Содержание к диссертации
Введение 5
Глава I. Обзор литературы
1.1. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки:
получение и свойства 10
1.1.1. Регуляция дифференциации 19
Источники мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток 23
Миогенная дифференцировка ММСК in vitro 28
Изучение миогенеза in vivo 32
1.4.1. Как стволовые клетки становятся кардиомиоцитами. Слияние
или дифференцировка 36
Кардиомиогенные сигналы дифференциации 39
Временной промежуток для оптимальной дифференциации... 41 Глава И. Материалы и методы
II. 1. Выделение мезенхимальных клеток из тимуса, костного мозга,
печени и селезенки 44
II.2. Клонирование 46
И.З. Подсчет колоний 47
И.4. Иммуноцитохимические исследования 47
II.5. Анализ иммунофенотипа полученных культур мультипотентных 48
мезенхимальных стромальных клеток
П.6. Функциональная характеристика выделенных культур 49
Направленная миогенная дифференцировка 5-азацитидином 50
Моделирование инфаркта миокарда 50
Приготовление клеточного трансплантата 52
П. 10. Клеточная трансплантация in vivo 53
II. 11. Приготовление гистологических препаратов 53
II. 12. Статистическая обработка данных 54
Глава III. Результаты и обсуждение
III. 1. Выделение колоний мультипотентных мезенхимальных
стромальных клеток из пренатальных органов гемопоэза и
иммуногенеза 55
III. 1.1 Получение культуры мультипотентных мезенхимальных
стромальных клеток из костного мозга 56
III. 1.2. Выделение культуры мультипотентных мезенхимальных
стромальных клеток из тимуса 59
III. 1.3. Выделение мультипотентных мезенхимальных стромальных
клеток из печени 64
III. 1.4. Выделение культуры мультипотентных мезенхимальных
стромальных клеток из селезенки 66
Ш.2. Характеристика выделенных культур 72
Ш.2.1. Цитофлюориметрический анализ иммунофенотипа
4
клеточных культур 72
Ш.2.2 Исследование дифференцировочного потенциала
(функциональной активности) выделенных культур 81
Ш.З. Исследование миогенеза в культуре мультипотентных
мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, тимуса,
печени и селезенки
Ш.З. 1 Спонтанная миогенная дифференцировка
98
Ш.З.2. Направленная миогенная дифференцировка
III.4. Клеточная трансплантация in vivo
Ш.4.1 Выбор экспериментальной модели
Ш.4.2. Дизайн эксперимента
107
Ш.4.3. Трансплантация клеток
108
III.4.4. Оценка результатов
Заключение
тэ 126
Выводы
128
Список литературы
Список сокращений
ГСК - гемопоэтические стволовые клетки
bFGF - фактор роста фибробластов
КОЕ-Ф - колониеобразующие единицы фибробластов
MAPCs - мультипотентные взрослые прогениторные клетки
ММСК — мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки
МНС I, II - главный комплекс гистосовместимости
МуНС - тяжелая цепь миозина
НСК - нейрональные стволовые клетки
PCNA - ядерный антиген пролиферирующих клеток
Введение к работе
Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания - одна из основных причин смертности в мире. В последнее время возрос интерес к клеточным трансплантациям в кардиологии для репарации поврежденного миокарда. Идут интенсивные дебаты по поводу наиболее подходящего для этой цели типа клеток. Показано, что трансплантированные фетальные кардиомиоциты формировали контакты с кардиомиоцитами реципиента и улучшали сократительную функцию сердца [78,44]. Однако технически сложно получить достаточное количество фетальных кардиомиоцитов для репарации поврежденного миокарда. Применение скелетных миобластов уменьшает выраженность вентрикулярнои дилятации и улучшает сократительную функцию сердца [53,62]. Недостаток этого метода в том, что трансплантированные рабдомиобласты не обладают автоматизмом и не образуют нексусы в миокарде реципиента [67]. Пересадка ядросодержащей фракции костного мозга, так же оказывала положительное влияние на миокард. Но, как выяснилось, этот эффект был связан не с гемопоэтическими, а со стромальными клетками костного мозга [50,51].
Сравнительно с другими типами клеток, рассматриваемыми для кардиомиопластики, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), по-видимому, обладают уникальными свойствами, которые позволяют их использовать для высокоэффективной клеточной терапии.
Способность ММСК к дифференцировке в различные клеточные типы [70,101,102,103], а также возможность выращивания в качестве аутотрансплантата [104], делают клетки этого типа чрезвычайно перспективными для клеточной заместительной терапии.
Дифференцировка трансплантированных клеток в кардиомиобласты может зависеть от типа имплантированных стволовых клеток, а также качественных и количественных отличий в локальных условиях в момент трансплантации [144,149,154]. В настоящее время остается открытым вопрос о преимуществе трансплантации миогенно предифференцированных или недифференцированных клеток. На сегодняшний день безопасность предифференцировки не доказана. Так же еще убедительно не показана способность ММСК дифференцироваться в клетки мышечного типа.
Большинство статей посвящено мультипотентным мезенхимальным
стромальным клеткам взрослого организма [104,106,114,123] и очень мало
известно о пренатальных ММСК. В течение онтогенеза человека
пролиферация и дифференцировка гемопоэтических
стволовых\прогениторных клеток происходит в гистологически различном микроокружении. ММСК тесно связаны с гемопоэтическими клетками во взрослом костном мозге. Печень, селезенка, тимус и костный мозг являются известными сайтами активного гемопоэза на разных стадиях в фетальный период развития. ММСК из этих органов гемопоэза слабо изучены, ММСК из тимуса человека совсем не описаны в литературе.
Отсутствие этих данных позволило нам сформулировать цели и задачи настоящего исследования.
Цель и задачи исследования. Провести сравнительную характеристику мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из пренатальных органов гемопоэза и иммуногенеза, исследовать их миогенныи потенциал ex vivo и in vivo.
В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:
Отработка методики выделения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из пренатальных костного мозга, печени, тимуса и селезенки;
Анализ иммунофенотипа выделенных культур методом проточной цитофлуориметрии;
Оценка мультипотентности полученных культур (хондрогенез, остеогенез, адипогенез) с использованием селективных сред.
Оценка спонтанной миогенной дифференцировки.
Изучение индукции миогенной дифференцировки культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток in vitro.
Исследование поведения и дифференцировки выделенных культур у лабораторных животных с моделированным инфарктом миокарда.
Научная новизна работы. Данная работа является первым экспериментальным исследованием, в котором проведена сравнительная
характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из пренатальных органов гемопоэза и иммуногенеза - тимуса, селезенки, костного мозга и печени. Получены данные о их различии в экспрессии маркеров гистосовместимости I класса (MHC-I) и молекулы адгезии CD-54 (ICAM-I). Впервые выделены и охарактеризованы мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки тимуса человека.
Впервые показана способность к спонтанной дифференцировке
мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга,
тимуса и печени в скелетную и сердечную мышцу. Выявлены отличия в
потентности к миогенной дифференцировке мультипотентных
мезенхимальных стромальных клеток из разных источников.
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки селезенки, в отличие
от ММСК костного мозга, тимуса и печени такой способности не проявляли.
Практическая значимость работы. Впервые разработан протокол
получения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток тимуса.
Показана перспективность применения мультипотентных мезенхимальных
стромальных клеток тимуса в качестве клеточного аллотрансплантата,
благодаря его значительно меньшей, по сравнению с мультипотентными
мезенхимальными стромальными клетками из других источников,
иммуногенности и высокой технологичности получения культуры.
Определены условия отбора клеточных популяций, предпочтительно дифференцирующихся в миобласты. Показано, что клонирование и отбор
мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток позволяет избежать обработки культуры токсичным 5-азацитидином для предифференцировки в кардиомиогенном направлении перед трансплантацией клеток in vivo.
Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на Втором Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), Конференции в РГМУ (Москва, 2003, 2004), VIII Ежегодной сессии НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН (Москва, 2004), I, II международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», (Москва, 2004, 2005), на межлабораторной конференции ГУ НИИ морфологии человека РАМН (Москва, март 2006).
Публикации. По материалам диссертации было опубликовано 9 работ, из них 6 статей в центральной печати.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 147 страницах и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), изложения результатов собственных исследований и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 38 рисунками. Указатель цитируемой литературы включает 157 источников.
