Введение к работе
Актуальность темы исследования. Одним из важнейших вопросов, сформулированных класссической генетикой и решаемых молекулярной биологией, является пластичность генома, его изменчивость, отличающаяся по темпам и механизмам от обычного мутационного процесса /Хесин, 1985/. Частью проблемы "непостоянства генома" являются его перестройки, ведущие к образованию экстрахромосомных молекул ДНК (эДНК), обнаруживаемых в клетках эукариотических организмов различного уровня организации /см. Rush, Misra, 1985 / ^ак правило, эДНК представлены кольцевыми, гетерогенными по размеру молекулами /3ertelsen et. al., 1982 /. Некоторые из них образуются путем эксциэии фрагментов ДНК из хромосом; другие - представляют собой амплифицированные молекулы ДНК, формирующиеся при рекомбинации участков хромосом, реплици-рованных более I раза за клеточный цикл /schimke et al., 1986 /. Показано, что эДНК может содержать гены, детерминирующие фенотип клеток /Von Hoff et al.j 1988, Ruiz et al., 1989 /, но в целом ее функциональное значение остается не установленным. В отсутствие селективного давления клетки быстро утрачивают эДНК /pauletti et al., 1990 /. Имеются данные свидетельствующие о том, что она способна выходить из ядра в цитоплазму /Kiyama et al., 1989 /, ее дальнейшая судьба остается не выясненной.
Практически независимо от изучения эДНК с середины 70-х годов разрабатывается вопрос о внеклеточной ДНК (внДНК), выходящей из клеток во внеклеточную среду и обнаруживаемой в ряде биологических жидкостей, в частности -в плазме крови. Хотя выход ДНК описан для самых разных клеток, подавляющее большинство работ выполнено на лимфоцитах (Лфц) крови человека /см. Федоров, Янева, 1982/. Получены убедительные доказательства того, что появление внДНК является активным процессом и не связано с гибелью клеток /см. Adams, 1985 / Ее количество значительно воз-
растает при активации клеток митогенами, лазерным излучением, мембранотропными агентами (трипсин, проназа, плаз-мин). При стимуляции фитогемагглютинином (ФГА) 70-90% Лфц включает Н-тимидин, но в митоз вступает менее 40%, 35-90% синтезированной ДНК экскретируется в среду /Rogers et al., 1972 /. По данным кинетики реассоциации, она отличается от тотальной ДНК клеток и составляет около 10% генома Лфц /Rogers, 1976 /. Механизм образования бнДНК и ее функции остаются неясными. Некоторые исследователи считают, что внДНК является следствием шеддинга ДНК с плазматической мембраны и что именно на поверхности клеток она выполняет свою основную функцию, являясь составной частью сложных рецепторных образований /Beid et al., 1979/. Имеется ряд данных, свидетельствующих о том, что внДНК способна регулировать пролиферативную активность других клеток /Гамалея и др., 1983, Sryfter, Ktorowicz, 1984 /. Не исключено, что внДНК учавствует в процессе обмена генетической информацией между различными субпопуляциями Лфц в процессе им-муного ответа /Anker et al., 1984/.
Пониманию функционального значения внДНК может способствовать идентификация ее клеточных предшественников и анализ присутствующих в ней нуклеотидных последовательностей. В некоторых работах, выполненных с помощью импульсного мечения ДНК Н-тимидином, предшественник внДНК был обнаружен среди эДНК клеток /Rogers, 1976 /, однако, исследований взаимосвязи эДНК и внДНК с использованием современных методов не проводилось.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы -изучение нуклеотидных последовательностей и структуры внДНК с позиции тех механизмов, которые вовлечены в процессы образования эДНК. Представлялось целесообразным выполнить такое исследование в основном на Лфц крови человека в норме и в условиях, стимулирующих выход из них ДНК, и лишь в некоторых экспериментах использовали другие клет-
ки. Задачи работы состояли в следующем. , I. Электрофоретический анализ внДНК.
-
Идентификация в препаратах внДНК кольцевых молекул.
-
Гибридизационный анализ внДНК Лфц и ДНК плазмы крови человека.
-
Гибридизационный анализ внДНК различных субпопуляций Лфц.
-
Выявление в препаратах внДНК амплифицированных молекул.
Научная новизна работы. Впервые показано, что ДНК, освобождающаяся в культуральную среду из Лфц, содержит кольцевые молекулы, среди которых обнаружены дискретные по размеру фрагменты, гомологичные делегирующемуся в процессе дифференцировки иммуноглобулиновому (ig-) гену д{ . Их источником являются В-Лфц. Впервые получены доказательства того, что внДНК Лфц и клеток промиелоцитической лейкемии человека HL 60 содержит амплифицированные молекулы. Выявленные свойства внДНК дают основание считать, что ее предшественником является эДНК клеток.
Впервые установлено, что УФ облучение (УФО) крови в терапевтических дозах (применяемых при аутотрансфузиях УФ облученной крови - АУФОК) способствует повышению содержания ДНК в плазме и ее выходу из Лфц.
Практическая ценность работы. Полученные результаты существенно дополняют сведения о свойствах и происхождении ДНК, освобождающейся из эукариотических клеток. Они способствуют углублению имеющихся представлений о механизмах поддержания стабильности генома. Стимуляция выхода ДНК в плазму крови после ее УФО в терапевтических дозах, может составить один из механизмов иммунокорегирующего действия метода АУФОК. По-видимому, особый интерес полученные данные представляют для практической онкологии. Известно, что в возникновении и прогрессии опухолей важную роль играет процесс амплификации онкогенов. Дополнительные копии онкогенов присутствуют в ряде малигнизиро-
_4-
ванных клеток в виде эДНК. Обнаруженный 'в настоящей работе выход из трансформированных клеток ДНК, обладающей свойствами эДНК, может составлять один из механизмов образования метастазов.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Молодежной конференции Института цитологии АН СССР /Ленинград, 1987/, на I Всесоюзной конференции "Биохимия-медицине" /Ленинград, 1988/, на П школе-конференции молодых ученых /Трускавец, 1988/, на II Международном совещании по клеточному ядру /Суздаль, 1989/, на семинарах факультета математических и биологических наук Ньюйоркского государственного университета /Буффало, США, 1990/, факультета биологии университета Лаваля /Квебек, Канада, 1990/, лаборатории онкогематологии университета /Женева, Швейцария, 1990/ и на совместном семинаре лабораторий биохимической цитологии и цитохимии, стабильности хромосом и клеточной инженерии и генетических механизмов дифферен-цирозки и малигниэации клеток Института цитологии АН СССР /Ленинград, 1990/.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы "Материал и методы исследования", результатов исследования, обсуждения и выводов. Иллюстрированный материал содержит 20 рисунков. Список литературы включает 156 работ, из них 19 на русском языке.
Похожие диссертации на Молекулярно-биологический анализ ДНК, выходящей из лимфоцитов крови человека и клеток постоянной линии HL 60 в среду культивирования
