Введение к работе
Актуальность проблемы.
Актуальной проблемой современной клеточной биологии является изучение пластичности клеточного фенотипа и возможностей дифференцировки клеток в пределах одного зародышевого листка. Интерес клеточных биологов к in vitro дифференцировке клеток обусловлен тем, что данный процесс может помочь в решении ряда фундаментальных и прикладных задач, таких как установление гистогенетического родства различных клеточных типов, изучение регуляторных генных путей, in vitro моделирование болезней, тестирование лекарств, получение целевых клеток в достаточном для заместительной клеточной терапии количестве. Понимание молекулярно-генетических механизмов, которые задействованы при дифференцировке в те или иные типы клеток, поможет повысить эффективность дифференцировки и избежать потенциальных негативных эффектов.
С наибольшей эффективностью дифференцировка клеток осуществляется в пределах одного зародышевого листка. Что касается энтодермального зародышевого листка, то на данный момент накопилось много сведений о дифференцировке прогениторных клеток печени и поджелудочной железы как in vitro, так и in vivo (Yi et al., 2012). Однако печень и поджелудочная железа являются малодоступными источниками клеток. В то же время сложность терапии печени и недостаток донорских органов обусловливают поиск новых альтернативных источников клеток. Поднижнечелюстная слюнная железа имеет смешанное эктодермально-энтодермальное происхождение (Okumura et al., 2003; Larsen et al., 2010). Между ацинусом и начальной частью гранулярного протока слюнной железы располагается ниша, содержащая факультативные прогениторные клетки (Van Keymeulen et al., 2011; Okumura et al, 2012), имеющие энтодермальное происхождение (Tsuji, Nagai, 1993). Доступность клеточного материала слюнной железы делает этот источник клеток перспективным для дальнейшего изучения (Шубникова, Погодина, 2000; Baek et al., 2012), поднижнечелюстная слюнная железа может стать удобным источником энтодермальных клеток для заместительной терапии патологий печени. Однако на данный момент отсутствуют подробные сведения об экспрессии ключевых регуляторных генов в клетках слюнной железы и молекулярно-генетических механизмах, ответственных за дифференцировку этих клеток, не разработаны оптимальные дифференцировочные протоколы.
Все изложенное выше определило цель и задачи исследования.
Цель работы: изучить способность протоковых клеток поднижнечелюстной слюнной железы мыши к дифференцировке в гепатоцитарном направлении in vitro для исследования фенотипической пластичности клеток в пределах энтодермального зародышевого листка.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Разработать методы культивирования клеток поднижнечелюстной
слюнной железы и прогениторных клеток печени мыши и провести сравнительную характеристику культуры клеток слюнной железы и прогениторных клеток печени.
-
Провести сравнительный анализ культур клеток слюнной железы и прогениторных клеток печени по экспрессии ключевых для гепатоцитарной дифференцировки регуляторных факторов и маркеров методами ПЦР-РВ и анализом профилей экспрессии генов глубоким секвенированием в масштабах целого транскриптома.
-
Разработать программу дифференцировки культуры клеток слюнной железы мыши в гепатоцитарном направлении. Проанализировать степень гепатоцитарной дифференцировки клеток слюнной железы мыши методами ПЦР-РВ и иммуноцитохимии, а также определить функциональную активность полученных клеток в сравнении с прогениторными клетками печени в 3D условиях культивирования.
-
Изучить влияние деметилирующих агентов на экспрессию ключевых для гепатоцитарной дифференцировки регуляторных генов и маркеров. Проанализировать влияние деметилирующих агентов на гепатоцитарную дифференцировку клеток слюнной железы.
Научная новизна.
Впервые поведен сравнительный анализ экспрессии регуляторных генов и маркеров культуры клеток поднижнечелюстной слюнной железы и печени мыши, детально исследована экспрессия генов, характерных для протоковых клеток слюнной железы, проанализировано около 29000 мРНК транскриптов. Впервые обнаружена экспрессия маркера адгезии эпителиальных клеток ЕрСАМ в клетках слюнной железы.
Показано, что клетки поднижнечелюстной слюнной железы имеют значительное сходство с другими типами энтодермальных клеток, экспрессируют ряд маркеров прогениторных клеток (ЕрСАМ, CD90, CD 133, Sca-1, c-Kit), а также маркеры, характерные для клеток печени ALB, AFP, СК19 и c-Met. Культура клеток поднижнечелюстной слюнной железы экспрессирует мРНК ранних маркеров энтодермы Hnf-За и Sox9.
После дифференцировки клетки слюнной железы, подобно гепатоцитам, приобретают способность к синтезу мочевины. Вальпроевая кислота, являющаяся деметилирующим агентом, способна увеличить специфичность и эффективность гепатоцитарной дифференцировки клеток поднижнечелюстной слюнной железы.
Практическая значимость.
Результаты, полученные в данном исследовании, могут быть использованы для оптимизации протоколов дифференцировки энтодермальных клеток из предшественников, для выяснения гистогенетического родства энтодермальных клеток и для уточнения их происхождения. Полученные результаты делают возможным разработку принципиально новых методов получения энтодермальных клеток для регенеративной медицины.
Апробация диссертации.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на: Конференциях молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2010, 2011); IV Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2011); III Конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» (Москва, 2011).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 2, тезисов докладов и материалов конференций - 3, получены положительные решения о выдаче 2 патентов.
Личное участие автора.
Анализ литературы, планирование работы, сбор материала, отработка методик, постановка и выполнение экспериментов, обработка и интерпретация результатов выполнены непосредственно автором. Автор лично участвовал в апробации результатов исследования, подготовке и написании основных публикаций по выполненной работе.
Структура и объем диссертации.
