Введение к работе
Актуальность исследования Биохимические механизмы регуляции пролиферации, дифференцировки и апоптоза имеют основополагающее значение не только при нормальном функционировании основных процессов жизнедеятельности организма, но и при развитии патологических состояний, в том числе злокачественных опухолей В клеточных линиях, полученных из различных новообразований человека, сохраняются опухолеспецифические изменения генома и особенности, характерные для исходных опухолевых клеток Это позволяет использовать опухолевые клеточные линии в качестве адекватных моделей для исследования механизмов биохимических процессов, а также тестирования и оценки эффективности противоопухолевых препаратов (Drexler, MacLeod, 2003, Shoemaker, 2006) Одной из таких экспериментальных моделей является эритромиелолейкозная линия человека К562
Известно, что многие химические реагенты, в том числе противоопухолевые, способны индуцировать дифференцировку опухолевых клеток как in vivo, так и in vitro, в ряде случаев сопровождающуюся запуском апоптотических процессов (Волкова и др, 2003, Mengubas et al, 1996, Robertson et al, 1997, Term et al, 1998) Механизм действия таких соединений может быть различным Например, алкилирующие агенты (циклофосфан, дипин, тиофосфамид, митомицин С), образующие с ДНК или РНК прочные ковалентные связи, нарушают их синтез и вызывают гибель клеток (Wang et al, 1996, Белоусов и др ,
Maanen et al, 2000, Регистр лекарственных средств России , 2006, Mignone, Weber, 2006) Другие соединения (метотрексат, цитарабин, флюдара-бин, 5-фторурацил, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, сульфамиды) могут выступать в качестве антиметаболитов ключевых молекул клетки, в том числе основных метаболических ферментов ДНК- и/или РНК-полимераз, ферментов гликолиза и пентозофосфатного цикла, карбоксиангидраз, Са2+-зависимых ферментов (Chunduru et al, 1993, Bretner et al, 1999a, Bretner et al, 1999b, Гершанович,
Поддубная, 1999, Supuran et al, 2004, Tiwan et al, 2005, Sampath et al, 2006)
В настоящее время установлено, что к числу первостепенных биохимических маркеров апоптоза относится изменение активности каспаз (caspases, cys-teinyl aspartate-specific proteinases) Модуляция активности этих ферментов является ключевым фактором в процессах индукции/ингибирования апоптоза Кроме того, показано, что некоторые каспазы способны трансактивироваться при индукции дифференцировки (Pandey et al, 2000) Пандей и соавт (Pandey et al, 2000) показали, что при дифференцировке клеток линии U937, индуцированной ТФА (12-О-тетрадеканоилфорболацетат), происходит выход цитохрома с из митохондрий и активация каспазы-3 При дифференцировке клеток про-миелоцитарного лейкоза HL-60 и клеток остеосаркомы, индуцированной рети-ноевой кислотой и тритерпеноидом (CDDO), соответственно, также отмечено увеличение функциональной активности каспаз-3, -8 и -9 (Doule et al, 2002, Ito et al, 2001) Кроме того, функциональная активность каспаз и других цистеино-вых и сериновых протеиназ во многом определяет чувствительность опухолевых клеток к неспецифическому цитотоксическому лизису (ЧЦТ-лизису) есте-
ственными киллерными клетками (ЕКК) организма (Laskay, Kiesslmg, 1986, Ве-noist et al, 1989, Prado et al, 1995) Поэтому изучение биохимической регуляции таких клеточных функций как пролиферация, дифферепцировка и апоптоз на уровне вторичных и третичных мессенджеров, а также поиск химических соединений, способных регулировать указанные клеточные процессы, представляет несомненный интерес не только для изучения специфики развития и функционирования опухолевой клетки, но и для ведения эффективной химиотерапии
Цель настоящей работы состояла в изучении биологического действия
ряда структурно различных ксенобиотиков на индукцию или ингибирование
процессов дифференцировки и/или апоптоза опухолевых клеток К562 и моду
ляцию их чувствительности к НЦТ-лизису ЕКК В качестве химических реа
гентов нами были выбраны тимидин, бутират натрия, диметилсульфоксид
(ДМСО), хинолин (0, в том числе его jV-оксидированные производные (хино-
лин-1 -оксид - QO, 4-нитрохинолин-1-оксид - 4-NQO), циклофосфан, производ
ные тиазофосфола (2-третбутиламино-4-тиоксо-4-хлорметил-1,3,4-
тиазофосфол-2-ин, 2-анилино-4-тиоксо-4-хлорметил-1,3,4-тиазофосфол-2-ин)
В задачи исследования входило
Изучить цитотоксическое и антипролиферативное действие на клетки К562 химических реагентов с известным механизмом действия, а также новосинте-зированных производных тиазофосфола, определить ЕСю,
На основе данных по токсичности определить дифференцирующую активность нетоксичных доз каждого из исследуемых соединений, а также комбинаций Q, QO, 4-NQO с индукторами эритроидной дифференцировки (тими-дином, бутиратом натрия и ДМСО) по отношению к клеткам К562 При изучении дифференцирующего действия реагентов определить основные белки и ферменты эритроидного и миелоидного путей дифференцировки опухолевых клеток,
Изучить влияние химических реагентов на модуляцию активности каспаз в клетках К562 как возможных участников расхождения путей передачи сигнала от процессов дифференцировки к апоптозу,
На основе полученных данных исследовать влияние производных тиазофосфола на процессы окисления и восстановления цитохрома с как одного из основных посредников передачи сигнала апоптоза в клетке,
Провести сравнительный анализ биологического действия исследуемых химических реагентов на клетки родительской линии К562 и сублинии, экс-прессирующей температурочувствительный мутантный белок р53 Val 135 (K562/ts-p53),
Определить модулирующее действие ксенобиотиков и их комбинаций на чувствительность клеток К562 к НЦТ-лизису лейкоцитами человека
Научная новизна Впервые изучено дифференцирующее и апоптогенное действие производных тиазофосфола на клетки линии К562 Показано, что третбутиламиновое производное индуцирует эритроидную дифференцировку клеток К562, в клетках имеет место активация каспаз-3 и -9 с последующим запуском апоптоза Напротив, анилиновое производное ингибирует эритроидную
и индуцирует моноцито-макрофагальную дифференцировку опухолевых клеток, при этом регистрируется активация каспаз-3, -8, -9 и последующее развитие апоптоза Нами показано, что переключение процессов клеточной дифференцировки с одного пути на другой, например, с эритроидного на моноцито-макрофагальный, влечет за собой переключение работы каспаз и модуляцию процессов апоптоза в клетках К562
Впервые экспериментально определено влияние сочетанного действия индукторов эритроидной дифференцировки клеток К562 и ^-оксидированных производных хинолина на чувствительность опухолевых клеток к НЦТ-лизису лейкоцитами периферической крови (ЛПК) человека, установлено, что и диф-ференцировка, и апоптоз вносят вклад в модуляцию НЦТ-лизиса клеток-мишеней клетками-эффекторами
Впервые изучено влияние сочетанного действия тимидина, бутирата натрия и ДМСО с yV-оксидированными производными хинолина на модуляцию эритроидной дифференцировки и апоптоза в клетках K562/ts-p53 Показано, что при обработке клеток сублинии эритроидными индукторами синтез гемоглобина значительно усиливается по сравнению с клетками родительской линии К562 Кроме того, в клетках с мутантным р53 Val 135 процессы апоптоза также протекают активнее
Теоретическая и практическая значимость работы Выполненная работа представляет как теоретический, так и практический интерес в области клеточной биологии и молекулярной медицины Для изучения сочетанного действия индукторов различных путей дифференцировки опухолевых клеток на ряд важнейших клеточных функций - пролиферацию, апоптоз, чувствительность к НЦТ-лизису эндогенными ЕКК - использовалась модельная система Значительное количество противоопухолевых соединений обладают дифференцирующей активностью по отношению к клеткам опухолей т vivo и опухолевых клеток in vitro, проявляющуюся в зависимости от дозы используемого препарата и условий обработки В связи с этим, нами показано, что при обработке опухолевых линий, например, клеток линии К562, индукторами эритроидной и миелоидной дифференцировки может наблюдаться подавление пролиферации, индукция и ингибирование апоптоза и модуляция чувствительности клеток к НЦТ-лизису ЕКК Таким образом, при клиническом использовании противоопухолевых агентов необходимо учитывать эффекты изменения целого ряда клеточных функций, возникающие под действием (или на фоне) каждого из составляющих комбинации Кроме того, результаты исследований могут быть использованы в учебных курсах по биохимии и молекулярной биологии, для написания учебных и методических пособий, а также монографической литературы
Апробация работы Результаты исследований были представлены на III съезде Биохимического Общества (Военно-медицинская Академия, С -Пб, 2002), 7ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21го века» (Пущино, 2003), 8ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21го века» (Пущино, 2004) По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение), заключения и выводов общим объемом 192 страницы машинописного текста В работу входит 32 рисунка и 13 таблиц Список литературы содержит 54 отечественных и 364 англоязычных источника
Похожие диссертации на Биохимические аспекты индукции дифференцировки и апоптоза клеток линии К562
