Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 2. Обзор литературы
2.1. Регуляция клеточного цикла
2.1.1. Циклин-зависимые киназы и регуляция их активности 12
2.1.1.1.Регуляция активности циклин-киназных комплексов с помощью регуляторной субъединицы циклина 12
2.1.1.2. Регуляция активности циклин-зависимых киназ путем их фосфорилирования 14
2.1.1.3. Регуляция активности циклин-зависимых киназ путем связывания с ингибиторами 15
2.2. Контрольные точки клеточного цикла
2.2.1. Роль белков ATM, ATR и их мишеней в функционировании контрольных точек 16
2.2.2. Роль р38 МАРК в функционировании контрольных точек 18
2.2.3. Молекулярные механизмы остановки клеточного цикла в фазеві 21
2.2.4. Молекулярные механизмы остановки клеточного цикла в фазе S 23
2.2.5. Молекулярные механизмы остановки клеточного цикла в фазе G2 28
2.3. Фосфатазы Cdc25: структура и функции 32
2.3.1. Фосфатаза Cdc25C 34
2.3.2. Фосфатаза Cdc25B 36
2.3.3. Фосфатаза Cdc25A 36
2.3.3.1. Регуляция активности фосфатазы Cdc25A путем фосфорилирования 39
2.3.3.2. Механизм протеасомной деградации фосфатазы Cdc25A 42
2.3.3.3. Регуляция активности фосфатазы Cdc25A путем связывания с белком 14-3-За 43
2.4. Клетки линии HeLa 44
ГЛАВА 3. Материал и методика 46
3.1. Получение клеточных линий с индуцибельнои экспрессией различных форм фосфатазы Cdc25A и их культивирование 46
3.2. Плазмиды и сайт-специфический мутагенез 46
3.3. Облучение клеток, вызов осмотического шока, обработка клеток ингибиторами киназ, ингибиторами белкового синтеза и протеасомной деградации , 47
3.4. Анализ содержания белков методом иммуноблоттинга 48
3.5. Определение скорости синтеза ДНК 48
3.6. Подавление экспрессии киназы Chkl с помощью siRNAKChkl 49
3.7. Анализ функциональной активности мутантной формы фосфатазы Cdc25A in vitro , 49
3.8. Определение количества митотических клеток 50
3.9. Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла 51
3.10. Анализ функциональной активности циклин-киназных комплексов in vitro 51
ГЛАВА 4. Результаты 53
4.1. Замена Ser75 на Ala отменяет деградацию Cdc25A в делящихся клетках 53
4.2. Деградация фосфатазы Cdc25A после повреждения ДНК зависит от фосфорилирования по Ser75 57
4.3. Разные киназы отвечают за деградацию Cdc25A после различных стрессовых воздействий 62
4.4. Анализ уровня фосфорилирования фосфатазы Cdc25A после различных стрессовых воздействий 65
4.5. Анализ распределения по фазам цикла клеток HeLa, экспрессирующих различные формы Cdc25A 67
4.6. Киназы р38 и Chkl участвуют в остановке синтеза ДНК после стрессовых воздействий 67
4.7. Клетки останавливают синтез ДНК после облучения, несмотря на присутствие постоянно активной Cdc25A 71
4.8. Киназы р38 и Chkl участвуют в остановке клеточного цикла на границе перехода G2—»М после стрессовых воздействий 75
4.9. Экспрессия стабильной формы Cdc25A позволяет увеличить количество клеток, преодолевших контрольную точку G2/M после стрессовых воздействий 78
4.10. Анализ активности циклин-зависимых киназ cdk2 и cdc2 в клеточных линиях, экспрессирующих различные формы фосфатазы Cdc25A 80
ГЛАВА 5. Обсуждение 84
5.1. Изучения сайтов фосфорилирования Cdc25A, участвующих в регуляции ее стабильности 85
5.2. Разные киназы фосфорилируют Cdc25A после разных стрессовых воздействий 88
5.3. Анализ осуществления клетками HeLa контрольных точек 90
Выводы 97
Список работ, опубликованных по теме диссертации 98
Список литературы 99
Благодарности 114
- Роль р38 МАРК в функционировании контрольных точек
- Плазмиды и сайт-специфический мутагенез
- Разные киназы отвечают за деградацию Cdc25A после различных стрессовых воздействий
- Экспрессия стабильной формы Cdc25A позволяет увеличить количество клеток, преодолевших контрольную точку G2/M после стрессовых воздействий
Введение к работе
Актуальность проблемы
Деление клетки — сложный многоэтапный процесс, нарушение строгой регуляции которого может стать причиной трансформации или гибели клетки. После получения сигнала к делению клетка переходит из фазы покоя Go в фазу Gi, в которой запускаются процессы, необходимые для синтеза ДНК (фаза S). После завершения фазы S клетка вступает в фазу G2, где готовится к разделению на две дочерние клетки, которое происходит в митозе (фаза М). Прохождение клетки по циклу регулируется циклин-зависимыми киназами, активность которых зависит от фосфорилирования и дефосфорилирования по определенным сайтам и взаимодействия с позитивными и негативными белками-регуляторами. В случае повреждения ДНК прохождение клетки по циклу может быть остановлено в контрольных (сверочных) точках клеточного цикла - на границах перехода G]/S, G2/M и в митозе. Таким образом клетка получает возможность исправить полученные повреждения и не допустить передачу дочерним клеткам мутационных изменений ДНК.
Семейство фосфатаз Cdc25 управляет прохождением по клеточному циклу, дефосфорилируя и активируя циклин-зависимые киназы. Известно три фосфатазы семейства Cdc25 - А, В и С. Фосфатазы Cdc25B и С последовательно активируются в фазе G2 клеточного цикла и дефосфорилируют киназу Cdc2 в составе комплекса с циклином В1, обеспечивая этим вхождение клетки в митоз (см. обзор: Nilsson, Hoffmann, 2000). Фосфатаза Cdc25A способна дефосфорилировать как циклин-зависимую киназу Cdk2 в комплексе с циклином Е или А в Gi фазе клеточного цикла, так и Cdc2 в комплексе с циклином В1 при переходе G2—»М (Galaktionov, Beach, 1991; Jinno et al., 1994; Hoffmann et al., 1994; Blomberg et al., 1999; Mailand et al., 2002).
Работа фосфатаз семейства Cdc25 строго контролируется, так как их постоянная активность может привести к ускорению прохождения клетки по циклу. Поэтому после завершения перехода из одной фазы клеточного цикла в другую происходит инактивация фосфатаз, которые принимали участие в этом процессе. То же самое наблюдается при остановке клеточного цикла в ответ на стрессовые воздействия. Процесс инактивации фосфатаз семейства Cdc25 начинается с фосфорилирования по определенным остаткам серина, которые находятся в консенсусной последовательности связывания с белком 14-З-Зо. После образования комплекса фосфатаз с белком 14-3-За они переходят из ядра в цитоплазму, таким образом пространственно разъединяясь со своими мишенями (Gabrielli et al., 1997; Peng et al., 1997). Известно, что после повреждения ДНК фосфорилирование и дезактивация фосфатазы Cdc25C осуществляется киназой Chkl (Peng et al., 1997; Sanchez et al., 1997), а фосфатазы Cdc25B - киназами Chkl и p38 МАРК (mitogen-activated protein kinase) (Bulavin et al., 2001).
Регуляция активности фосфатазы Cdc25A в делящихся клетках и в ответ на стрессовые воздействия осуществляется путем убиквитин-зависимой протеасомной деградации (Mailand et al., 2000; Molinari et al., 2000; Falck et al, 2001), которая запускается после ее фосфорилирования киназами Chkl или Chk2. Деградация Cdc25A приводит к повышению уровня фосфорилирования циклин-киназных комплексов, что, в свою очередь, приводит к остановке клеточного цикла. Однако вопрос о сайтах Cdc25A, фосфорилирование которых запускает каскад событий, приводящий к ее деградации, оставался открытым. Фосфорилирование фосфатазы Cdc25A млекопитающих по Serl23 вызывает деградацию белка после действия ионизирующей радиации (Falck et al., 2001). Однако для Cdc25A шпорцевой лягушки Xenopus laevis сайтом, фосфорилирование по которому необходимо для деградации белка, оказался Ser73 (соответствующий Ser75 млекопитающих), в то время как аналог Serl23 у Xenopus laevis никак не влиял на стабильность Cdc25A (Shimuta et al., 2002).
1.2. Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы было изучение регуляции стабильности фосфатазы Cdc25A и функционального значения этого процесса в клеточном цикле. В соответствии с этим были сформулированы следующие экспериментальные задачи:
1) разработать клеточную систему с индуцибельной генетической конструкцией для изучения свойств различных форм (дикой и мутантной) экзогенной фосфатазы Cdc25A;
2) путем сайт-направленного мутагенеза идентифицировать сайты фосфорилирования Cdc25A и выяснить их значение в процессе деградации Cdc25A в естественном ходе клеточного цикла и после действия ДНК-повреждающих агентов;
3) идентифицировать киназы, принимающие участие в
фосфорилировании Cdc25A, которое инициирует процесс протеасомной деградации Cdc25A при переходе из одной фазы клеточного цикла в другую и после стрессовых воздействий;
4) получить клеточную линию, экспрессирующую стабильную форму фосфатазы Cdc25A и изучить ее способность к регуляции клеточного цикла в ответ на стрессовые воздействия.
1.3. Основные положения, выносимые на защиту.
1. Для протеасомной деградации фосфатазы Cdc25A необходимо ее фосфорилирование по Ser75 киназой Chkl (в нормальных условиях и после повреждения ДНК) и киназой р38 (после действия осмотического шока).
2. Активность киназ р38 и Chkl вызывает остановку синтеза ДНК в облученных или подвергнутых действию осмотического шока клетках.
3. Экспрессия стабильной формы Cdc25A (мутация по Ser75) способствует переходу в митоз клеток, подвергнутых действию облучения или осмотического шока, но не может предотвратить остановку синтеза ДНК.
1.4. Научная новизна.
Впервые показано, что мутация по Ser75 делает фосфатазу Cdc25A человека устойчивой к деградации при нормальном прохождении клеточного цикла, а также после действия ДНК-повреждающих агентов и осмотического шока. Показана роль киназы Chkl в фосфорилировании и регуляции стабильности фосфатазы Cdc25A.
Впервые обнаружена возможность участия р38 МАРК в фосфорилировании Cdc25A.
Впервые показана роль р38 в остановке синтеза ДНК в ответ на облучение ультрафиолетом и осмотический стресс.
Впервые показана возможность прохождения контрольной точки на границе фаз G2/M после стрессовых воздействий клетками, экспрессирующими стабильную форму фосфатазы Cdc25A .
1.5. Теоретическое и практическое значение работы.
Данные, полученные в настоящем исследовании, позволили выяснить механизмы деградации фосфатазы Cdc25A и роль этого процесса в регуляции событий клеточного цикла. Идентифицирован сайт, фосфорилирование которого необходимо для деградации фосфатазы Cdc25A в нормальных и стрессовых условиях. Полученные стабильные клеточные линии, экспрессирующие устойчивую к деградации фосфатазу Cdc25A, могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов регуляции клеточного цикла.
1.6. Апробация работы.
По теме диссертации опубликованы 4 печатные работы (3 статьи). Основные положения были доложены и обсуждались на научных семинарах Лаборатории молекулярных основ дифференцировки клеток Института цитологии РАН и Лаборатории генного ответа Национального института рака при Национальном институте здоровья (Бетесда, США).
1.7. Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 97 страницах машинописного текста и иллюстрирована 21 рисунком.
Роль р38 МАРК в функционировании контрольных точек
Два родственных и консервативных белка, киназы ATM и ATR из семейства Р13 киназ, являются центральными компонентами ответа клетки на повреждение ДНК. У клеток людей, больных атакси-телангестазией, отсутствует Gi и G2 блок клеточного цикла после облучения ионизирующей радиацией. Оказалось, что в этих клетках мутирован ген atm, названный по болезни, которую вызывает его отсутствие (см. обзор: Rotman, Shiloh, 1999). Впоследствие было показано, что ATM контролирует фосфорилирование нескольких ключевых белков, участвующих в ответе клетки на повреждение ДНК -р53, Mdm2, BRCA1, Chk2 и Nbsl (Banin et al., 1998; Khosravi et al., 1999; Gatei et al., 2000; Chaturvedi et al., 1999; Lim et al., 2000). Эти белки фосфорилируются в AT клетках, но со значительной задержкой. К тому же такие клетки хотя и чувствительны к ионизирующей радиации, оказались устойчивы к таким стрессам, как облучение ультрафиолетом и подавление репликации ДНК. Накопленные данные позволили предположить, что существуют параллельные механизмы (белки), обеспечивающие ответ клетки на повреждение ДНК. Таким белком оказался ATR. ATM и ATR имеют общие субстраты для фосфорилирования (р53, BRCA1) и часто фосфорилируют одинаковые аминокислотные остатки, активируясь при разных типах облучения. Их функции в нормальном развитии организма, по-видимому, различаются, что показали опыты на мышах, нокаутированных по этим генам.
В то время как atm 1 мыши жизнеспособны, хотя бесплодны и обладают замедленным ростом, мыши atr 1 умирают на ранних стадиях развития. ATM и ATR фосфорилируют белки, активность которых приводит к остановке клеточного цикла (Chkl, Chk2, р53), запуска репарации ДНК (BRCA1, Nbsl) и апоптозу (р53). Chkl и Chk2 - серин-треониновые киназы, структурно не родственные, но обладающие общей субстратной специфичностью (см. обзор: Bartek, Lukas, 2003). Chk2 - стабильный белок, присутствующий в клетке постоянно, но находящийся в неактивном состоянии (Lukas et al., 2001). Он активируется киназой ATM в ответ на двойные разрывы ДНК. ATM фосфорилирует киназу Chk2 по Thr68, после чего она димеризуется и получает способность к автофосфорилированию. Напротив, Chkl - неустойчивый белок, присутсвующий главным образом в фазах S и G2, и активный в нормальных условиях, хотя он так же активируется в ответ на повреждение ДНК или нарушениях репликации (Zhao et al, 2002). Изначально считалось, что Chkl фосфорилируется ATR, a Chk2 -ATM, однако в последнее время такая картина была изменена примерами фосфорилирования киназы Chkl ATM после облучения ионизирующей радиацией, а также АТМ-независимого фосфорилирования Chk2. Эти киназы разделяют и субстратную специфичность. Chkl и Chk2 фосфорилируют белки, контролирующие репликацию ДНК, прохождение клетки по циклу, организацию хроматина и апоптоз. Киназа Chk2 фосфорилирует белки BRCA1, Р1кЗ, E2F, и вместе с киназой Chkl белки Mdm2, р53 (апоптоз, блок клеточного цикла, репарация ДНК) и Cdc25A (Falck et al., 2000), Cdc25C и Tlk (Chaturvedi et al, 1999; Matsuoka et ah, 1998; Krause et al., 2003). Эмбриональные стволовые клетки с негативной регуляцией экспрессии гена chkl умирают путем р53-независимого апоптоза. Перед этим они оказываются неспособными остановиться на границе G2/M в ответ на облучение ионизирующей радиацией.
Таким образом можно судить о роли Chkl в осуществлении контрольной точки перехода G2— М. Дальнейшие исследования показали, что Chkl и Chk2 участвуют в остановке цикла в G2 фазе клеточного цикла, фосфорилируя фосфатазу Cdc25C по сайту связывания с белком 14-3-Зс (Ser216). Это приводит к перемещению Cdc25C из ядра в цитоплазму и, следовательно, к увеличению уровня фосфорилирования циклин-зависимой киназы cdc2. Фосфорилирование киназой Chk2 транскрипционного фактора р53, активирующего негативные регуляторы клеточного цикла р21 и 14-3-Зст также указывают на роль Chk2 в контрольной точке при переходе G?- М. Chkl и Chk2 фосфорилируют также другую фосфатазу семейства Cdc25 - Cdc25A (Falck et аЦ 2000; Zhao et ah, 2002). Было показано, что деградация Cdc25A после облучения ионизирующей радиацией и ультрафиолетом происходит после фосфорилирования этими киназами. Это позволило предположить, что таким способом Chkl и Chk2 предотвращают синтез поврежденной ДНК. При поврежеднии ДНК быстро активируется р38 МАРК (от англ. mitogen activated protein kinase). Каскад MAP киназ - универсальный сигнальный путь, найденый у низших и высших эукариот (см. обзор: Yang et al., 2003). Его составляют последовательно активируемые классы киназ - МАРККК, МАРКК, МАРК. Киназы JNK и р38, принадлежащие к семейству SAPK (stress activated protein kinase) являются важными участниками каскадов, запускаемых в клетке в ответ на различные стрессовые воздействия. Киназа р38 была клонирована из В-лимфоцитов как белок, быстро фосфорилирующийся в ответ на появление в среде липополисахаридов. В дальнейшем была показана ее гомология с киназой дрожжей Hogl, члена МАРК семейства. Мутанты по HOG1 обладают повышенной чувствительностью к гипертоническому
Плазмиды и сайт-специфический мутагенез
Для трансфекции клеток использовали вектор pTRE, содержащий к ДНК Cdc25A человека с гемагтлютининовым участком. Для получения мутантной формы Cdc25A в плазмиду вносили точечные мутации с помощью следующих праймеров: для замены Serl23 на Ala — 5 -CTGAAGAGGAGCC ATGATGATTCTCTTGACC ATG-3 75 Клетки облучали ультрафиолетом (УФ) в дозе 40 Дж/м или ионизирующей радиацией (ИР) в дозе 15 Гр, Осмотический шок вызывали, повышая концентрацию NaCl в среде культивирования до 177 мМ против 150 мМ в контроле. Химические ингибиторы использовали в следующих концентрациях: ингибитор киназы Chkl UCN-01 - 0.6 нМ, ингибитор киназы р38 PD169316 - 10 мкМ), ингибитор белкового синтеза циклогексимид - 25 мкг/мл, ингибитор протеасом ALLN - 10 мкМ. Клетки обрабатывались указанными ингибиторами за 30 мин до начала стрессового воздействия.
Клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), после чего лизировали в буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 140 мМ NaCl, 1% NP-40, 1 мМ фенилметилсульфонилфлюорид, по 10 мкг/мл апротинина и леупептина и центрифугировали при 14000 g 10 мин. После электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия белки из геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану инкубировали в PBS, содержащем 0.05% Tween-20, 5% обезжиренного молока и соответствующие первые антитела. Использовали моноклональные антитела против Cdc25A (NeoMarkers, Lab Vision Corporation, США) и поликлональные антитела против Chkl (SantaCruz Biotechnology, США). В качестве вторых антител использовали антитела против иммуноглобулинов кролика и мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (Amersham, Великобритания). Комплексы антител выявляли с помощью реагента ECL (Pierce, США).
Клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста, инкубировали с [14С]-тимидином (Amersham, Великобритания) в конечной концентрации 7,4-105 Бк/мл в течение 24 ч, затем отмывали и культивировали 12-16 ч в обычной среде с добавлением доксициклина (Zhao et al., 2002). После этого клетки облучали или подвергали осмотическому стрессу и через 1 ч добавляли [ Н]-тимидин до конечной концентрации 9,25-104 Бк/мл. Через 15 мин клетки собирали, промывали PBS, инкубировали последовательно по 5 мин в 100%-номметаноле, 10%-ной уксусной кислоте, лизировали в 0.3 Н NaOH и нейтрализовали полученный раствор 0.3 М НС1. Уровень радиоактивности измеряли счетчиком Beckton (США). Все эксперименты повторяли не менее 3-х раз.
Для подавления в клетке Chkl использовали siRNA к Chkl согласно протоколу фирмы-изготовителя (Dharmacon Research, США). Использовали нуклеотиды, кодирующие участок со 127-й по 147-ю аминокислоту киназы Chkl человека. Дуплексы siRNA трансфицировали в клетки реагентом Oligofectamine (Invitrogene, США). Эксперименты проводили через 24 ч после трансфекции. Уровень белка Chkl проверяли иммуноблоттингом.Клетки лизировали в гипотоническом буферном растворе, содержащем 20 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 20 мМ MgCb и ингибиторы протеаз. Cdc25A преципитировали из лизата гемагглютинин-сефарозой (Roche, США), В качестве субстрата фосфатазы Cdc25A использовали фосфорилированые циклин-киназные комплексы cdc2-cyclin В1 из клеток HeLa, предварительно обработанных адриамицином (0.2 мкг/мл) в течение 24 ч. Комплексы преципитировали антителами к cdc2 (SantaCruz Biotechnology, США), которые осаждали Протеин А-сефарозой (Sigma, США). Сефарозу с преципитированными белками промывали фосфатазным буфером (20 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитола) и помещали в водяную баню при 30 С на 1 ч. Фосфатазную реакцию проводили в объеме 50 мкл и останавливали добавлением буфера для электрофореза. После кипячения буфер с белками наносили на гель для элетрофореза. Уровень фосфорилирования киназы cdc2 по Тугі 5 определяли методом иммуноблотинга с фосфоспецифичными антителами к фосфорилированному Tyrl 5 (Calbiochem, США).
Через 1 ч после облучения ИР, УФ или осмотического шока клетки промывали PBS и фиксировали 70%-ным этиловым спиртом. После фиксации клетки промывали PBS и помещали в PBS, содержащий 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0.05% Tween на 1 ч, после чего в раствор добавляли первые антитела к фосфорилированной форме гистона НЗ (Upstate Biotechnology, США) и инкубировали в течение 1 ч. Затем клетки инкубировали 1 ч со вторыми антителами СуЗ (BecktonDickinson, США) и помещали в PBS, содержащий йодистый пропидий (40 мкг/мл) и РНКазу А (100 мкг/мл). Распределение клеток по циклу анализировали на проточном
Разные киназы отвечают за деградацию Cdc25A после различных стрессовых воздействий
Добавление в среду культивирования клеток ингибитора киназы р38 PD169316 не привело к повышению уровня Cdc25A ни в контрольных, ни в облученных УФ клетках (рис. 9). Напротив, ингибирование киназы Chkl повысило уровень Cdc25A в необлученных делящихся клетках, а также частично отменило деградацию Cdc25A после облучения УФ. Добавление ингибитора протеасомной деградации ALLN привело к такому же результату. Полученные данные свидетельствуют о том, что протеасомная деградация Cdc25A при прохождении нормального клеточного цикла и после облучения УФ запускается после фосфорилирования киназой Chkl, но не р38.
Мы решили проверить, деградирует ли фосфатаза Cdc25A после стресса, напрямую не связанного с повреждением ДНК — осмотического стресса. Оказалось, что при повышении концентрации NaCl в среде для культивирования клеток до 178 мМ против 150 мМ в контроле, Cdc25A быстро деградирует, исчезая почти полностью уже через 1 ч после добавления NaCl (рис. 10). Ингибирование киназы Chkl никак не влияет на деградацию Cdc25A после осмотического стресса (рис. 10). Предварительная обработка клеток ингибитором киназы р38 PD169316 приводит к стабилизации уровня Cdc25A, который оставался неизменным даже после 2-х ч инкубации в растворе с повышенным содержанием NaCl, Таким образом, можно заключить, что процесс деградации Cdc25A после осмотического стресса запускает киназа р38, но не Chkl. На рис. 10 видно, что замена Ser75 на аланин отменяет деградацию Cdc25A после осмотического стресса. Дальнейшие исследования показали, что р38 способна фосфорилировать фосфатазу Cdc25A по Ser75 (Goloudina et al., 2004). Единственными доступными нам фосфоантителами на Cdc25A были антитела, специфически узнающие последовательность, содержащую фосфорилированный Serl23. С их помощью мы исследовали статус фосфорилирования Cdc25A. Оказалось, что уровень фосфорилирования Serl23 возрастает после облучения УФ, ИР или обработкой NaCl (рис. 11). Ингибирование действия киназ Chkl и р38 приводило к уменьшению фосфорилирования по Serl23 как в контрольных клетках, так и в клетках, облученных УФ, ИР, или подверженных осмотическому стрессу. Dox — доксициклин; ИР — ионизирующая радиация; УФ — ультрафиолет; PD — ингибитор р38 PD169316; NaCl — осмотический стресс, вызванный повышением в среде культивирования концентрации NaCl. У клеток HeLa отсутствует блок клеточного цикла на границе Gi/S в ответ на повреждение ДНК вследствие экспрессии вирусного белка Е6 HPV, вызывающего деградацию белка р53 (Schwarz et al., 1985; DeFilippis et al., 2003). После облучения клетки HeLa накапливаются в фазе S и замедляют скорость синтеза ДНК, что свидетельствует о существовании у них механизма задержки клеточного цикла в фазе S. Клетки, преодолевшие фазу S, могут накапливаться в фазе G2. Повышение экспрессии стабильной формы Cdc25A фосфатазы приводит к незначительному увеличению количества клеток, останавливающихся в фазе S после облучения (рис. 12), что, возможно, свидетельствует о повышенной скорости перехода G—S. В отличие от контрольной точки Gj/S, контрольная точка в фазе S не зависит от р53.
Повреждения ДНК активируют киназы ATM и ATR, которые фосфорилируют ряд белков, необходимых для остановки синтеза ДНК. Chkl является мишенью ATM, и ее участие в остановке синтеза ДНК после облучения ИР было показано в нескольких лабораториях (Zhao et al., 2002; Sorensen et al,, 2003). различные формы экзогенной фосфатазы Cdc25A по фазам клеточного цикла после облучения ионизирующей радиацией. а — контрольные клетки HeLa; б - клетки HeLa, экспрессирующие экзогенную Cdc25A дикого типа; в - клетки HeLa, экпрессирующие фосфатазу Cdc25A с мутацией Ser75 и Serl23 на Ala. К - контроль; ИР - ионизирующая радиация.
Экспрессия стабильной формы Cdc25A позволяет увеличить количество клеток, преодолевших контрольную точку G2/M после стрессовых воздействий
Фосфатаза Cdc25A вместе с Cdc25B и Cdc25C участвует в переходе из фазы G2 в фазу М клеточного цикла, дефосфорилируя циклин-киназный комплекс cdc2-cyclin Bl (Galaktionov, Beach, 1991; Mailand et al., 2002). Был показан эффект частичного преодоления контрольной точки G2/M в присутсвие фосфатазы Cdc25C, мутантной по сайту ингибирующего фосфорилирования киназой Chkl. Так как ингибирование стресс-киназ, направляющих Cdc25A на путь протеасомной деградации, приводило к частичной отмене остановке клеточного цикла на границе перехода G2—»М, мы решили проверить, может ли частичное ингибирование действия киназ р38 и Chkl (посредством экспрессии в клетке фосфатазы Cdc25A, устойчивой к протеасомной деградации), привести к такому же результату. Для того, чтобы узнать, как экспрессия стабильной формы фосфатазы Cdc25A влияет на прохождение клеток через контрольную точку на границе фаз G2/M после стрессовых воздействий, определяли количество митотических клеток после облучения ИР, УФ или осмотического шока. На рис. 16 видно, что если в клетках, экспрессирующих фосфатазу дикого типа, количество митотических клеток после облучения ИР или УФ падало до 20%, то в клетках, экспрессирующих стабильную мутантную форму Cdc25A, оно падало только до 35-45% .
Повышение в среде культивирования концентрации NaCl уменьшало количество митотических клеток до 60%, однако в линиях, экспрессирующих стабильную форму Cdc25A, оно оставалось wt Рис. 19. Изменение количества митотических клеток после стрессовых воздействий в популяциях HeLa, экспрессирующих различные формы фосфатазы Cdc25A. соответствующих остатков серина на аланин. Инактивация циклин-зависимых киназ после стрессового воздействия является одним из механизмов остановки клеточного цикла. Один из способов подавить активность циклин-зависимых киназ - их фосфорилирование по Тугі 5 и Thrl4. После различных стрессовых воздействий фосфорилирование по этим сайтам возрастает — это является следствием деградации или инактивации фосфатаз семейства Cdc25. Фосфатаза Cdc25A принимает участие в дефосфорилировании как cdk2-cyclinE(A) комплекса, активного в фазе G] и фазе S клеточного цикла, так и в дефосфорилировании комплекса cdc2-cyclinBl, активность которого необходима для вхождения клетки в митоз. Мы решили проверить, являтеся ли полученный нами результат о том, что активности Cdc25A недостаточно для остановки синтеза ДНК следствием низкой активности циклин-зависимой киназы cdk2. Для этого проводили киназную реакцию cdk2 in vitro.
Циклин-киназные комплексы иммунопреципитировали из клеточных лизатов антителами к циклину А. На рис. 20 видно, что активность cdk2 падает после облучения УФ в клетках HeLa, экспрессиругощих фосфатазу Cdc25A дикого типа. Однако присутсвие в клетках стабильной формы Cdc25A S75/123A приводило к меньшему падению активности cdk2. Интересный факт получен при изучении активности киназы cdk2 после осмотического шока. Хотя скорость синтеза ДНК после добавления в среду для культивирования клеток падает до 10% уже через 1 ч после начала стрессового воздействия, активность cdk2 в таких клетках почти не меняется. Активность cdc2 мало изменяется после осмотического шока (рис. 21), что, на этот раз, совпадает с тем, что повышение концентрации NaCl лишь незначительно уменьшает количество митотических клеток в популяции. В ответ на стрессовые воздействия в клетке запускается множество процессов, призванных остановить клеточный цикл и не допустить передачу дочерним клеткам неправильной последовательности ДНК. Частью ответа клетки на стрессовые условия являются сигнальные пути, приводящий к подавлению активности циклин-зависимых киназ — белков, управляющих переходом из одной фазы клеточного цикла в другую. Один из способов остановить работу циклин-зависимых киназ — это ингибировать работу фосфатаз семейства Cdc25, которые необходимы для их полноценной активности. Целью настоящей работы было изучить механизм деградации фосфатазы Cdc25A в клетках HeLa в нормальных условиях и после различных стрессовых воздействий, а так же выяснить, какую роль играет Cdc25A при остановке этих клеток в контрольных точках клеточного цикла в ответ на повреждение ДНК.
Похожие диссертации на Деградация фосфатазы CDC25A в клетках линии Hela: механизм и влияние на клеточный цикл
