Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 10
1.1. Структура эпидермиса 10
1.1.1. Эпидермалъная пролиферативная единица 10
1.1.2. Базальная мембрана 13
1.1.3. Цитокератины 14
1.2. Клеточные контакты кератиноцитов 16
1.2.1. Плотные контакты 16
1.2.2. Заякоривающие контакты 17
1.2.3. Коммуникационные контакты 19
1.3. Волосяной фолликул как производное кожи 20
1.4. Стволовая эпидермальная клетка 21
1.4.1. Ниша стволовых клеток. 21
1.4.2. Характеристика стволовых клеток 24
1.4.3. Кератин 19-положительные клетки 29
1.5. Мезенхимные клетки волосяного фолликула 30
1.6. Особенности культивирования клеток эпидермиса 36
1.6.1. Формирование культуры кератиноцитов 36
1.6.2. Адгезия кератиноцитов к субстрату 38
1.6.3. Действие различных субстратов и их использование при культивировании кератиноцитов 39
1.6.4. Трансплантация выращенных в культуре эпидермальных пластов. 40
1.6.5. Влияние факторов роста. 41
1.6.6. Сохранение стволовых клеток в культуре 42
1.6.7. Использование трехмерных гелей в культивировании эпителиальных клеток 43
1.7. Взаимодействие кератиноцитов и фибробластов 45
1.8. Морфогенез эпителия 47
1.8.1. Тубулогенез как пример морфогенеза 47
1.8.2. Механизм формирования тубулярных структур 48
1.8.3. Влияние различных факторов на морфогенез 52
1.8.4. Модель для изучения морфогенеза эпителиальных клеток 54
II. Материалы и методы 56
11.1. Материалы 56
Ц.1.1. Клеточные культуры 56
П.1.2. Химические реактивы 56
II.2. МЕТОДЫ 59
II.2.1. Выделение первичных кератиноцитов человека 59
П.2.2. Культивирование кератиноцитов на пластике... 59
П.2,3. Получение базальних кератиноцитов 60
П.2.4. Выделение клеток интерфолликулярного эпидермиса 60
П.2.5. Выделение и культивирование постнатальных фибробластов человека 61
11.2.6. Выделение и культивирование эмбриональных фибробластов человека 61
11.2.7. Выделение клеток дермальной папиллы человека 62
П.2.8. Выделение клеток ДП вибрисс крысы 62
11.2.9. Новый метод выделение клеток ДП 62
11.2.10. Получение сред, кондиционированных фибробластами 63
11.2.11. Гистохимическое окрашивание 64
П.2.12. Индукция и детекция остео- и адипогенной дифференцировок 64
П.2.13. Выделение коллагена из хвостов крыс 65
11.2.14. Обработка стекол субстратами... 66
П.2.15. Обработка клеток митомицином С. 66
11.2.16. Приготовление коллагенового геля 66
11.2.17. Иммуногистохимическое исследование 67
П.2.18. Культивирование кератиноцитов на поверхности коллагенового геля 68
11.2.19. Культивирование кератиноцитов в коллагеновом геле 68
П.2.20. Электронная микроскопия 70
11.2.21. Мечение клеток лентивирусом 70
11.2.22. Трансплантация клеток иммунодефицитным мышам... 71
П.2.23. Выявление BrdU-меченных клеток. 71
11.2.24. Выявление активности щелочной фосфатази. 72
П.2.25. Изучение влияния различных факторов на поведение базальних
кератиноцитов 72
11.2.26. Статистическая обработка результатов 72
Ш. Результаты исследований 74
III. 1. Стволовые клетки 75
П1.1.1. Экспрессия кератина 19 75
111.1.2. Влияние кальция на экспрессию кератина 19 78
111.1.3. Пролиферация К19+-клеток 79
П1.1.4. Экспрессия кератина 19 в базальних кератиноцитах. 81
111.1.5. Ингибирование пролиферации кератиноцитов митомицином С. 82
111.1.6. Культивирование клеток интерфолликулярного эпидермиса 83
Ш.2. Культивирование и характеристика клеток ДП 85
П1.2.1. Разработка метода выделения клеток ДП 85
111.2.2. Культивирование клеток ДП. 87
Ш.2.3. Идентификация клеток ДП, 89
П1.2.4. Активность щелочной фосфатазы в клетках ДП 91
ІП.2.5. Остео- и адипогенная дифференцировки клеток ДП. 91
111.2.6. Изучение индуктивных свойств клеток ДП 95
Ш.2.7. Индуктивные свойства иммортализованных клеток ДП 98
1П.2.8. HGF/SF- индуктор морфогенеза 99
Ш.З. Структура эпидермальных выростов 102
Ш.3.1. Гистология тубулярных структур 102
Ш.3.2. Электронная микроскопия 102
Ш.3.3. Флуоресцентная микроскопия 105
Ш.4. Способность кератиноцитов к самоорганизации 107
Ш.5. Изучение способности клеток встраиваться в трехмерные 109
структуры кожи in vivo 109
III.S.1. Трансдукция клеток лентивирусными частицами in vitro. 110
ІП.5.2. Трансплантация клеток в систему in vivo 112
IV. Обсуждение результатов 114
V. Заключение , 139
Выводы 142
Список литературы
- Эпидермалъная пролиферативная единица
- Стволовая эпидермальная клетка
- Культивирование кератиноцитов на пластике...
- Способность кератиноцитов к самоорганизации
Введение к работе
Кожа представляет собой сложно организованную структуру, сформированную из клеток эпителиальной и соединительной ткани. Эпидермис - наружный эпителиальный слой кожи - состоит из клеток (кератиноцитов) различной степени дифференцировки. Кератиноциты базального слоя, примыкающие к дерме, за счет деления и последующей миграции в вышележащие слои, обеспечивают регенерацию эпителиальной ткани. Такая высокая регенеративная способность эпидермальной ткани обеспечивается благодаря делению стволовых клеток. Клетки в эпидермисе расположены упорядочено. Полагают, что эпидермис состоит из структурно-функциональных единиц, которые представляют собой колонки клеток, в основании которых располагается стволовая клетка, и вся колонка считается нишей для этой стволовой клетки.
Несмотря на большое число исследований в области биологии эпидермальных стволовых клеток, строгих маркеров для их выявления до сих пор не обнаружено. Исследования экспрессии предложенных молекулярных маркеров показывают спорные результаты. В частности, многое остается неясным и в отношении экспрессии предполагаемого маркера эпидермальных стволовых клеток - кератина 19. Изучение стволовых клеток интересно не только с фундаментальной, но и с прикладной точки зрения, так как понимание проблемы сохранения и идентификации стволовых клеток в культуре кератиноцитов и их участия в регенераторных процессах позволяет совершенствовать живой эквивалент кожи, применяемый для восстановления кожного покрова в клинической практике.
Клетки эпидермиса под воздействием индукционных сигналов со стороны дермы формируют такие структуры как волосяные фолликулы, сальные и потовые железы.
Волосяной фолликул является резервуаром стволовых клеток эпидермиса, которые способны давать начало всем типам эпителиальных клеток волосяного фолликула в процессе его регенерации в цикле роста волоса, а также клеткам интерфолликулярного эпидермиса и клеткам сальной железы. Волосяной фолликул является уникальной структурой и играет важнейшую роль в процессе роста волос и поддержании гомеостаза эпидермиса. Фолликул подвержен циклическим изменениям, в ходе которых способен полностью регенерировать.
Основы такой регенерации лежат в особенностях эпителиального и мезенхимного компонентов фолликула. В цикле роста волоса реорганизация волосяного фолликула происходит в результате серии индукционных взаимодействий между клетками мезенхимы и эпителия. Популяцией мезенхимных клеток, обладающих индукционной способностью, являются клетки дермальной папиллы (ДП), которые и инициируют рост волоса. Исследования свойств клеток ДП in vivo показывают, что при помещении их под кожу бестимусных мышей происходит индукция формирования волосяных фолликулов. In vitro индукционные свойства клеток ДП не изучены. Однако известно, что кератиноциты при помещении в коллагеновый матрикс в присутствии эмбриональных фибробластов способны его инвазировать и формировать структуры, сходные с придатками кожи. Использование в исследованиях in vitro популяции клеток ДП позволит создать условия, более приближенные к ситуации in vivo, в то время как эмбриональные фибробласты могут давать ошибочные представление о процессах морфогенеза. Данное научное направление является весьма перспективным. С использованием описанных клеточных систем возможно изучение фундаментальных морфогенетических процессов, протекающих в эпидермисе человека на разных этапах онтогенеза. Эти клеточные системы представляют большой интерес для изучения процессов дифференциации клеток, эпителио - мезенхимных взаимодействий, поведения стволовых клеток, процессов апоптоза и др. Раскрытие механизмов межклеточного контактирования при формировании волосяного фолликула позволит создавать подходы тканевой инженерии для восстановления функции волос у людей с заболеваниями волосяного фолликула или потерей его функции. С другой стороны, модификация живых тканевых эквивалентов с использованием клеток ДП может разрешить проблему восстановления роста волос в местах трансплантаций. Кроме того, модель морфогенеза волосяного фолликула может служить тест-системой для изучения фармакологического действия лекарственных препаратов.
Цель нашего исследования:
Целью нашего исследования явилось изучение морфо-функционального состояния клеток волосяного фолликула при разных условиях их культивирования. Задачи исследования:
1. Охарактеризовать кератин 19-положительные клетки эпидермиса человека в культуре.
2. Выделить и охарактеризовать клетки ДП.
3. Разработать модель формирования волосяного фолликула в культуре.
4. Изучить клеточные механизмы формирования тубулярных структур в культуре эпидермальных кератиноцитов человека.
5. Изучить способность клеток встраиваться в трехмерные структуры кожи in vivo.
6. Исследовать способность кератиноцитов к самоорганизации.
Эпидермалъная пролиферативная единица
Для описания пространственной и функциональной связи клеток в эпидермисе Поттен ввел представление об эпидермальной пролиферативной единице (ЭПЕ) (Potten, 1974), а Слэк предложил понятие структурно-пролиферативной единицы (Slack, 2000). Удачным является термин структурно-функциональная единица (СФЕ), введенный Г.К.Хрущовым и В.Я.Бродским в 1961 г. для обозначения повторяющихся единиц, формирующих органы (Терских и др., 2003). Пролиферативная единица - клеточная структура, образованная кератиноцитами различных слоев эпидермиса, разной степени дифференцировки и происходящая, вероятно, из одной стволовой клетки, расположенной в базальном слое и эпидермальная пролифератианая единица контактирующей с базальной мембраной. По мере дифференцировки клетки смещаются к поверхности эпидермиса, образуя в совокупности пролиферативную единицу эпидермиса, которая в виде колонки занимает определенную его область (рис. 1).
Поттен полагает, что дорсальный эпидермис мыши организован в виде серий пролиферативных единиц. Каждая такая единица состоит из группы клеток, содержащих пролиферирующие и дифференцирурующиеся клетки. Пролиферирующие (транзиторные) клетки находятся в базальном слое, тогда как дифференцирующиеся клетки расположены в виде колонки (шириной в одну клетку) над пролиферирующими клетками. Число базальных клеток в ЭПЕ в среднем составляет 10-11, но может быть и значительно меньше или существенно больше. Только 6-7 этих клеток способны к пролиферации. Из оставшихся клеток одна является клеткой Лангерганса, а 2-3, по-видимому, являются постмитотическими клетками и ожидают сигнала для миграции в вышележащие слои эпидермиса. Принципиально важным в гипотезе Поттена является представление о том, что в центре ЭПЕ в базальном слое находится стволовая клетка (Potten, 1974). Согласно Поттену все клетки ЭПЕ берут начало от стволовой клетки, однако иммунологическое изучение химерного эпидермиса мыши дает основание считать, что некоторые клетки ЭПЕ могут быть потомками клеток, мигрировавших сюда из соседних ЭПЕ (Schimdt et al., 1987).
Камеда и соавторы предложили новую модель, по которой одна стволовая клетка снабжает 6 пролиферативных единиц (Kameda et al., 2002). В эпидермисе человека строение ЭГТЕ изучено слабо. В коже человека не удается морфологически различить ЭПЕ, подобные тем, что найдены в коже мыши, так как в морфологии эпидермиса человека и мыши существуют значительные различия. Эпидермис кожи спины у мышей относительно плоский и имеет только 2 слоя клеток, в то время как эпидермис человека состоит из множества слоев (до 10), и, хотя его поверхность плоская, базальный слой имеет неровную, бугристую структуру. Участки эпидермиса, уходящие в дерму, называют гребнями, тогда как участки дермы, вдающиеся в слой эпидермиса, -дермальными сосочками (Janes et al., 2002).
В эпидермисе мыши роговые чешуйки и клетки, лежащие под ними, вплоть до базальных клеток, представляют собой упорядоченные столбики. В центре основания каждой ЭПЕ (в базальном слое) располагается стволовая клетка. В эпидермисе человека роговой слой располагается относительно независимо от базального слоя (Mackenzie & Zimmerman, 1981). Такие различия в морфологии эпидермиса привели некоторых авторов к сомнению, организуются ли пролиферативные единицы эпидермиса человека также как и в дорсальном эпидермисе мыши. Предполагают, что стволовые клетки в коже человека размещаются в основаниях эпидермальных гребней и расположение стволовых клеток больше связано со структурой гребней, чем с организацией роговых чешуек на поверхности эпидермиса (Morris & Potten, 1988). После ранения структура эпидермиса радикально меняется. Клетки начинают пролиферировать, приобретают подвижность и эпителизируют рану. При этом типичные ЭПЕ в ране не обнаруживаются. Однако в дальнейшем происходит полное восстановление структуры эпидермиса. Колодка и соавторы (Kolodka et al., 1998) метили выращенные эпидермальные кератиноциты человека генетически путем трансдукции ретровирусом MFGlacZ и затем сформированные эпителиальные пласты трансплантировали мышам Swiss пи/пи. В течение первой недели после трансплантации меченые клетки (экспрессирующие р галактозидазу) были разбросаны по всему восстановленному эпидермису, через 10-20 нед они были собраны в кластеры, а через 40 нед сформированные ЭПЕ имели вид вертикальных клеточных колонок. Эти данные показывают, что организация эпидермиса в виде ЭПЕ восстанавливается после его ранения. В культуре организация эпителиальных пластов имеет сходство с организацией эпидермиса in vivo. ЭПЕ в культуре эпидермальных кератиноцитов формируется путем самоорганизации образующихся в процессе деления клеток (Watt & Jones, 1993). Однако клеточные механизмы самоорганизации изучены слабо.
Стволовая эпидермальная клетка
При культивировании стволовые клетки выходят из своей ниши и активируются, увеличивается их размер, усиливается пролиферация и миграция клеток (Miller, et al., 1993; Yang et al., 1993). Таким образом, экспрессия белков в стволовых эпидермальных клетках может быть различна in vivo и in vitro. В связи с этим идентификация стволовых клеток в коже затруднена. Возможно поэтому до сих пор не найдены маркеры стволовых эпидермальных клеток. Распределение стволовых клеток в коже человека определить сложно, так как введение радиоактивной метки в ткани человека не представляется возможным. Однако такие эксперименты были проведены на лишенной волос коже обезьян (на ладонях). Разведение метки реже всего происходило в основаниях эпидермальных гребней, чем в других областях базального слоя. Эти покоящиеся клетки были интерпретированы как стволовые, хотя и не было показано, что они сохраняют способность пролиферировать. Таким образом, было предположено, что стволовые клетки размещаются в эпидермальных гребнях (Morris & Potten, 1988)} Это было четко продемонстрировано для кожи ладони и ступни человека (Lavker & Sun, 1982). Однако последние исследования эпидермиса крайней плоти человека показали, что клоногенные клетки могут располагаться независимо от расположения гребней (Ghazizadeh & Taichman, 2005). В оволосненных участках тела человека, стволовые клетки обнаруживают в волосяном фолликуле. Долгое время стволовыми клетками волосяного фолликула считали клетки матрикса, располагающиеся в нижней части волосяной луковицы, (Reynolds & Jahoda, 1991; Hardy, 1992). Однако через некоторое время появились убедительные доказательства того, что стволовые клетки располагаются в верхней части волосяного фолликула, на уровне места прикрепления мышцы, поднимающей волос, в области, называемой bulge. Было показано, что после удаления нижней трети фолликула вибриссы крысы, матрикс формируется из верхней части фолликула (Oliver, 1966). С помощью радиоактивного мечения мышиного эпидермиса 3Н-тимидином, Моррис и Поттен обнаружили в области bulge популяцию клеток, длительно сохраняющих метку (через 14 месяцев после прекращения мечения). При этом меченые клетки не были найдены ни в интерфолликулярном эпидермисе, ни в сальной железе (Morris & Potten, 1999). Эксперименты, проведенные на мышах с использованием 3Н-тимидина и BrdU, также показали, что в области bulge располагаются клетки, длительно сохраняющие метку (Cotsarelis et al., 1990; Taylor et al., 2000). Клетки, расположенные в bulge, пролиферируют реже по сравнению с клетками матрикса (Lavker et al., 1991). Более того, bulge содержит 95% всех клоногенных клеток фолликула вибриссы крыс, остальные 5% располагаются в волосяной луковице (Kobayashi et al., 1993).
Роша и соавторы (Rochat et al., 1994) изучили клоногенную способность кератиноцитов, выделенных из волосяных фолликулов скальпа. Большинство клеток, формирующих колонии, располагались в верхней части волосяного фолликула. В работе Ошимы и соавторов (Oshima et al., 2001) было показано, что понятия клоногенной и стволовой клеток очень схожи, и что в bulge располагаются мультипотентные стволовые клетки и/или прогениторные клетки.
Тэйлор и соавторы (Taylor et al., 2000) показали, что клетки, располагающиеся в области bulge, являются предшественниками клеток нижней части фолликула, включая наружное корневое влагалище, матрикс волоса и внутреннюю часть корня волоса (мозговое вещество), и потомки клеток bulge могут мигрировать в интерфолликулярный эпидермис мыши в ответ на повреждение.
В другом эксперименте (Oshima et al., 2001) использовали трансгенных мышей линии Rosa 26, несущих репортерный ген Lac Z. Фрагменты области bulge этих мышей были трансплантированы на спину эмбрионов мышей дикого типа. Затем имплантаты окрашивали на Р-галактозидазу и типичное голубое окрашивание наблюдали у фолликулов и эпидермиса мышей дикого типа, что предполагает, что донорские клетки из области bulge могут воссоздавать цельте фолликулы, включая наружное и внутреннее корневые влагалища и собственно волос, и что клетки bulge могут служить источником всех клеточных элементов эпидермиса и сальной железы. Предполагается, что стволовые клетки этого отдела мигрируют по двум направлениям: в волосяной фолликул и в базальный слой интерфолликулярного эпидермиса, где образуют популяцию прогениторных клеток (Oshima et al., 2001). Однако последние данные указывают на то, что стволовые клетки волосяного фолликула из bulge не участвуют в формировании эпидермиса в норме (Clayton et al., 2007; Ito et al., 2005), и только при повреждении способны мигрировать в эпидермис для его восстановления (Ito et al., 2005).
Гипотеза о существовании двух различных популяций клеток (стволовых и транзиторных клеток, претерпевающих ограниченное число делений), поддерживающих гомеостаз взрослой кожи, в настоящее время подвержена сомнениям. В работе Клэйтон (Clayton et al., 2007) на примере эпидермиса хвоста мыши приводятся доказательства того, что эпидермис поддерживается одной единственной популяцией клеток - предшественников, которые могут претерпевать неограниченное количество делений, обеспечивая гомеостаз эпидермиса. Авторы отмечают, что все исследованные процессы происходят в норме во взрослой коже, и было бы интересно проследить за той же группой клеток в процессе заживления раны.
Культивирование кератиноцитов на пластике...
Суспензию кератиноцитов высевали в концентрации 300 тыс. клеток/мл на пластик в смеси сред DMEM:F12 (1:1) с добавлением 10% сыворотки плода коровы (Биолот), 4мМ L-глутамина (Sigma), 5мкг/мл инсулина (Sigma), 10"бМ изопротеренола (Sigma) и Юнг/мл EGF (Sigma), и культивировали при 37С и 5% С02 и насыщающей влажности (в С02-инкубаторе).
Смену среды проводили через каждые 3-4 дня, культуры пассировали при достижении конфлуентного слоя.
В эксперименте по исследованию влияния низкокальциевой среды (0,03 тМ) на количество К19+-клеток, культивирование проводили в среде Keratinocyte-SFM (Gibco) с добавлением L-глутамина (Биолот), инсулина (Sigma), изопротеренола (Sigma), EGF (Sigma) и FGF (Sigma).
Для получения фракции базальных кератиноцитов конфлуентную культуру первичных кератиноцитов инкубировали в среде DMEM без содержания кальция (ПанЭко) и без митогенов в течение 48 ч, с последующей заменой на полную среду.
Для выделения клеток интерфолликулярного эпидермиса использовали эпидермис, полученный в ходе ферментативной обработки кожи. Под контролем бинокуляра с помощью микрохирургических ножниц волосяные фолликулы отделяли от эпидермиса. Эпидермис инкубировали в смеси PBS + 0,25% трипсин (1:1) при 36С в течение 7-Ю мин. Действие трипсина ингибировали добавлением 5% сыворотки крупного рогатого скота и пипетированием получали суспензию кератиноцитов, которую осаждали центрифугированием при 1000 об/мин (200g) в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в среде DMEM:F12 (1:1) с добавлением 10% сыворотки плода коровы (Биолот), 4мМ L глутамина (Sigma), 5мкг/мл инсулина (Sigma), 10"6 М изопротеренола (Sigma) и Юнг/мл EGF (Sigma). Высевали суспензию кератиноцитов в пластиковые культуральные флаконы.
Постнатальные фибробласты человека получали из полосок дермы кожи человека, остававшихся после отделения эпидермиса в ходе выделения первичных кератиноцитов. Полоски дермы отмывали в PBS от раствора диспазы и измельчали до однородной массы с помощью глазных ножниц. Дезагрегацию клеток проводили в 0,25%-растворе трипсина (Биолот) при 37С в течение 30-60 мин. После завершения трипсинизации фермент инактивировали добавлением 5% сыворотки плода коровы. Полученную суспензию пипетировали и центрифугировали при 1000 об/мин (200g) в течение 10 мин. Полученный осадок ресуспендировали в среде DMEM (Биолот) с добавлением 10% сыворотки плода коровы и 4мМ L-глутамина, и в малом объеме среды кусочки дермы помещали в пластиковые флаконы. Через 7-10 дней фибробласты мигрировали из кусочков дермы на пластик. Смену среды проводили через каждые 3-4 дня, культуры пассировали при достижении конфлуентного слоя.
Эмбриональные фибробласты человека (ФЭЧ) выделяли из абортивного материала 3 -5 нед. гестации. Фибробласты культивировали в среде DMEM с содержанием 10% сыворотки плода коровы и 4мМ L-глутамина (Sigma) в СОг инкубаторе при 37С. Смену среды проводили через каждые 3-4 дня. культуры пассировали при достижении конфлуентного слоя.
Фрагменты кожи лица, полученные в ходе хирургических операций, промывали в растворе Хэнкса с содержащем 80 мкг/мл гентамицина. С помощью скальпеля отделяли дерму с подкожной жировой клетчаткой и помещали в 0,5%-ный раствор диспазы (Sigma) в среде DMEM на 14-16 ч при +4С. Пинцетом извлекали волосы вместе с волосяными фолликулами. Выделенные фолликулы инкубировали в 0,1%-ном растворе коллагеназы I типа в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки плода коровы, в течение 7 ч при 37С. С помощью бинокуляра отбирали ДП и промывали в растворе Хэнкса. ДП ресуспендировали в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки плода коровы (Биолот), 4тМЬ-глутамина (Sigma), и культивировали при 37С в СОг-инкубаторе.
Клетки ДП вибрисс крыс выделяли с помощью микрохирургических манипуляций под контролем бинокуляра. Используя микропинцеты, отделяли соединительнотканную оболочку вибрыссы крысы от эпителиальной части, разрезали микрохирургическими ножницами и отделяли папиллу. Папиллы помещали в 35 мм чашки Петри и культивировали в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки плода коровы.
Способность кератиноцитов к самоорганизации
Выявление стволовых эпидермальных клеток осложнено отсутствием специфических иммуногистохимических маркеров. В настоящее время наиболее достоверным способом обнаружения стволовых клеток является изучение способности клеток длительно сохранять метку. Кератин 19 может служить альтернативой для выявления стволовых клеток волосяного фолликула (Stasiak et al., 1989; Savtchenko et al., 1988; Bartek et al., 1985), потому и был использован в нашем исследовании. Данные литературы по выявлению экспрессии кератина 19 в волосяном фолликуле противоречивы. В некоторых исследованиях экспрессия кератина 19 была обнаружена только в области bulge (Narisawa et al., 1994; Michel et al., 1996; Stasiak et al., 1989). Другие исследования обнаруживают две области экспрессии кератина 19: в верхней и нижней трети волосяного фолликула. В нашей работе мы обнаружили экспрессию кератина 19 в двух областях волосяного фолликула на стадии анаген: в области bulge и в матриксе волосяного фолликула. Мы придерживаемся гипотезы активации bulge (Cotsarelis et al., 1990; Lavker et al., 1991) и полагаем, что в раннем анагене стволовые клетки из области bulge (К19+-клетки) мигрируют в матрикс волоса, где пролиферируют и дают начало транзиторным клеткам, которые формируют волосяной фолликул. При этом К19 клетки матрикса, являющиеся потомками стволовых из области bulge, уже вступают на путь дифференцировки, а тот факт, что они продолжают экспрессироват.ь кератин 19 может свидетельствовать об их способности к пролиферирации. Остается неясным вопрос, на каком этапе происходит переход стволовых клеток в компартмент транзиторных. Исследование поперечного среза области bulge показало, что К19+-клетки располагаются в базальном слое наружного корневого влагалища, что соответствует данным и других исследований (Narisawa et al., 1994; Michel et al., 1996). В коже, лишенной волос, К19+-клетки располагаются в базальном слое на вершине эпидермальных гребней (Michel et al., 1996), в области, характерной для расположения стволовых клеток (Lavker & Sun, 1982, 1983).
В нашей работе были проведены эксперименты по изучению поведения К19+-клетки в культуре. Для достижения этой цели мы культивировали клетки эпидермиса человека, выделенные из кожи лица доноров в возрасте 50-60 лет. Поскольку в нашем исследовании мы использовали оволосненные участки кожи, источником К19+-клетки в первичной культуре являлись волосяные фолликулы.
Среда для культивирования эпидермальных кератиноцитов содержит EGF, необходимый для поддержания пролиферации клеток в культуре. Культивирование в среде без добавления EGF приводило к увеличению доли К19+-клеток большего диаметра по сравнению с контрольной средой. Этот эффект можно объяснить тем, что EGF препятствует дифференциации и стратификации кератиноцитов (Grief et al., 1988), а по мере дифференциации размер кератиноцитов увеличивается. В то же время EGF не оказывал похожего эффекта на популяцию К19"-клеток, что объясняется, вероятно, крайней гетерогенностью последней.
При анализе культуры через 24 часа после инициации доля К19+-клеток составила около 1%. Такое количество К19+-клеток соответствует доле выявляемых К19+-КЛЄТ0К in vivo. Пул стволовых клеток истощается с возрастом организма, что происходит наряду с уменьшением К19+-клеток (Michel et al 1996). Так, доля К19+-клеток у новорожденных составляет 7,5% (2-7 дней), у детей (от 2 до 10 лет) - 1,5% и у взрослых (17-64 года) менее 1% от общего количества эпидермальных клеток (Michel et al 1996). Через 24 часа культивирования мы проанализировали размер клеток, поскольку известно, что диаметр 116 отражает клоногенный потенциал кератиноцитов. К19 -клетки характеризовались малым размером и высоким ядерно-цитогатазматическим соотношением, что является характерной чертой стволовых клеток (Kameda et al., 2002). К19+-клетки малого диаметра располагались поодиночке, диаметр К19-клеток на начальных стадиях культивирования, как правило, был больше. Это наблюдение может быть очень значимым, поскольку известно, что клоногенный потенциал кератиноцитов с диаметром менее 11 мкм (вероятно стволовые клетки) значительно выше такового клеток с большим диаметром (Barrandon & Green, 1985). Исходя из способности формировать клоны, культура кератиноцитов может быть разделена на три типа: голоклоны, мероклоны и параклоны (Barrandon & Green, 1987а). Голоклоны включают клетки с самым высоким пролиферативным потенциалом ( преимущественно стволовые). Интересно, что доля К19+-клеток, полученная нами в первичной культуре, сравнима с долей голоклонов, обнаруживаемых в такой культуре Так. например, кожа молочной железы человека содержит 3,1% голоклонов (Barrandon & Green, 1987а), а популяция первичных кератиноцитов кожи лица человека в наших исследованиях содержала около 1% К19+-клеток. Доля К19+-клеток нашего исследования соответствует данным других авторов. Так, например, было показано, что кожа молочной железы содержит 1,2% К19+-клеток (Michel et al., 1996). В этом же исследовании было показано, что содержание К19+-клеток крайней плоти новорожденных составляло 24,8% (Michel et al., 1996), что совпадает с долей голоклонов в этом типе ткани (28%) (Barrandon & Green, 1987а). Таким образом, низкое количество К19+-клеток соответствует малому количеству голоклонов, а уменьшение голоклонов в культуре происходит по мере увеличения возраста доноров (Michel et al., 1996). Некоторые авторы полагают, что К19+-клетки генерируют голоклоны (Michel et al., 1996). Таким образом, через 24 часа культивирования в первичной культуре К19+-кератиноциты могут представлять собой стволовые/прогениторные эпителиальные клетки.
