Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из центральных проблем биологии и медицины является изучение регуляции важнейших клеточных функций, таких как пролиферация, дифференцировка, апоптоз, при нормально протекающих физиологических процессах, а также при возникновении патологических состояний, в частности, злокачественных опухолей. В настоящее время получено и охарактеризовано большое количество опухолевых линий различного гистогенетического происхождения, культивируемых in vitro. Клетки таких иммортализованных линий являются прекрасной экспериментальной моделью для всестороннего изучения биологического действия реагентов с антиопухолевой активностью. Благодаря такому подходу, в последние годы достигнуты определенные успехи в изучении патогенеза и лечении многих опухолевых заболеваний.
Известно, что цитостатики, используемые в химиотерапии, способны индуцировать дифференцировку опухолевых клеток, в ряде случаев сопровождающуюся запуском апоптоза (Волкова и др., 2003; Robertson et al., 1997; Terui et al., 1998). В свою очередь, апоптоз наряду с делением клеток определяет функционирование тканей организма в условиях развития, роста, дифференцировки и при индукции патологических процессов. Последние годы ознаменовались всесторонним изучением апоптоза, однако, несмотря на многочисленные исследования, вопрос о регуляции механизмов процесса остается открытым. Во многих экспериментальных системах индукция апоптоза опухолевых клеток сопряжена с рядом трудностей, поскольку возникающие генетические изменения приводят к нарушению дифференцировки, пониженному восприятию со стороны апоптоз-индуцирующих сигналов, как правило, прогрессирующие во времени, развитию множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Корреляция между нарушением дифференцировки и экспрессией генов, активируемых при развитии МЛУ, установлена во многих работах (Marks et al., 1995; Prados et al., 1998; Ueno et al., 1998). В связи с этим, представляется весьма актуальным поиск соединений, способных усилить дифференцировку резистентных опухолевых клеток, что будет играть существенную роль в развитии новых подходов к преодолению фенотипа МЛУ. Итогом такой дифференцировки могут стать замедление пролиферации, индукция апоптоза, а также модулирование чувствительности опухолевых клеток к цитотоксическому лизису естественными клетками-киллерами (ЕКК) и Т-лимфоцитами. Механизм лизиса клеток-мишеней клетками-эффекторами тесно связан с особенностями их мембранного фенотипа и с наличием ядерных и цитоплазматических белковых факторов, контролирующих индукцию и протекание как дифференцировки, так и апоптоза. Поэтому изучение механизмов указанных клеточных функций, а также поиск и направленный синтез химических соединений, регулирующих эти процессы, представляют несомненный интерес не только в изучении специфики развития и функционирования опухолевой клетки, но и для ведения эффективной терапии онкологических заболеваний.
Таким образом, обозначенная проблема заключается в том, что обработка клеток (in vivo или in vitro) антиопухолевыми агентами или иными химическими соединениями может сопровождаться запуском процессов дифференцировки и/или апоптоза, что оказывает непосредственное влияние на чувствительность опухолевых клеток к лизису ЕКК. Биохимические механизмы такого влияния в зависимости от используемого реагента могут пересекаться на уровне сигнальных молекул клетки.
Цель настоящего исследования заключалась в сравнительном изучении нескольких групп структурно-различных химических реагентов индуцировать дифференцировку и/или апоптоз опухолевых (лейкозных) клеток, а также модулировать их чувствительность к лизису ЕКК.
В качестве специфических групп химических реагентов были использованы: нуклеозиды (тимидин, цитидин, гуанозин), соли жирных кислот с укороченной углеводородной цепью (бутират, изобутират, изовалерат натрия), органические растворители (диметилсульфоксид – ДМСО), кортикостероиды и их синтетические производные (гидрокортизон, преднизолон, дексаметазон), константные активаторы протеинкиназы С (форбол-12-миристат-13-ацетат – ФМА), известные и новосинтезированные производные ряда хинолина (хинолин – Q, 2-метилхинолин – 2-MeQ, хинолин-1-оксид – QO, 2-метилхинолин-1-оксид – 2-MeQO, 4-нитрохинолин-1-оксид – 4-NQO, 2-метил-4-нитрохинолин-1-оксид – 2-Me-4-NQO, 2-(4’-диметиламиностирил)хинолин-1-оксид – 2-DQO, 4-(4’-диметиламино-стирил)хинолин-1-оксид – 4-DQO, 2-(4’-нитростирил)хинолин-1-оксид – 2-NSQO, 4-(4’-нитростирил)хинолин-1-оксид – 4-NSQO) и пиридина (4-(4’-диметиламиностирил)пиридин-1-оксид – DPyO), циклофосфан и новосинтезированные производные тиазофосфола.
Задачи исследования:
-
Изучить цитотоксический и антипролиферативный эффекты структурно-различных химических соединений на опухолевые клетки. Определить EC50 изучаемых реагентов;
-
Установить, на основе данных по токсичности, дифференцирующее и апоптогенное действия исследуемых индукторов и их комбинаций на опухолевые клетки. Определить основные маркеры эритроидного и миелоцитарного путей дифференцировки клеток;
-
Изучить влияние химических реагентов на модуляцию активности каспаз в опухолевых клетках как возможных участников расхождения путей передачи сигнала от процессов дифференцировки к апоптозу;
-
Исследовать процессы биотрансформации стирильных производных N-оксидов хинолина и пиридина микросомальными монооксигеназами и пероксидазой. Определить влияние на данные процессы митохондриального цитохрома С;
-
Изучить влияние стирильных производных N-оксидов хинолина и пиридина, а также производных тиазофосфола на процессы окисления и восстановления цитохрома С как одного из основных посредников передачи сигнала апоптоза в клетке. Установить условия возможного выхода цитохрома С из митохондрий в бесклеточной системе;
-
Выявить возможный механизм индукции апоптоза стирильными производными N-оксидов хинолина и пиридина в опухолевых клетках, основываясь на результатах комплексной оценки биологического действия данных гетероциклов;
-
Определить модулирующее действие химических реагентов и их комбинаций на чувствительность опухолевых клеток к цитотоксическому лизису лейкоцитами человека и крыс. Установить их ведущую роль в модулировании процессов дифференцировки и/или апоптоза;
-
Провести сравнительный анализ биологического действия изучаемых соединений на клетки родительской линии К562, а также К562/2-DQO, К562/4-NQO, К562/ts-p53.
Научная новизна. В ходе работы получены новые данные по сравнительному влиянию нескольких групп структурно-различных химических реагентов на пролиферацию, дифференцировку, апоптоз, а также изменение чувствительности опухолевых клеток к литическому действию ЕКК.
Впервые изучено цитотоксическое, антипролиферативное, дифференцирующее и апоптогенное действия производных хинолина, пиридина и тиазофосфола на опухолевые клетки К562. Установлено, что в группе хинолиновых производных имеются соединения, модулирующие только дифференцировку, проявляющие апоптогенное действие или влияющие на оба процесса. Среди реагентов выявлены индукторы эритроидной и миелоцитарной дифференцировки клеток. Соединения взаимодействуют с азотистыми основаниями нуклеиновых кислот, нуклеозидами, нуклеотидами и ДНК. Наиболее сильный апоптогенный эффект проявляют индукторы, способные к наибольшему связыванию с ДНК, при этом их дифференцирующая активность может отсутствовать.
Впервые определен возможный механизм апоптоз-индуцирующего действия стирильных производных N-оксидов хинолина и пиридина на опухолевые клетки. Установлено, что в реализацию программы апоптоза вовлечены цитохром С, каспазы-9, -8 и -3. Клеточная активация гетероциклов может проходить при участии микросомальных монооксигеназ и пероксидазы. В зависимости от преобладания в цитоплазме клеток окисленной или восстановленной форм цитохрома С, процессы биотрансформации ксенобиотиков замедляются или ускоряются, что может вносить существенный вклад в реализацию апоптоза.
Впервые показано, что среди исследуемых индукторов эритроидной дифференцировки клеток К562 только ДМСО способен блокировать апоптоз, индуцированный хинолиновыми ксенобиотиками, через снижение активности каспаз-9 и -8.
Впервые установлено, что каспазы участвуют не только в реализации апоптоза, но и дифференцировки опухолевых клеток. Показано, что переключение дифференцировки с одного пути на другой, например, с эритроидного на моноцито-макрофагальный или мегакариоцитарный, влечет за собой переключение работы каспаз и модулирование апоптоза.
Впервые экспериментально определено влияние сочетанного действия индукторов эритроидной и миелоцитарной дифференцировки клеток К562 на их чувствительность к цитотоксическому лизису лейкоцитами периферической крови (ЛПК) человека. Установлено, что дифференцировка и апоптоз клеток-мишеней могут вносить вклад в изменение литической активности ЕКК. Обработка индукторами эритроидной дифференцировки в большинстве случаев приводит к повышению чувствительности опухолевых клеток к лизису, однако влияние индукторов миелоцитарной дифференцировки во многом определяется последовательностью модулирования указанных клеточных процессов.
При обработке опухолевых клеток комбинацией бутирата натрия, ДМСО и ФМА, впервые показано, что каждый реагент по-разному влияет на изменение цитотоксического индекса (ЦИ) в системе: бутират натрия повышает чувствительность опухолевых клеток к лизису ЛПК, ДМСО блокирует действие бутирата, ФМА способствует поддержанию ЦИ на стабильно высоком уровне.
Впервые экспериментально получены сублинии клеток К562, резистентные к производным ряда хинолина (К562/2-DQO и К562/4-NQO), и охарактеризованы по способности подвергаться индуцированным дифференцировке и/или апоптозу по сравнению с родительской линией. Показано, что в клетках сублиний процессы индукции эритроидной дифференцировки протекают более интенсивно, при этом наблюдается резкое повышение экспрессии гена каспазы-3, но не каспазы-9. Апоптоз в данных условиях не индуцируется.
Впервые изучено влияние комбинаций химических реагентов на модулирование эритроидной дифференцировки и апоптоза клеток К562/ts-р53. Показано, что указанные процессы в сублинии протекают более выражено по сравнению с родительскими К562. Установлено, что каспаза-3 участвует в индукции эритроидной дифференцировки клеток.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Выполненная работа является фундаментальным исследованием, результаты которого представляют интерес как для клеточной биологии, биохимии, так и медицины. Полученные данные о включении исследуемых химических соединений в процессы дифференцировки и апоптоза опухолевых клеток открывают возможности для дальнейшего изучения молекулярных механизмов их модулирующего действия и поиска новых, более перспективных структурных аналогов этих соединений.
Предложены новые подходы для создания модуляторов, способных вызывать дифференцировку и апоптоз опухолевых клеток, усиливать их чувствительность к лизису ЕКК, что может повысить эффективность используемых в настоящее время методов противоопухолевой терапии.
Полученные данные свидетельствуют, что индукторы эритроидной дифференцировки повышают чувствительность опухолевых клеток к лизису ЕКК, тогда как влияние индукторов миелоцитарной дифференцировки и/или апоптоза зависит от процесса, первично модулируемого в клетках. При использовании комбинаций соединений каждое из них по-разному влияет на изменение цитотоксического индекса. Поэтому при выборе схем химиотерапии при лейкозах рекомендуется оценивать in vitro дифференцировочный статус клеток лейкозной популяции, цитотоксический индекс и резистентность опухолевых клеток к химиопрепаратам у каждого отдельного больного.
Кроме того, показано, что индукторы эритроидной дифференцировки модулируют уровень мутантного по Val 135 р53 белка в опухолевых клетках, что приводит к резкому повышению их дифференцировки и апоптоза. Поскольку способность цитостатиков регулировать активность белка во многом определяется типом химиотерапии, при выборе схем лечения онкологических заболеваний необходимо учитывать также их свойства.
По полученным данным индукция миелоцитарной дифференцировки опухолевых клеток, сопровождающаяся снижением их чувствительности к лизису ЕКК, протекает при участии каспазы-6. Результаты этих исследований следует учитывать при создании лекарств нового поколения, направленных на подавление экспрессии каспазы-6.
Результаты работы могут быть использованы в лекционных курсах по клеточной и молекулярной биологии, биохимии, для написания учебных и методических пособий, а также монографической литературы.
Положения, выносимые на защиту:
-
Опухолевые (лейкозные) клетки способны подвергаться химически индуцированным дифференцировке и апоптозу in vitro, при этом их пролиферативная активность замедляется или полностью блокируется.
-
Каспазы являются ключевыми ферментами не только процессов апоптоза, но и дифференцировки опухолевых клеток.
-
В группах структурно-родственных химических реагентов выявлены соединения с разнонаправленными дифференцирующими и апоптогенными эффектами на лейкозные клетки. Подобная биологическая активность связана с особенностями их метаболической активации и разными внутриклеточными мишенями действия.
-
Дифференцировка и апоптоз вносят вклад в изменение чувствительности опухолевых клеток к лизису ЕКК, которое может являться следствием индукции только одного, либо двух указанных процессов.
-
Индуцированная в опухолевых клетках устойчивость к химическим соединениям оказывает влияние на протекание процессов дифференцировки и апоптоза. Дифференцировка протекает более интенсивно, при этом клетки остаются апоптоз-резистентными.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на следующих Всероссийских и Международных конференциях, съездах и симпозиумах: Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 1998), Proceeding of the International young research school (Petrozavodsk, 1998), Всероссийских симпозиумах «Структура и функции клеточного ядра» (С.-Петербург, 1999, 2001, 2002), II съезде ВОГиС (С.-Петербург, 2000), Всероссийском симпозиуме «Клеточная биология на пороге XXI века» (C.-Петербург, 2000), VIII Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (С.-Петербург, 2001), International conference «The Chemistry and Biological Activity of Nitrogen-Containing Heterocycles and Alkaloids» (Moskow, 2001), 6-ой Санкт-Петербургской Ассамблее молодых ученых и специалистов (С.-Петербург, 2001), XII Международной конференции молодых ученых «Человек. Природа. Общество. Актуальные проблемы» (С.-Петербург, 2001), Международной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере» (Сургут, 2002), V, VI Международных симпозиумах «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2002, 2007), 6-, 7-, 8-, 12-ой Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология – наука 21го века» (Пущино, 2002, 2003, 2004, 2008), III Съезде Биохимического общества (С.-Петербург, 2002), Всероссийской конференции «Проблемы медицинской энзимологии», «Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия» (Москва, 2002), Научной конференции «Карелия и РФФИ» (Петрозаводск, 2002), V Конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002), I , II Съездах Общества клеточных биологов (С.-Петербург, 2003, 2007), Конгрессе ревматологов России (Саратов, 2003), III Научно-практической конференции с Международным участием «Болезнь Ходжкина» (Петрозаводск, 2004), Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (XI Всероссийской конференции «Человек и его здоровье») (С.-Петербург, 2008), IV Съезде российских биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008). Результаты работы обсуждены на кафедре молекулярной биологии, биологической и органической химии Петрозаводского государственного университета 1 октября 2008 г. и апробированы на объединенном семинаре в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 15 декабря 2008 г.
Публикации. По теме диссертации опубликованы 16 статей, 34 тезиса докладов и 1 монография.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 разделов, включающих 5 глав обзора литературы, описание материалов и методов исследований, 3 главы результатов собственных исследований и обсуждение результатов, общего заключения, выводов, списка цитированной литературы, приложения. Представлен список публикаций автора по теме диссертации. Общий объем работы составляет 505 страниц, включая 46 таблиц и 79 рисунков. Список цитированной литературы содержит 840 источников.
