Введение к работе
Актуальность проблемы
Исследование и использование в клинической практике стволовых клеток (СК) являются одними из самых актуальных вопросов современной биологии и медицины. Интерес к СК обусловлен, с одной стороны, возможностями изучения на этой модели механизмов, лежащих в основе диф-ференцировки клеток, и участия в этих процессах специфических факторов, определяющих тип дифференцировки in vivo и in vitro. С другой стороны, актуальность данной проблемы связана с возможностью применения СК для генной и клеточной терапии [Dinsmore J., Ratliff J., Jacoby D. et al., 1998; Schuldiner V., Yanuka 0., Iscovitz-Eldor J. et al., 2000]. Наиболее перспективной областью применения СК следует считать, по-видимому, заместительную биотерапию [Uzan G, 2004]. Причем успехи клинического применения СК, а также возможности появления новых направлений в этой области напрямую зависят от результатов фундаментальных исследований, направленных на изучение стволовых клеток.
Существенный интерес для клинического применения представляют стромальные клетки-предшественники костного мозга [Orlic D., Kajstura J., Chimenti S. et al, 2001; Ballas СВ., Zielske S.P., Gerson S.L., 2002]. Стромальные клетки-предшественники костного мозга были открыты А.Я. Фриденштейном [Friedenstein A., Chailakhjan R., Lalykina К., 1970] около 30 лет назад. Оказалось, что при эксплантации диссоциированных костномозговых клеток в ограниченном количестве in vitro в присутствии эмбриональной телячьей сыворотки в культурах развиваются колонии адгезивных фибробластоподобных клеток. Каждая колония является клоном, то есть образуется путем пролиферации одной клетки. Эти клетки были названы колониеобразующими клетками фибробластов — КОК-ф, или стромальными клетками-предшественниками [Friedenstein А., Chailakhjan R., Lalykina К., 1970; 1976]. Далее было выявлено, что популяция стромальных клеток-предшественников неоднородна по своим дифференцировочным потенциям: некоторые из них являются мультипо-тентными предшественниками, тогда как остальные имеют более ограниченный потенциал, будучи коммитированы к определённой дифференци-ровке [Friedenstein А., 1973]. Это позволило сформулировать концепцию, в соответствии с которой популяция стромальных клеток-предшественников включает в себя наиболее «ранних» представителей — мультипотентные мезенхимальные предшественники, или стромальные стволовые клетки [Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А., 1980]. В настоящее время данные клетки называют также мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), и получены моноклональные антитела SH2, SH3 и SH4, комбинация которых позволяет выделить МСК [Pittner et al., 1999].
Мезенхимальные стволовые клетки могут быть широко использованы в репаративной биотерапии в силу своего значительного пролиферативно-го и дифференцировочного потенциала. Численность их увеличивается in vitro в 100000 раз в течение 6-8 недель, при этом они остаются в недифференцированном состоянии [Pituch-Noworolska A., Majka М., Ja-nowska-Wieczorek A. et al., 2003]. Таким образом, МСК, как часть популяции стромальных клеток-предшественников, обладают всеми признаками СК: они способны к интенсивной пролиферации, могут дифференцироваться во многие клеточные типы, трансплантабельны in vivo [Vassilopou-los G, Wang P., Russel D., 2003].
Стромальные клетки-предшественники содержатся не только в костном мозге, но и в других кроветворных и лимфоидных органах — селезёнке, тимусе, лимфатических узлах. Большинство клоногенных клеток, находящихся в данных органах, серозных жидкостях и крови, и в некотором количестве — в костном мозге, относятся к популяции индуцибель-ных остеогенных клеток-предшественников (ИОКП), которые требуют для реализации своих остеогенных потенций присутствия специфических индукторов остеогенеза — переходного эпителия мочевого пузыря или декальцинированного костного матрикса [Friedenstein А., 1973]. Данная категория клеток способна к миграции, а сформированная ими костная ткань не является самоподдерживающейся. Напротив, другая группа стромальных предшественников — детерминированные остеогенные клетки-предшественники (ДОКП), способные спонтанно реализовывать остеогенные свойства, не мигрируют и содержатся, в основном, в костном мозге, представляя собой местную популяцию клеток.
Несмотря на значительный интерес, который в последние годы исследователи проявляют к стромальным клеткам-предшественникам, многие сведения, касающиеся КОК-ф противоречивы, а часть вопросов остаются не изученными. Например, не исследованы возрастные изменения количества и эффективности клонирования стромальных клеток-предшественников. Недостаточно изучены иммунофенотип, морфогисто-химические особенности КОК-ф и их культуральных потомков, характеристика формируемых ими колоний, влияние условий культивирования и ряда ростовых факторов на их дифференцировку и клоногенность. Между тем поскольку трансплантация размноженных в монослоиных структурах стромальных клеток как способ лечения целого ряда заболеваний находит всё большее применение [Чайлахян Р.К. и др., 1998, Herzog E.L. et al, 2003, Lucarelli E. et al., 2003] разработка оптимальных способов их культивирования приобретает особую актуальность.
Ограничены знания о действии введённых in vivo и in vitro бактериальных антигенов и некоторых иммуномодулирующих препаратов на клоногенные и остеогенные свойства КОК-ф. Например, не известно, ка-
кое воздействие на стромальные клетки-предшественники может оказывать человеческий а-фетопротеин, хотя имеются сведения о его стимулирующем влиянии на эмбриональные фибробласты [Черешнев В.А. и др., 2004]. Практически не исследованы индуцибельные остеогенные клетки-предшественники, выявляющиеся в кровеносном русле и серозных полостях, дискутируются вопросы о возможности циркуляции стромальных клеток предшественников и т.д.
Одной из основных функций стромальных клеток является обеспечение специфического микроокружения для пролиферации и дифференци-ровки гемопоэтических и иммунокомпетентных клеток. Они продуцируют целый ряд необходимых для этого ростовых факторов и цитокинов: интерлейкины — 6, 7, 8, 11, 12, 14, колониестимулирующие факторы, LIF, лиганд Flt-3, SCF и ряд других [Haynesworth S., Baber М., Caplan А., 1996; Ballas С, Zeilske S., Gerson S., 2002, Kim B.D.Y., Yoo K.H., Choi K.S. et al., 2005]. В свою очередь иммунокомпетентные клетки также вырабатывают ряд стимулирующих и ингибирующих факторов, которые оказывают воздействие на стромальные клетки-предшественники. Таким образом, возможна обоюдная «корректировка» нарушений как микроокружения, так и гемопоэтических и иммунокомпетентных клеток.
В связи с этим другой важнейшей проблемой является исследование возможностей дифференцировки exvivo иммунокомпетентных клеток (активированных мононуклеарных лейкоцитов, антигенпрезентирующих дендритных клеток, натуральных киллеров и натуральных киллеров-Т-клеток) под влиянием регуляторных факторов, вырабатываемых стро-мальными клетками микроокружения. Именно данные группы генерированных экстракорпорально клеток находят всё большее применение в биотерапии злокачественных новообразований и инфекционных заболеваний, некоторые из них используются для создания противоопухолевых и противоинфекционных вакцин.
Митогенные факторы (лектины) и цитокины (интерлейкины) при инкубации со зрелыми лимфоцитами крови вызывают реакцию бласттранс-формации. В процессе её в популяции лимфоцитов появляются незрелые лимфоидные элементы типа иммунобластов и пролимфоцитов, которые относят к категории активированных лимфоидных клеток. Исследование иммунофенотипа их также свидетельствует об уменьшении количества лимфоцитов, экспрессирующих маркеры зрелых клеточных форм (CD3, CD4, CD8). Подобное явление можно рассматривать как этап дифференцировки зрелых лимфоцитов. Интересен поиск иммуномодулирующих агентов, в том числе и не цитокиновой природы, способных вызвать подобный митогенный эффект. Примером трансдифференцировки гемопоэтических клеток может служить генерация дендритных клеток (ДК). При воздействии ростовых факторов ДК могут быть получены как из клеток
миелоидного, так и лимфоидного рядов. Однако группа изученных источников генерации и индукторов созревания ДК весьма ограниченна.
Вышеизложенное свидетельствует о наличии множества нерешённых вопросов, касающихся стромальных клеток-предшественников и иммуно-компетентных клеток. Часть из них может быть решена в комплексном исследовании данных клеток в процессе их культурального роста под действием разнообразных регуляторных факторов.
Цель исследования — изучение морфологических, иммунофеноти-пических и функциональных свойств стромальных клеток-предшественников и иммунокомпетентных клеток, подвергнутых воздействию факторов бактериальной и эукариотической природы, а также видовых, возрастных и культуральных особенностей их дифференцировки ex vivo и возможностей её регуляции.
Основные задачи исследования:
Исследовать клоногенные свойства, морфогистохимические и им-мунофенотипические особенности стромальных клеток-предшественников костного мозга и выделенных из крови и серозных жидкостей (плеврального, перикардиального и перитонеального транссудатов) КОК-ф лабораторных животных при различных условиях культивирования in vitro.
Определить возрастные изменения количества и клоногенных возможностей стромальных клеток-предшественников костного мозга, тимуса, селезёнки и биологических жидкостей, морфологии формируемых ими колоний у различных лабораторных животных.
Изучить возможности модуляции дифференцировки, клоногенных и остеогенных свойств стромальных клеток-предшественников с использованием бактериальных антигенов и препарата профеталь, включающего в качестве основного компонента человеческий а-фетопротеин.
Провести сравнительный анализ морфологических и функциональных особенностей детерминированных стромальных клеток-предшественников костного мозга и индуцибельных клоногенных клеток, находящихся в перитонеальном транссудате и экссудате крыс.
Исследовать действие препарата профеталь и дать сравнительную характеристику морфогистохимических, электронно-микроскопических, функциональных особенностей и направления дифференцировки моно-нуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, активированных in vitro профеталем, интерлейкином-2 и фитогемагглютинином.
Охарактеризовать иммунофенотип, функциональную активность, морфологические и иммуноцитохимические особенности натуральных киллеров, выделенных из поражённой опухолевым процессом печени лабораторных животных, печени, плеврального и перитонеального экссуда-
тов онкологических больных, и дифференцированных из них натуральных киллеров Т-клеток и лимфокин-активированных киллеров.
Оценить возможности экстракорпоральной генерации зрелых ан-тигенпрезентирующих дендритных клеток с применением индукторов созревания различной природы (препарата профеталь, бактериальных ли-пополисахаридных комплексов). Показать в сравнительном аспекте им-мунофенотипические и морфофункциональные особенности полученных клеток.
Изучить возможности получения опухолеспецифических цитоток-сических лимфоцитов при инкубации со зрелыми дендритными клетками, нагруженными опухолевыми антигенами.
Научная новизна. На значительном экспериментальном материале впервые подробно изучены индуцибельные остеогенные клетки-предшественники, выявленные в крови и серозных жидкостях (плевральном, перикардиальном, перитонеальном транссудатах и перитонеальном экссудате) лабораторных животных.
Впервые показаны в сравнительном плане возрастные изменения численности и эффективности клонирования стромальных клеток-предшественников костного мозга перитонеального транссудата и экссудата различных лабораторных животных.
Дана сравнительная характеристика изменений морфогистохимиче-ских и функциональных показателей КОК-ф костного мозга и клоноген-ных клеток, обнаруженных в перитонеальном транссудате и экссудате у крыс различных линий и возраста, под влиянием условий культивирования.
Впервые исследованы изменения иммунофенотипа, численности и клоногенных свойств стромальных клеток-предшественников костного мозга и селезёнки мышей СВА под действием введённого in vivo и in vitro препарата профеталь, содержащего в качестве основного компонента человеческий а-фетопротеин (ч-АФП).
На модели гетеротропных трансплантатов впервые продемонстрированы изменения эффективности клонирования и способности к остеоге-незу КОК-ф костного мозга мышей при вакцинации их антигенами стрептококка группы А.
Получены новые данные, характеризующие динамику дифференци-ровки лимфокин-активированных киллеров (ЛАК) из мононуклеарных лейкоцитов (МЛ) периферической крови человека, и на основе морфологических, функциональных и иммунофенотипических характеристик определены оптимальные сроки их культивирования.
Впервые исследовано действие препарата профеталь in vitro и проведена сравнительная оценка активации мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) человека под влиянием интерлейкина-2, фитоге-
магглютинина и профеталя. Выявлена высокая степень бласттрансформа-ции под действием последнего с формированием CD34+/CD45+ гемопо-этических клеток-предшественников в культурах мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых доноров.
Исследованы мононуклеарные лейкоциты (МЛ) крови, МЛ, циркулирующие в плевральном и перитонеальном экссудате и инфильтрирующие различные участки печени онкологических больных и экспериментальных животных с метастатическим процессом, их морфологические, им-муноцитохимические и фенотипические особенности, продемонстрированы возможности их дифференцировки в ЛАК и натуральные киллеры Т-клетки (НКТ), показаны их сравнительные характеристики.
Впервые дана сравнительная оценка морфогистохимических, электронно-микроскопических, иммунофенотипических и функциональных особенностей незрелых и зрелых дендритных клеток, генерированных из различных источников под действием ряда иммуномодуляторов.
Теоретическое и практическое значение работы. Результаты изучения особенностей КОК-ф, обнаруженных в крови, плевральном, перикар-диальном транссудатах, перитонеальном транссудате и экссудате, расширяют представления о стромальных клетках-предшественниках (СКП) и дают направление исследованию биологических жидкостей, как одного из возможных источников выделения СКП для использования в практической медицине.
Сравнительная характеристика детерминированных остеогенных клеток-предшественников костного мозга и индуцибельных клоногенных клеток, выявленных в биологических жидкостях, имеет научно-теоретическое значение и вносит вклад в дискуссию о возможностях циркуляции стромальных клеток-предшественников.
Полученные сведения о возрастных изменениях количества и эффективности клонирования стромальных клеток-предшественников костного мозга и тимуса, селезёнки, перитонеального транссудата у лабораторных животных имеют значение для понимания процессов, происходящих при возрастном остеопорозе. Кроме того, они трактуют необходимость учёта возраста и донора, и реципиента, а также источника получения стромальных клеток-предшественников на определённом возрастном этапе в случае применения их в заместительной терапии.
Продемонстрированный на модели гетеротопных трансплантатов характер влияния антигенов стрептококка группы А на клоногенные и ос-теогенные свойства КОК-ф акцентирует внимание на том, какое значительное воздействие оказывают процессы, происходящие в организме реципиента, на функциональные способности трансплантированных стромальных клеток-предшественников и морфогистохимические особенности формирующейся костной ткани. И это, несомненно, необходимо учи-
тывать при разработке методов по использованию мезенхимальных стволовых клеток для трансплантации.
На основании выявленной динамики дифференцировки лимфокин-активированных киллеров из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, их морфологических, функциональных, иммунофенотипических характеристик определены оптимальные сроки экстракорпорального культивирования ЛАК, применяемых в адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований и инфекционных заболеваний.
Исследование иммуномодулирующих способностей препарата профе-таль демонстрирует его более широкие по сравнению с классическими митогенами возможности для экстракорпорального получения активированных мононуклеарных лейкоцитов, обладающих высокими пролифера-тивными и цитотоксическими способностями, для индукции созревания дендритных клеток и опосредованного влияния через данные популяции на стромальные клетки-предшественники костного мозга и селезёнки. Данные эффекты и выявленный в исследованиях высокий уровень бласт-трансформации мононуклеарных лейкоцитов под действием профеталя, приводящей к формированию С034/45-положительных гемопоэтических клеток-предшественников, предполагает возможность использования изученных свойств этого препарата в практической медицине.
Продемонстрированная возможность генерации ЛАК-клеток из мононуклеарных лейкоцитов плеврального и перитонеального экссудатов онкологических больных, ЛАК и НКТ-клеток из клеток паратуморальных лейкоцитарных инфильтратов печени больных колоректальным раком с метастатическим процессом и печени поражённых опухолью мышей, изучение морфологических, иммунофенотипических и функциональных характеристик полученных ЛАК и НКТ-клеток имеет значение для теоретической и клинической онкологии.
Сравнительный анализ морфологических, гистохимических, электронно-микроскопических, функциональных и иммунофенотипических особенностей дендритных клеток различного происхождения и находящихся на разных этапах созревания вносит вклад в теоретические аспекты клеточной дифференцировки и предоставляет возможность выбора источников и индукторов созревания при разработке методов создания ДК-вакцин, применяемых в биотерапии опухолей и тяжёлых инфекций.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Численность детерминированных стромальных клеток-предшественников костного мозга, так же как и выявленных в биологических жидкостях индуцибельных остеогенных клеток-предшественников, эффективность их клонирования и морфология формируемых ими колоний зависят от видовых особенностей экспериментальных животных и
условий культивирования, связанных с влиянием гемопоэтических клеток, претерпевают значительные изменения в процессе онтогенеза.
Под действием антигенов стрептококка группы А происходят изменения не только количества и клоногенных свойств детерминированных клеток-предшественников костного мозга мышей, но и процессов остеогенеза, осуществляемых КОК-ф в гетеротопных трансплантатах. Причём степень этих изменений зависит от длительности воздействия бактериальных антигенов на остеогенные клетки.
Стимулирующее влияние препарата профеталь, введённого in vivo, на КОК-ф костного мозга и селезёнки мышей выражается непосредственно в усилении пролиферативных и клоногенных свойств стромальных клеток-предшественников. Ингибиция колониеобразующих способностей КОК-ф при введении профеталя in vitro осуществляется опосредованно через активированные препаратом мононуклеарные лейкоциты.
Сравнительная характеристика морфогистохимических, электронно-микроскопических, фенотипических и функциональных свойств мо-нонуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, инкубированных с IL-2, ФГА и профеталем демонстрирует наиболее выраженную стимуляцию цитотоксической и пролиферативной активности МЛ под влиянием последнего. Бласттрансформация мононуклеарных лейкоцитов, вызванная действием препарата профеталь, содержащего человеческий а-фетопротеин, приводит к появлению в культурах CD34+/CD45+ гемопоэтических клеток-предшественников.
Генерация ЛАК-клеток возможна из МЛ плеврального, перитоне-ального экссудатов онкологических больных, ЛАК и НКТ — из клеток перитуморальных лейкоцитарных инфильтратов печени онкологических больных и печени экспериментальных животных с метастатическим процессом.
Клетки, генерированные из моноцитов периферической крови человека, прогениторных клеток эмбриональной печени мышей, клеток-предшественников костного мозга взрослых животных, бластов больных острым миелоидным лейкозом имеют комплекс морфологических, электронно-микроскопических, иммунофенотипических и функциональных признаков дендритных клеток. Созревание их может происходить как под действием общепринятого индуктора — фактора некроза опухолей а, так и под влиянием ряда иммуномодулирующих агентов (препарата профеталь, липополисахаридных комплексов бактериального происхождения,). Зрелые ДК, нагруженные опухолевыми антигенами, при коинкубации с МЛ способны активировать их противоопухолевые киллерные способности.
Апробация работы
Материалы диссертационного исследования представлены в виде публикаций на 66 конференциях, съездах, форумах и конгрессах, из них: 3 — на международных конгрессах, 5 — на международных форумах и съездах, 21 — на международных и общероссийских конференциях с международным участием, 25 — на всероссийских конференциях, симпозиумах и съездах, 12 — на межрегионарных, региональных и заочных электронных конференциях РАЕ.
В виде устных и постерных докладов основные положения исследований доложены на: VII Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Казань, 2004), X Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2005» (Санкт-Петербург, 2005), Международном Конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 2005), V Общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004), Международной научной конференции «Мор-фофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференци-ровки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий» (Курган, 2004), V Всероссийской научной конференции с международным участием (Уфа, 2005), V Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2006),VII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2005), II Российской конференции по иммунотерапии и иммунореабили-тации (Москва, 2005), Всероссийской научной конференции, посвященной памяти академика Н.В. Васильева (Томск, 2005), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы теоретической и клинической медицины» (Пермь, 2005), II Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальная и клиническая лимфология — практическому здравоохранению» (Пермь, 2003), Межрегионарной научной сессии ПГМА и ИГМА (Пермь, 2005), Научной конференции «Иммунология вчера, сегодня и завтра», (Пермь, 2005), Научных сессиях ПГМА (Пермь 1996, 1997, 1999, 2000, 2002, 2003, 2004, 2006).
Апробация диссертации состоялась 02.06.2006 г. на объединённом межкафедральном научном заседании морфологических кафедр и кафедры микробилогии и иммунологии ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ, иммунологов Института иммунологии и физиологии УрО РАН (Екатеринбург), Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (Пермь) и кафедры микробилогии и иммунологии Пермского государственного университета.
Внедрение в практику. Основные результаты диссертации внедрены в учебный процесс кафедр онкологии, инфекционных болезней, кафедры профессиональных болезней, промышленной экологии и терапии медико-профилактического факультета с курсом профпатологии ФПК и ППС, гистологии, эмбриологии и цитологии, микробиологии и иммунологии, патологической анатомии с секционным курсом ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава» кафедры микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета, в научно-исследовательскую работу лабораторий Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (Пермь), Института иммунологии и физиологии УрО РАН (Екатеринбург).
Экономическая значимость работы обусловлена разработкой малозатратных и недорогостоящих методов экстракорпоральной генерации активированных мононуклеарных лейкоцитов, CD34+/CD45+ гемопоэтиче-ских клеток-предшественников и антигенпрезентирующих дендритных клеток, которые могут быть использованы при создании препаратов, применяемых в биотерапии онкологических и инфекционных заболеваний (акт внедрения в ГУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН»).
Публикации. Материалы диссертации обобщены в 97 печатных работах. В рекомендуемых ВАК изданиях: 30 статей опубликовано в рецензируемых журналах, 2 работы депонированы в ВИНИТИ, 56 статей и тезисов представлены в материалах международных конгрессов, форумов, всесоюзных и всероссийских съездов, международных и общероссийских конференций. В прочих изданиях (межрегиональных и региональных) напечатано 9 работ.
Объём и структура работы. Диссертация изложена на 320 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 6 глав, посвященных собственным исследованиям, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 53 графиками, 27 гистограммами, 270 фотографиями, содержит 31 таблицу. Библиографический список включает 453 источника (85 — отечественных и 368 — зарубежных авторов).
Диссертационная работа обобщает исследования стромальных клеток-предшественников, выполненные автором на базе лаборатории имму-номорфологии Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН под руководством чл.-корр. РАМН, д-р мед. наук, проф. А.Я. Фриденштейна; вопросы влияния культуры стрептококка группы А и препарата профеталь на КОК-ф — в отделе регуляции иммунитета ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН» (зав. отделом — д-р мед. наук, проф. В.Г. Нестеренко). Исследование иммунофенотипа и
функциональных свойств иммунокомпетентных клеток (мононуклеарных лейкоцитов, дендритных клеток, натуральных киллеров, натуральных киллеров Т-клеток) — на базе лаборатории клеточного иммунитета ГУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН» (зав. лаб. — д-р мед. наук, проф. М.В. Киселевский). Морфологическая часть работы выполнена на кафедре гистологии, эмбриологии и цитологии ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ (зав. каф. — д-р мед. наук, проф. В.А. Четвертных); электронно-микроскопические исследования — в группе электронной микроскопии Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (зав. гр. — д-р биол. наук, В.И. Попенко).
Автор выражает благодарность коллективам и руководителям названных научных учреждений и лично ведущему научному сотруднику НИИ-ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи — д-ру мед. наук Ю.Ф. Горской, совместно с которой проведено ряд исследований, а также всем участникам работы, чей вклад адекватно отражён в совместных публикациях.
Автор также благодарит своих научных консультантов: ак. РАН и РАМН, д-ра мед. наук, проф. В.А. Черешнева и д-ра мед. наук, проф. М.В. Киселевского за постоянную помощь, внимание и доброжелательное участие на всех этапах работы.
Особая глубокая благодарность и память — своему Учителю, увлёкшему изучением стволовых стромальных клеток, давшему направление исследованиям, — чл.-корр. РАМН, д-ру мед. наук, проф. А.Я. Фриден-штейну.
