосфатидилсерина (ФС), лизофос-фатидилхолина (ЛФХ). Кроме этого оценивали содержание эфиров холестерина (ЭХС) и свободного холестерина (СХС), рассчитывали коэффициент ОХС/ОФЛ. Определяли характер парных корреляционных связей параметров ПОЛ и состава ФЛ.
Нарушения структуры и функций клеточных мембран, происходящие при липидпероксидации, сопровождаются вымыванием из мембран окисленных липидов и заменой их новыми более ненасыщенными липидами. Это облегчает процесс самообновления мембранных структур и за счет изменения гидрофобности слоя влияет на проницаемость мембран, на активность мем-браносвязанных ферментов и ионный транспорт. Понижение гидрофобности мембран, клеток связано с увеличением содержания гидрофильных углеводородных хвостов, что в свою очередь ведет к вытеснению последних из толщи мембраны к ее поверхности и вызывает появление в мембране своеобразных пор. Исходя из того, что основным субстратом пероксидного окисления липи-дов являются полиненасыщенные жирные кислоты, можно ожидать увеличение жесткости мембран, следовательно, нарушение проницаемости и функций данной клетки. Увеличение жесткости связано с изменением соотношения ненасыщенных и насыщенных жирных кислот в сторону увеличения последних. Кроме того, нарушается обмен холестерина, который участвует в поддержании целостности, проницаемости и функциональной активности мембран.
Однако, при избыточном появлении свободыорадикальиых форм, самоускоряющийся процесс ПОЛ приводит к полному разрушению ненасыщенных липидов, нарушению структуры и функции белков, нуклеиновых кислот и других молекул, в конечном счете, к гибели клетки [24, 24, 94,175].
Метаболические эффекты анестезии е пропофолом на динамику липо-лиза мембранных и плазматических липидов крови
По нашим данным при исследовании липидной фазы мембран эритроцитов под влиянием компонентов анестезии с пропофолом на этапах хирургической операции происходит разнонаправленное изменение фракций ФЛ (таблица 4.1) однонаправленное (в сторону увеличения) общего холестерина и его фракций.
В мембранах эритроцитов установлен интраолерационно более низкий уровень ОФЛ {на 12,12%; р 0,05), который не имеет достоверных различий с уровнем ОФЛ на послеоперационном этапе.
Указанные факты отражают разнонаправленное изменение фракций ФЛ: уменьшение ФЭА - на 31,62% (р 0,05), ФХ - на 23,58% (р 0,01), СФМ - на 13,58% (р 0,05), ЛФХ - 25% (Р 0,01) на фоне увеличения ФС - на 44,78% (р 0,01) и ЛФХ - на 8,93% (р 0,05) в сравнении с предоперационным состоя ниєм. Обращает на себя внимание факт значительного увеличения более ненасыщенной фракции ФЛ (ФС и ФЭА) на 74,88% (р 0,001) на интраоперацион-ном этапе, при одновременном увеличении ОХС на 42,32% (р 0,01). В струк туре ФЭА и ФС глицерол этерифицирован преимущественно семейством со-3 полиеновых жирных кислот (а-линоленовая, эЙкозапентаеновая, эйкоза-гексаеновая, докозагексаеновая). Эфиры ХС содержат главным образом поли-еновьте жирные кислоты [161].
Увеличение ОХС обусловлено повышением содержания СХС (на 52,81%; р 0,05) и ЭХС (на 25,15%; р 0,05), что привело к увеличению коэффициента ОХС/ОФЛ (на 42,32%; р 0,01). Вьшвленная тенденция в изменении содержания ОХС и его фракций сохраняется и иослеоперационно (увеличение всех параметров на 14-15%, р 0,05). Что касается повышения коэффициента ОХЛ/ОФЛ, то данное обстоятельство приводит к изменению физических характеристик мембран, то есть клеточная мембрана становится более жесткой и доступной для воздействия процессов свободнорадикального окисления (рис. 4.1) [34, 35]. Указанное обстоятельство свидетельствует о деструктивных изменениях в мембранах, как внутреннего слоя (ФС и ФЭА), так и наружного (ФХ и СФМ), и отражает резко возросшую потребность клеток в антиокси-дантном потенциале для их нормального функционирования в послеоперационном периоде.
Влияние а-токоферола на процесс пероксидации и метаболизм мембранных и плазматических липидов крови в условиях анестезии с пропофолом
Разнообразное действие одного и того же препарата на активность различных ферментов свидетельствует о нарушении сбалансированности их функциональной деятельности [154, 155]. Поэтому, используя те или иные лекарственные средства в предоперационный период, во время операции и после операционный период, особенно их различные сочетания и комбинации, следует помнить о их неблагоприятном действии на ферменты АРЗ, а следовательно и на процессы оксигенации гемоглобина и на деление клеток. Последней функцией обеспечиваются естественное деление всех соматических клеток в различных органах и тканях, процессы регенерации тканей, подвергшихся хирургической агрессии и, наконец, все виды кроветворения - эритроцитопоэз, лейкоцитопоэз и тромбоцитопоэз [12, 146, 154, 155].
Таким образом, анестезиологические и снотворные препараты, помимо основного обезболивающего эффекта обладают побочными свойствами - они снижают или повышают активность ферментов антирадикальной защиты. Разнообразное действие одного и того же препарата на активность различных ферментов свидетельствует о нарушении сбалансированности их функциональной деятельности и требует тщательного исследования.
В наших исследованиях при изучении активности СОД и каталазы на этапах хирургической операции было установлено однононаправленное изменение активности антиоксидантных ферментов под влиянием компонентов анестезии с пропофолом (табл. 5.1). В условиях анестезии с пропофолом выявлена устойчивая тенденция ингибирования активности СОД и каталазы на этапах исследования. Гипоксия, возникающая как результат хирургической травмы и действия компонентов анестезии, вызывает достоверное снижение активности СОД на 15,63% (р 0,05) на послеоперационном этапе в сравнении с доопера-ционным этапом. Одновременно происходит послеоперационное снижение активности каталазы на 14,50% (р 0,05) в сравнении с исходным уровнем. Большое значение имеет обнаруженный дефицит а-ТФ в мембранах эритроцитов, как абсолютный (по отношению к контролю), так и относительный (на этапах исследования), в особенности с учетом данных о его роли в регуляции архитектоники, липидного бислоя и АОЗ. Содержание а-ТФ прогрессивно снижается от исходного уровня к послеоперационному на 21,88% (р 0,05). В мембранах эритроцитов во время хирургической операции отмечается снижение активности анти оксид антной защиты, при этом страдает как ферментативное, так и неферментативное ее звенья, что демонстрируется статистически значимым возрастанием коэффициентов ДК/СОД в 1,41 раза (р 0,05), ДК/ а-ТФ - в 1,49 раза (р 0,05) интраоперационно. Сравнительное изучение динамики коэффициентов ДК/СОД и ДК/а-ТФ свидетельствует о том, что анестезия с пропофолом способствует прогрессивному снижению данных параметров на послеоперационном этапе, при этом значения не имеют достоверных различий с исходным уровнем.
Результаты исследования свидетельствуют о благотворном влиянии компонентов анестезии с пропофолом на состояние системы АОЗ в мембранах эритроцитов, что подтверждается снижением коэффициента ДК/СОД на 22,5% (р 0,05) и ДК/ а-ТФ - на 32,1% (р 0,05) на послеоперационном этапе в сравнении с интраоперационным. Исследование системы антиоксидантной защиты мембран эритроцитов показало, что нарушение равновесия в системе ПОЛ-АОЗ создает условия для изменения лииидного бислоя мембран эритроцитов. Подтверждением этому является наличие статистически значимой отрицательной корреляционной зависимости между активностью СОД и величиной коэффициента ОХС/ОФЛ (г = -0,68, р 0,05). Проведенный анализ показал, что независимо от этапа исследования активность СОД достоверно коррелировала с содержанием ДК (г = 0,63, р 0,05), СО (г = 0,71, р 0,05).
Подтверждением существующих тесных связей между активностью ка-талазы и показателями липидпероксидации является наличие положительной корреляционной зависимости с содержанием ДК (г = 0,63, р 0,05), СО (г = 0,67, р 0,05), а также, отрицательного вектора связи с коэффициентом ОХС/ОФЛ (г = -0,74, Р 0,05). Данные корреляционного анализа согласуются с таковыми для СОД. И это неслучайно, т.к. СОД обеспечивает удаление из эритроцитов посредством дисмутации деструктивного супероксидного анион-радикала с образованием пероксида водорода, который разлагается каталазой и глутатионпероксидазой. Активность СОД имеет положительный вектор выраженной корреляционной связи с каталазой равный 0,97 (р 0,05).
В наших исследованиях при изучении активности СОД и каталазы на этапах хирургической операции было установлено однононаправленное изменение антиоксидантной активности ферментов и (ьТФ под влиянием компонентов анестезии с кетамином (табл. 5.2). При этом следует отметить, что тенденция к снижению указанных параметров на послеоперационном этапе при анестезии с кетамином, в 1,5 раза (р 0,05) более выраженная по сравнению с ин-фузией компонентов с пропофолом. Ингибирование активности СОД и каталазы подтверждается достоверным снижением параметров на 21,03% (р 0,05) и 21,27% (р 0,05) на послеоперационном этапе в сравнении исходным значени ем. Содержание а-ТФ достоверно снижается от исходного уровня к послеоперационному значению на 29,68% (р 0,05).
О более значительном нарушении равновесия в системе ПОЛ/АОЗ в условиях анестезии с кетамином свидетельствует характер динамики коэффициентов ДК/СОД и ДК/а-ТФ на этапах исследования. Интраоперационное повышение параметров ДК/СОД и ДК/а-ТФ в 1,8 раза (р 0,05) демонстрирует уменьшение способности СОД и а-ТФ участвовать в инактивации АМК а, следовательно, тормозить процесс ПОЛ. Выявленная тенденция сохраняется и на послеоперационном этапе, при сопряженном достоверном снижении значений, однако условия анестезии с кетамином не обеспечивали возвращения уровня показателей к исходному значению.
