Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10-50
1.1. Виды оптического излучения и особенности его проникновения в кожу человека 10-11
1.2. Основные современные методы фототерапии 11-16
1.2.1. Механизмы лечебного действия света 17-37
1.2.1.1. УФ излучение 17-27
1.2.1.1.1. УФ облучение кожи 17-22
1.2.1.1.2. УФ облучение крови 22-27
1.2.1.2. Видимый и инфракрасный (ИК) свет 27-37
1.3. Участие ростовых факторов в репарации ДНК и апоптозе 37-50
1.4. Заключение 50
Глава 2. Материалы и методы исследований 51-55
2.1. Образцы крови 51
2.2. Приготовление культур лимфоцитов 51
2.3. Облучение добровольцев и процедура Placebo 51
2.4. Облучение крови in vitro 52
2.5. Оценка митотической активности и уровня структурных нарушений хромосом 52-53
2.6. Авторадиографическое исследование репаративного синтеза ДНК 53
2.7. Оценка количества апоптотических клеток 53-54
2.8. Оценка количества клеток с проапоптотическими маркерами 54
2.9. Статистическая оценка результатов 55
Глава 3. Результаты исследований 56-105
3.1. Влияние плазмы крови добровольцев, облученных полихроматическим УФ светом в терапевтической дозе, на неповрежденные и поврежденные радиацией аутологичные лимфоциты 56-76
3.1.1. ФГА-индуцированная пролиферация и структурное состояние хромосом лимфоцитов периферической крови добровольцев, облученных полихроматическим УФ светом в терапевтической дозе 56-61
3.1.2. ФГА-индуцированная пролиферация и структурное состояние хромосом лимфоцитов, поврежденных УФС излучением 61-65
3.1.3. ФГА-индуцированная пролиферация и структурное состояние хромосом лимфоцитов, поврежденных рентгеновским излучением 65-69
3.1.4. Влияние плазмы крови добровольцев группы Placebo на ФГА-индуцированную пролиферацию и структурное состояние хромосом аутологичных лимфоцитов, поврежденных рентгеновским излучением 69-71
3.1.5. Репаративный синтез ДНК в нестимулированных митогеном лимфоцитах, поврежденных УФС излучением 71-74
3.1.6. Заключение 74-76
3.2. Влияние плазмы крови добровольцев, облученных полихроматическим видимым+инфракрасным поляризованным (ВИП) светом в терапевтической дозе, на поврежденные радиацией аутологичные лимфоциты 77-93
3.2.1. ФГА-индуцированная пролиферация и структурное состояние хромосом лимфоцитов, поврежденных рентгеновским излучением 77-84
3.2.2. Репаративный синтез ДНК в нестимулированных митогеном лимфоцитах, поврежденных УФС излучением 85-87
3.2.3. Количество ФГА-стимулированных апоптотических лимфоцитов 87-89
3.2.4. Количество ФГА-стимулированных лимфоцитов с проапоптотическими маркерами (CD 95/Fas/APO-l и CD 95L/FasL) 89-92
3.2.5. Заключение 92-93
3.3. Влияние плазмы крови, облученной монохроматичным видимым светом He-Ne лазера, на интактные и поврежденные радиацией аутологичные лимфоциты 94-101
3.3.1. ФГА-индуцированная пролиферация и структурное состояние хромосом лимфоцитов крови, облученной монохроматичным видимым светом He-Ne лазера... 94-97
3.3.2. ФГА-индуцированная пролиферация и структурное состояние хромосом лимфоцитов, поврежденных рентгеновским излучением 98-100
3.3.3. Заключение 100-101
3.4. Влияние ростовых факторов (EGF и PDGF) на ФГА-индуцированную пролиферацию и частоту структурных нарушений в поврежденных радиацией лимфоцитах человека 102-105
3.4.1. Заключение 105
Глава 4. Обсуждение 106-115
Выводы 116
Список литературы 117-141
- Участие ростовых факторов в репарации ДНК и апоптозе
- Оценка митотической активности и уровня структурных нарушений хромосом
- Репаративный синтез ДНК в нестимулированных митогеном лимфоцитах, поврежденных УФС излучением
- ФГА-индуцированная пролиферация и структурное состояние хромосом лимфоцитов крови, облученной монохроматичным видимым светом He-Ne лазера...
Введение к работе
Интенсивное применение в лечебных целях, наряду с традиционным УФ облучением поверхности тела, новых фототерапевтических методов — облучения кожных покровов видимым и инфракрасным (ИК) лазерным и нелазерным светом, экстракорпоральной и внутрисосудистой фотомодификации крови пациентов, позволило установить их высокую эффективность при патологиях, характеризующихся сниженным уровнем иммунных и пролиферативных процессов. Поскольку иммунореактивность организма в значительной степени определяется способностью клеток иммунной системы к пролиферации, то изучение природы ростостимулирующего действия света оказывается одним из основных направлений исследований механизмов действия фототерапевтических методов. В работах нашей лаборатории установлено, что при фотомодификации крови основными эффекторами, регулирующими/"запускающими" деление клеток различных тканей человека в условиях in vitro, являются мононуклеары и тромбоциты (Белишева, Самойлова, 1984; Белишева и др., 1986; Samoilova et al., 1996; 1998). Освобождающиеся из этих клеток факторы существенно расширяют спектр биологической активности плазмы крови. В частности, внесение такой плазмы в среду культивирования клеток костного мозга, лимфоцитов, фибробластов, кератиноцитов и эндотелиоцитов повышает их митотическую активность (Белишева, Самойлова, 1984; Самойлова и др., 1985; Фирулина и др., 1987; Blinova et al., 1999; Sokolov et al., 1999; Кошкина и др. 2001; Самойлова и др., 2003). При этом ростостимулирующий эффект плазмы тем выше, чем ниже исходный уровень пролиферации клеток-мишеней. Эта закономерность инициировала разработку в нашей лаборатории экспериментальной модели, в которой в качестве клеток-мишеней с исходно сниженным пролиферативным статусом, культивируемых с плазмой фотомодифицированной крови, использовались поврежденные радиацией лимфоциты. В предварительных экспериментах было показано, что плазма УФ-облученной in vitro крови не только восстанавливает способность поврежденных рентгеновским излучением аутологичных лимфоцитов отвечать на митоген, но и снижает в них частоту хромосомных аберраций (Mukhuradze et al., 1991; Zubanova et al., 1997). Была высказана гипотеза, согласно которой в основе активации пролиферативных процессов факторами фотомодифицированной крови может лежать стимуляция репарации ДНК. Опираясь на имеющиеся в современной литературе данные, мы предположили, что факторами, появляющимися в крови после облучения, способными регулировать как репарацию ДНК, так и пролиферацию клеток, могут быть ростовые факторы и цитокины. Таким образом, восстановление структуры и функций клеточной ДНК, инициируемое аутологичными
факторами фотомодифицированной крови, может составить один из основных механизмов ростостимулирующего действия света. Поскольку предварительные результаты были получены при облучении крови in vitro УФ светом, оставалась неизученной возможность появления таких факторов в случае воздействия на кровь широко используемым в клинической практике видимым лазерным светом. Кроме того, оставалось неясным, индуцируется ли подобный эффект неинвазивными фототерапевтическими методами, в частности, облучением поверхности тела полихроматическим излучением УФ, видимого и ИК диапазона. Известно, что эти излучения достаточно глубоко проникают в кожу и, достигая густой сети поверхностных микрососудов, могут таким образом действовать на кровь (Parrish et al., 1978), циркулирующую здесь с относительно невысокой скоростью. По существу, в этом случае осуществляется транскутанная фотомодификация крови.
Цель и задачи исследования
Цель настоящей работы - исследовать способность плазмы крови, модифицированной in vivo (транскутанно) полихроматическим УФ и видимым+инфракрасным поляризованным (ВИП) светом или in vitro красным светом He-Ne лазера, активировать пролиферацию и репарацию ДНК в аутологичных лимфоцитах, поврежденных сублетальными дозами радиации. Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:
Сравнить митоген-индуцированную пролиферацию, частоту структурных хромосомных аберраций и репаративный синтез ДНК в поврежденных радиацией лимфоцитах, культивируемых с аутологичной плазмой интактной и фотомодифицированной крови.
Оценить вероятность активации факторами фотомодифицированной крови апоптотической гибели поврежденных радиацией аутологичных лимфоцитов.
3. Выяснить возможность изменения митоген-индуцированной пролиферации и частоты
структурных хромосомных аберраций в поврежденных радиацией лимфоцитах в
присутствии ассоциированных с тромбоцитами ростовых факторов — PDGF и EGF,
появляющихся в фотомодифицированной крови.
Основные положения, выносимые на защиту
Облучение поверхности тела человека полихроматическим УФ или ВИП светом в терапевтической дозе приводит к появлению в крови факторов, способных восстанавливать митотическую активность поврежденных радиацией аутологичных лимфоцитов, снижать в них частоту структурных хромосомных аберраций и стимулировать репаративный синтез ДНК.
Быстрое появление в крови облученных лиц таких факторов в значительной степени связано с транскутанной фотомодификацией крови в микрососудах кожи и действием
g такой крови на весь ее циркулирующий объем.
Плазма крови, облученной He-Ne лазером in vitro, восстанавливает сниженную радиацией митотическую активность аутологичных лимфоцитов. После смешивания лазером облученной крови с 10-кратным объемом интактной аутологичной крови, моделирующего ситуацию в сосудистом русле, в ней появляются факторы, способные не только восстанавливать митотическую активность поврежденных радиацией клеток, но и снижать в них уровень структурных хромосомных аберраций.
Добавление ростовых факторов — EGF и PDGF в физиологических концентрациях к поврежденным радиацией лимфоцитам способствует снижению в них уровня структурных хромосомных аберраций, а в случае EGF — и восстановлению митотической активности поврежденных клеток.
Научная новизна
1) На примере поврежденных радиацией лимфоцитов впервые продемонстрирована принципиальная возможность иммуностимулирующего действия различных фототерапевтических методов (облучения поверхности тела или крови) за счет повышения пролиферативных потенций лимфоцитов в результате активации процессов репарации ДНК появляющимися в крови растворимыми факторами. 2) Впервые проанализирована возможность быстрого появления подобных факторов при облучении поверхности тела полихроматическим УФ или ВИП светом за счет действия излучения на кровь в поверхностных микрососудах кожи (транскутанно) и трансляции вызванных изменений всему объему циркулирующей крови. 3) В работе впервые исследована частота структурных хромосомных аберраций после фототерапевтической процедуры облучения небольшого участка поверхности тела человека полихроматическим УФ светом в терапевтической дозе ШЭД. Установлено, что облучение не только не приводит к росту числа хромосомных повреждений в лимфоцитах периферической крови, но, напротив, способствует снижению в них уровня наиболее распространенных в норме спонтанных хромосомных аберраций - парных фрагментов. 4) Впервые получены свидетельства о возможности участия ростовых факторов PDGF и EGF в регуляции процессов пострадиационного восстановления лимфоцитов.
Теоретическое и практическое значение работы
Полученные результаты свидетельствуют о том, что одним из механизмов повышения уровня пролиферативных процессов в организме после фототерапевтического воздействия может быть появление в циркуляции факторов, способных стимулировать в аутологичных клетках репарацию ДНК. Прямые доказательства активации процессов
репарации ДНК получены нами для лимфоцитов периферической крови — основных клеток иммунной системы, функциональная активность которых напрямую зависит от способности к пролиферации. Выполняя защитные функции и рециркулируя, эти клетки часто оказываются в условиях неблагоприятного микроокружения, что повышает риск возникновения повреждений в их ДНК (Barnett, Barnett, 1998). Кроме того, «наивные» лимфоциты и долгоживущие «клетки памяти», подолгу пребывающие в состоянии покоя, накапливают повреждения ДНК, что может повлечь за собой снижение скорости репликации ДНК (Beiqing et al., 1992; Barnett, Barnett, 1998; Frasca et al., 1998). Эта ситуация может усугубляться при старении организма, поскольку с возрастом растет частота образования одно- и двунитевых разрывов ДНК в лимфоцитах и снижается эффективность работы ДНК-репаративных систем, что негативно сказывается как на продукции цитокинов, так и на способности клеток отвечать на митогены, делая тем самым иммунный ответ субоптимальным (Lambert et al., 1979; Beiqing et al., 1992; Frasca et al, 1998; McLeod, 2000; Doria, Frasca, 2001; Scarpaci et al., 2003). Эти факты позволяют предполагать, что облучение крови in vivo или in vitro (экстракорпорально) может способствовать восстановлению функциональной активности клеток в условиях, когда эффективность процессов репарации ДНК снижена, например, у пожилых людей или при генотоксическом стрессе, вызванном воздействием радиации.
Апробация работы
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ. Материалы диссертации были доложены на XIII Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 1997), Международных научных конференциях (5ЫЙ Конгресс Азиатско-Тихоокеанской Ассоциации по Лазерной Медицине и Хирургии, Тель Авив, Израиль 1994; 2ой и 3ий Конгресс Всемирной Ассоциации по Лазерной Терапии, Канзас, США, 1998 и Афины, Греция, 2000; 8ой Конгресс Европейского Общества по Фотобиологии, Гранада, Испания, 1999; 16ый Международный Конгресс по Лазерной Медицине, Флоренция, Италия, 2001) и совместных научных семинарах Лаборатории биохимической цитологии и цитохимии и Лаборатории радиационной цитологии ИНЦ РАН.
Структура и объем диссертации
Работа изложена на 141 странице машинописного текста, состоит из введения, четырех глав и выводов; содержит 6 таблиц и 18 Рисунков. Список литературы включает 303 названия, из которых 81 на русском языке.
Участие ростовых факторов в репарации ДНК и апоптозе
Поддержание целостности генома является важнейшей задачей клетки, поскольку повреждение ее ДНК происходит постоянно в результате тепловых флуктуации (спонтанный гидролиз азотистых оснований), действия химических мутагенов и канцерогенов (депуринизация, сшивки ДНК-белок, алкилирование) или радиации (циклобутановые димеры пиримидиновых оснований, изменение азотистых оснований, одно- и двунитевые разрывы ДНК и др.). В то время как большинство из них быстро распознается и удаляется репаративной системой, некоторые остаются незамеченными, накапливаются, особенно в неделящихся клетках, и могут проявляться при транскрипции и служить потенциальным источником возникновения мутаций (Frasca et al., 2000; Takahashi, 2002).
Возникающие в геноме клеток повреждения индуцируют со стороны клетки ответ, включающий три типа реакции: задержку прохождения по циклу, репарацию ДНК или гибель путем апоптоза. Немаловажную роль, определяющую, какая из реакций окажется преобладающей, играет и клеточное окружение, в частности, специфические ростостимулирующие полипептиды, основная функция которых — активировать каскад внутриклеточных реакций, обеспечивающих прохождение клеткой фазы Gi клеточного цикла и определяющих ее способность приступить к репликации ДНК. Учитывая, что пролиферация и репарация ДНК — фундаментальные матричные процессы, тесно взаимосвязанные частичной общностью ферментативного аппарата и ряда генных продуктов, и нарушение одного из процессов влечет за собой ухудшение нормального течения другого, становится очевидным, что агенты, запускающие пролиферацию, могут служить и регуляторами процесса репарации ДНК. В настоящее время доказано, что в регуляции репарации могут принимать участие некоторые ростовые факторы и цитокины. Так, EGF в комбинации с инсулином в значительной степени восстанавливает эффективность репарации однонитевых и двунитевых разрывов ДНК в мышиных клетках линий Swiss ЗТЗ (Бильдин и др., 1990) способствуя при этом нормализации клеточного цикла. Фактор роста кератиноцитов предотвращает образование разрывов ДНК при оксидативном стрессе в клетках А549 и альвеолярных клетках II типа (Wu et al., 1998). Фактор роста гепатоцитов восстанавливает эпителиальные и раковые клеток после воздействия у-радиации или цисплатина (Fan et al., 2000). Вариант провоспалительного цитокина IL-6 — К-7/Д-6, стимулирует репарацию ДНК в поврежденных рентгеновским излучением in vitro мононуклеарах периферической крови (Frasca et al., 2000, 2002). IL-12 вызывает в кератиноцитах значительное снижение УФ-специфичных повреждений ДНК (Schwarz et al., 2002), a IFN-a и Р индуцируют снижение частоты сестринских хроматидных обменов в клетках амниотической жидкости in vitro и в периферических лимфоцитах пациентов, инфицированных гепатитом-В (Wang et al., 1991; Mertens et al., 1993). В ДНК лимфоцитов периферической крови и спленоцитов мышей, обработанных IFN-a, уменьшается количество спонтанно образующихся и радиационно-индуцированных апуринизированных сайтов, а в клетках печени достоверно увеличивается уровень ДНК-репаративного фермента 06-алкилгуанин ДНК алкил-трансферазы (Coccia et al., 1992; Sirota et al., 1996). Однако о механизме, реализующем участие ростовых факторов и цитокинов в регуляции процесса репарации ДНК, пока известно немного.
Обсуждая реакцию клетки на повреждение и вклад репарации ДНК в пролиферативный процесс, нельзя забывать и о третьем варианте развития событий — уходе клетки в апоптоз. Проблема взаимоотношений репарации, как процесса способствующего повышению жизнеспособности клетки, и апоптоза, приводящего к ее гибели, является важной как с практической, так и с теоретической точки зрения. Во-первых, эти два процесса противоположно направлены в отношении повреждений ДНК: в ходе апоптоза ДНК подвергается деградации, а репарация призвана устранять возникающие разрывы. По-видимому, их конкуренция является особенностью проапоптотического состояния клетки (Lyndall, Weinert, 1996; Тронов, 1999). Во-вторых, некоторые «действующие лица» апоптоза являются либо промоторами, либо непосредственными участниками репаративного процесса. Наиболее заметным здесь является белок р53, относящийся к семейству генов-супрессоров опухолевого роста и выполняющий чрезвычайно важные и разнообразные функции при различных стрессовых ситуациях, связанных с возникновением в геноме повреждений. В норме содержание белка р53 в клетке крайне низко, но оно резко увеличивается в ответ на повреждение ДНК, что открывает возможности для выполнения его функций. С одной стороны, известно, что р53 является индуктором апоптоза при повреждении ДНК (через регуляцию транскрипции генов Вах и Bcl-2), а с другой - показано, что р53 участвует в репарации ДНК, причем не только опосредованно, как транскрипционный фактор, влияющий на экспрессию репаративных ферментов. Как оказалось, р53 сам может неспецифически связываться с короткими участками однонитевой ДНК. Это его свойство особенно важно при корректирующей репарации. Так, например, р53 способен выполняя роль сенсора дефекта, маркируя ошибочные пару Об-mG -Т (Об-mG алкилированный моноаддукт, который, не являясь препятствием для полимераз, в то же время не имеет комплементарного ему основания) (Smith et al., 1995; Тронов, 1999). Не исключена, однако, и прямая роль р53 в эксцизии оснований, поскольку у него обнаружена также и 3 — 5 -экзонуклеазная активность. Тетрамер р53 может связывать две независимые однонитевые молекулы, ускоряя их комплементарную реассоциацию и рекомбинацию, т.е. репарацию двунитевых разрывов (Wang, 1993; Тронов 1999).
Кроме того, обладая высокой транскрипционной активностью, р53 усиливает экспрессию многих респонсивных генов. Среди них не только гены, продукты которых имеют прямое отношение к процессу репарации ДНК, как p21(Wafl/Cipl) — ингибитор циклин-зависимых киназ, вызывающий временную остановку продвижения клетки по циклу в точке Gi/S, что дает дополнительное время для репарации; GADD45 — непосредственный участник репарации повреждений ДНК, вызванных ионизирующей радиацией; и PCNA - дополнительный фактор є и б-полимераз, ускоряющий процесс репарации при взаимодействии с GADD45 и р21 (Kastan et al., 1991; Ludes-Meyers et al., 1996; Тронов, 1999), но и, что очень важно, гены, продукция которых связана с пролиферацией, как, например, рецептора для EGF (EGFR) и ростового фактора TGF-a (Ludes-Meyers et al., 1996). Таким образом, создавая условия для эффективной репарации ДНК, р53 способствует одновременному синтезу не только ростового фактора, но и его рецептора (поскольку TGF-a, также как и EGF, является лигандом для EGFR), причем есть свидетельства положительной дозозависимой регуляции белком р53 промотора EGFR (Ludes-Meyers et al., 1996). Этот факт позволяет предположить, что запускаемые в результате взаимодействия лиганда с рецептором внутриклеточные сигнальные пути могут быть важны для поврежденной клетки и, возможно, будут способствовать повышению скорости или эффективности репаративного процесса в том числе.
Оценка митотической активности и уровня структурных нарушений хромосом
Лимфоциты культивировали, как указано в 2.2, с добавлением ФГА-Р (Sigma, 5 мкг/мл; или Difco, 1.85 мкл/мл) в течение 52 ч при 37С. За 2 ч до конца культивирования в среду вносили колхицин (Fluka, Germany, 60 нг/мл). Клеточную суспензию, полученную центрифугированием (5 мин, 1500 об/мин), ресуспендировали в 0.75 М растворе КС1 (37С) и инкубировали 18 мин при 37С. Гипотонизацию останавливали внесением 150 мкл смеси метанол-уксусной кислоты (3:1) комнатной температуры. Полученную центрифугированием (5 мин, 1500 об/мин) ядерную суспензию фиксировали в трех сменах холодной смеси метанол-уксусной кислоты (3:1) и переносили на смоченные водой охлажденные стекла. Препараты окрашивали красителем Гимза и анализировали в световом микроскопе. На каждом препарате подсчитывали митотический индекс (МИ) -количество метафаз на 1000 ядер, что служило показателем ответа лимфоцитов на митоген, а также долю клеток со структурными хромосомными аберрациями (в %) и частоту хроматидных разрывов, необходимых для образования наблюдаемых аберраций (на 100 проанализированных метафаз) - как показатель повреждения хромосом (Захаров и др., 1982). Анализировались клетки с числом хромосом не менее 46, регистрировались хроматидный и хромосомный типы аберраций. Парные и одиночные фрагменты учитывались как один разрыв; внутрихромосомные (внутри- и межплечевые) обмены, как и межхромосомные обмены, реципрокные транслокации, кольцевые и ацентрические хромосомы, а также дицентрики учитывались как два разрыва; при участии в обмене трех и более хромосом учитывалось число разрывов необходимых для образования данной перестройки (Захаров и др., 1982).
Лимфоциты (интактные или УФС-поврежденные) культивировали без ФГА, как указано в п.2.2, с добавлением ЗН-тимидина (10 мкК/мл, удельная активность 20 К/мМ, "Изотоп") в течение 2 ч при 37С. Клеточную суспензию, полученную центрифугированием (5 мин, 1500 об/мин), дважды отмывали средой RPMI-1640, ресуспендировали в подогретом до 37С 0.75 М растворе КС1 и инкубировали 18 мин при 37С. Гипотонизацию останавливали внесением 150 мкл смеси метанол-уксусной кислоты (3:1) комнатной температуры. Полученную центрифугированием (5 мин, 1500 об/мин) ядерную суспензию фиксировали в трех сменах холодной смеси метанол-уксусной кислоты (3:1) и переносили на смоченные водой охлажденные стекла. После сушки при комнатной температуре стекла покрывали фотографической эмульсией (Эмульсия М, Институт "Химфотопроект" или "Фотон", Россия) и экспонировали 35 дней при 4С. После проявления и фиксации препараты окрашивали раствором гематоксилина. Для каждого экспериментального варианта анализировали не менее 600 ядер. Чтобы оценить число клеток, ведущих репаративный синтез ДНК, подсчитывали число ядер, содержащих от 5 до 30 гранул серебра (5 гранул было принято за фоновый показатель). Учитывали также число клеток с количеством гранул серебра от 30 до 60, как показатель, который может свидетельствовать об интенсивной репарации ДНК. Чтобы оценить эффективность репаративного процесса, учитывали число гранул серебра (до 30) на 100 ядер.
Количества апоптотических лимфоцитов оценивалось методом TUNEL (TdT-mediated dUTP nick end labeling), позволяющим с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы выявить свободные З -ОН концы ДНК, образующиеся в большом количестве при разрезании ее эндонуклеазами в ходе апоптоза (Gorczyca et al., 1993). Из культур, приготовленных как указано в п. 2.2, через 24 ч и 48 ч культивирования выделяли лимфоциты на Ficoll Histopak (Sigma) и отмывали физиологическим раствором (PBS). Суспензию лимфоцитов (1x106 клеток) фиксировали, добавляя 100 мкл раствора формальдегида (4% на PBS, рН = 7.4), и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. После отмывки PBS (1500 об/мин, 10 мин) клетки ресуспендировали в растворе 0.1 % Triton Х-100 (на 0.1% цитрате натрия) 2 мин на льду и снова отмывали PBS. Осадок ресуспендировали в 50 мкл смеси TdT и модифицированных нуклеотидов dUTP, или только модифицированных нуклеотидов в качестве негативного контроля (In Situ Cell Detection Kit, Fluorescein; Boehringer Mannheim, UK) и инкубировали в течение 30 мин при 37С в темноте, после чего снова отмывали и ресуспендировали в PBS (200-300 мкл). FACS анализ производили на проточном цитофлюориметре (Becton Dickinson, СА).
Для оценки количества лимфоцитов с проапоптотическими маркерами (CD 95+ и CD 95L+ клетки) использовался стандартный лимфоцитотоксический тест (Тотолян и др., 1999). Из культур, приготовленных, как указано в п.2.2, через 0, 2, 24 ч и 48 ч культивирования выделяли лимфоциты на Ficoll Histopak (Sigma) и отмывали PBS. После этого по 1 мкл клеточной суспензии, содержащий от 1000 - 2000 клеток, вносили в лунки микроплаты, заполненные минеральным маслом, под которое уже были внесены либо моноклональные антитела к CD95 или CD95L по 1 мкл (0.02 мкгр, Caltag Laboratories, СА), либо 1 мкл антилимфоцитарного глобулина (Імкгр, МедБиоСпектр, Москва) или 1 мкл фетальной сыворотки (Sigma) в качестве позитивного и негативного контроля, соответственно. После 30 мин инкубации при 25С под масло вносили по 4 мкл лиофилизированного кроличьего комплемента (рН 7.4) и продолжали инкубацию в течение 1 ч при той же температуре. Затем добавляли по 2 мкл водного раствора эозина (5%) и через 5-Ю мин клетки фиксировали раствором формалина (17%). Реакция оценивалась в световом микроскопе. Подсчитывали не менее 300 прореагировавших (токсированных) и живых клеток. Результаты представлялись в процентах, вычислявшихся по следующей формуле
Репаративный синтез ДНК в нестимулированных митогеном лимфоцитах, поврежденных УФС излучением
Чтобы проверить, не связано ли восстановление пролиферативной активности радиационно-поврежденных клеток и снижение в них частоты хромосомных нарушений с активацией процессов репарации ДНК растворимыми факторами, появляющимися в крови УФ-облученных добровольцев, методом авторадиографии было протестировано влияние плазмы крови 7 добровольцев на уровень репаративного синтеза в нестимулированных митогеном лимфоцитах, поврежденных in vitro УФС радиацией.
Кроме того, учитывая, что средневолновое, и особенно длинноволновое УФ (УФВ и УФА) излучения, проникая в кожу человека, достигают густой сети поверхностных микрососудов и могут непосредственно действовать на кровь, циркулирующую здесь с относительно малой скоростью (Parrish et al., 1978, Giese, 1978), представляло интерес выяснить, в какой степени выявленные после фототерапевтической процедуры быстрые изменения свойств крови могут быть следствием прямого (транскутанного) воздействия полихроматического УФ света на кровь in vivo.
С этой целью, моделируя события в условиях in vivo, когда небольшое количество транскутанно фотомодифицированной крови смешивается в сосудистом русле с ее основным циркулирующим объемом, облученную in vitro полихроматическим УФ светом кровь смешивали с интактной аутологичной кровью в объемном соотношении 1:10, и затем тестировали свойства плазмы, выделенной из такой смеси, добавляя ее в среду культивирования интактных и поврежденных лимфоцитов.
При анализе авторадиографических препаратов, помимо двух стандартных показателей, характеризующих уровень репаративного синтеза ДНК - доли клеток с количеством гранул серебра от 5 до 30 и числа гранул на 100 таких клеток - учитывалась также доля клеток с количеством гранул от 30 до 60. Эту популяцию также относили к числу клеток, ведущих репаративный синтез ДНК, т.к. для репликативного (планового) синтеза такое количество гранул слишком малд.
В контрольном варианте, где интактные лимфоциты культивировались с плазмой аутологичной интактной крови, всего у 0.12+0.06% клеток регистрировался репаративный/внеплановый синтез ДНК, а количество гранул серебра на 100 клеток составляло в среднем 61.25+4.43 (рис. 8). Культивирование с плазмой УФ-модифицированной как in vivo (транскутанно), так и in vitro крови, не приводило к изменению этих показателей. Доля лимфоцитов, ведущих внеплановый синтез ДНК, составляла 0.29±0.07% в первом случае и 0.24+0.11% - во втором, при плотности метки 66.5314.75 и 64.87±7.32 гранул серебра на 100 клеток, соответственно (рис. 8)
Чтобы вызвать повреждения ДНК и активировать эксцизионную репарацию, лимфоциты в составе цельной крови облучали in vitro сублетальной дозой УФС радиации (150 Дж/м2). Как видно на рис. 8, при культивировании УФС-поврежденных лимфоцитов с плазмой интактной крови значительно увеличивалась доля клеток, включавших от 5 до 30 гранул серебра (7.78±1.01%, рО.01), росло количество гранул в клетках (175.74±22.83 на 100 клеток, рО.01) и регистрировалась популяция лимфоцитов, в которых насчитывалось от 30 до 60 гранул серебра (0.96±0.24%). Оба варианта фотомодифицированной плазмы, как полученной из крови УФ-облученных добровольцев, так и выделенной из смеси in vitro УФ-облученной и интактной крови, вызывали значительное усиление репаративного синтеза ДНК в УФС-поврежденных клетках (рис.8). Действительно, при культивировании с плазмой крови УФ-облученных добровольцев доля клеток с числом гранул серебра от 5 до 30 увеличивалась до 10.18±0.99% (р 0.05, т.е. на 31%), а число гранул в них - в среднем до 217.20117.17 на 100 клеток (р 0.05, т.е. на 24%). Одновременно возрастало количество клеток, включивших от 30 до 60 гранул серебра, в среднем до 1.7510.21% (р 0.05, т.е. на 113%). Эффект плазмы крови, полученной после фототерапевтической процедуры добровольцев, был наиболее выраженным у тех лиц, в клетках которых уровень тестируемых показателей индуцированного репаративного синтеза был исходно низким (т.е. при культивировании УФС-поврежденных клеток с плазмой интактной крови). Эту закономерность подтверждают достоверные отрицательные значения коэффициентов корреляции эффекта по критериям количества клеток с числом гранул от 5 до 30 и плотности распределения метки: г = -0.79 При культивировании поврежденных клеток с плазмой, выделенной из смеси УФ-облученной in vitro и интактной крови, наблюдались сходные изменения параметров репаративного синтеза ДНК (рис. 8): доля клеток, включивших от 5 до 30 гранул серебра, увеличивалась в среднем на 33%, достигая 10.35±0.52% (р 0.01), а плотность распределения метки - на 29%, составив 226.53±5.91 гранул серебра на 100 клеток (р=0.06). Количество клеток с числом гранул от 30 до 60 в данном случае также имело тенденцию к росту, практически в 2 раза - до 1.97±0.47% (р=0.06, рис. 8), а эффект плазмы, как и в случае воздействия на кровь in vivo, определялся исходным уровнем данного показателя у УФС-поврежденных клеток: г= -0.93 (р 0.01) и г= -0.92 (р 0001), соответственно. В целом, характер и степень влияния на интенсивность репаративного синтеза плазмы крови, модифицированной УФ светом in vitro и in vivo, судя по числу гранул серебра на 100 клеток, были сходными, что подтверждается положительной корреляцией их эффектов (г= 0.81, р 0.05).
Из полученных данных следует, что уже через 30 мин после облучения добровольцев полихроматическим УФ светом в терапевтической дозе в их крови появляются растворимые факторы, способные стимулировать репаративный синтез ДНК в поврежденных УФС радиацией аутологичных лимфоцитах. По всей вероятности, развитие этого эффекта связано с действием света на небольшой объем крови в поверхностных микрососудах кожи и влиянием такой крови на остальной циркулирующий объем. Это заключение базируется на большом сходстве степени и характера активации репаративного синтеза ДНК в УФС-поврежденных лимфоцитах факторами плазмы, выделенной из крови УФ-облученных добровольцев и из смеси УФ-облученной in vitro крови с 10-кратным объемом интактной аутологичной крови - варианта опыта, в котором в условиях in vitro моделировалось смешивание в сосудистом русле небольшого количества транскутанно фотомодифицированной крови со значительно большим объемом циркулирующей крови. Сходство эффектов подтверждается не только высокой степенью их корреляции, но и одинаковой в обоих случаях обратной зависимостью степени активации репаративного синтеза от его исходного уровня: независимо от того, действует ли свет in vivo или in vitro, изолированная плазма стимулирует репаративный синтез ДНК в поврежденных клетках тем значительнее, чем ниже его показатели при культивировании поврежденных лимфоцитов с плазмой крови, полученной до облучения добровольцев.
ФГА-индуцированная пролиферация и структурное состояние хромосом лимфоцитов крови, облученной монохроматичным видимым светом He-Ne лазера...
Принимая во внимание, что одним из наиболее эффективных современных методов фототерапии является облучение крови видимым лазерным светом (внутривенно или экстракорпорально), представляло интерес выяснить, способно ли лазерное излучение влиять на структурно-функциональное состояние клеток и свойства плазмы крови. С этой целью в серии из 17 экспериментов донорскую кровь облучали с помощью He-Ne лазера (X = 632.8 нм) для внутривенного облучения крови в модельных условиях - прокачивая кровь через пластмассовый шланг системы для забора крови со вставленным через иглу световодом. Мощность светового потока соответствовала терапевтическому диапазону (3 мВт), а скорость протекания крови составляла в среднем 10 мл/мин.
Учитывая имеющиеся в литературе данные о возможности повреждения клеток видимым лазерным светом (Ocana et al., 1997), следовало выяснить, не приводит ли облучение крови He-Ne лазером к изменению частоты хромосомных нарушений в лимфоцитах и способности клеток отвечать на пролиферативный стимул. Судя по величине МИ, исходно - в контрольном варианте, где лимфоциты интактной крови культивировались с плазмой этой же крови, ФГА-индуцированная пролиферативная активность клеток варьировала от 8%о до 27%о и составила в среднем 16.53±1.33%о. Когда при постановке культуры интактных лимфоцитов в питательную среду вместо интактной плазмы вносили плазму облученной лазером аутологичной крови, МИ, варьируя от 7%о до 27%о, составлял в среднем 15.29±1.25%о и не отличался от исходного показателя (рис. 15).
Облучение крови лазером также не приводило к изменению пролиферативной активности лимфоцитов (рис. 15): при культивировании клеток с плазмой интактной крови разброс МИ находился в рамках контроля (от 9%о до 27%о), составляя в среднем 17.71±1.24%о, а при культивировании с плазмой лазером облученной аутологичной крови показатель пролиферативной активности таких лимфоцитов, варьируя от 8%о до 25%о, в среднем составлял 16.00±1.11%о. Тем не менее, функциональное состояние лимфоцитов модифицировалось — характер влияния света на митоген-индуцированную пролиферацию лимфоцитов определялся ее исходным уровнем (г= -0.69, р 0.01), и плазма облученной крови не меняла характера этой зависимости, хотя и несколько ослабляла ее (г= -0.59, р 0.05, соответственно). Как видно на рис. 16, где результаты разделены медианным методом по исходному уровню МИ, при низкой пролиферативной активности интактных лимфоцитов под влиянием света наблюдался ее рост, а при сравнительно высокой - подавление.
Исследуя параллельно с МИ характер и частоту хромосомных нарушений в лимфоцитах этой же крови, установили, что в контрольном варианте, где интактные лимфоциты культивировались с интактной аутологичной плазмой, от 1% до 3% клеток, в среднем - 2.14±0.14%, имели хромосомные аберрации - одиночные и парные фрагменты (Табл. 5), а частота хроматидных разрывов на 100 клеток варьировала от 1 до 3, составив в среднем - 2.14±0.14. При культивировании интактных лимфоцитов с плазмой облученной лазером аутологичной крови, при разбросе данных от 2 до 5 на 100 клеток, доля клеток с хромосомными аберрациями (3.00±0.55%), типы аберраций и частота хроматидных разрывов (3.00+0.55) не отличались от контрольного варианта (рис. 15, Табл. 5). Облучение крови лазером приводило к росту уровня хромосомных нарушений в лимфоцитах: помимо спонтанных аберраций (одиночных и парных фрагментов), появлялись кольцевые и ацентрические хромосомы (рис. 15, Табл. 5). Доля клеток с хромосомными аберрациями и частота хроматидных разрывов в клетках увеличивались (по сравнению с контролем), причем, при культивировании с плазмой как интактной (р 0.05), так и лазером облученной аутологичной крови: в первом случае оба показателя варьировали одинаково - от 2 до 6 на 100 клеток, составив в среднем 3.86±0.42 и 4.00±0.45, соответственно, а во втором - при разбросе данных от 2 до 7 на 100 клеток, доля клеток с аберрациями в среднем составляла 4.63±0.60%, а частота хроматидных разрывов в среднем достигала 4.75+0.64.
При сопоставлении уровня хромосомных повреждений в лимфоцитах облученной лазером крови и их пролиферативной активности, выявлялась обратная зависимость изменений данных показателей (г= -0.71, р 0.05), причем, как хорошо видно на рис. 16, ростостимулирующий эффект света реализовался в присутствии плазмы облученной крови (24%) в том случае, если уровень хромосомных нарушений в них не отличался от контрольного.
Таким образом, из полученных данных следует, что облучение крови in vitro красным светом He-Ne лазера (3 мВт на конце световода) в условиях, моделирующих ее внутривенное облучение, приводит к увеличению доли клеток, имеющих структурные повреждения хромосом, и к повышению частоты образования таких нарушений в клетках. Кроме того, свет модулирует пролиферативную активность лимфоцитов, стимулируя ее при исходно низких показателях Чтобы изучить влияние плазмы лазером облученной крови на структурно-функциональное состояние аутологичных клеток со сниженной митотической активностью, в данной серии из 11 экспериментов оценивали уровень ответа на митоген и частоту структурных нарушений хромосом у поврежденных рентгеновским излучением (0.5 Гр) лимфоцитов. Исходно — в контрольном варианте, где лимфоциты интактной крови культивировались с плазмой этой же интактной крови, ФГА-индуцированная пролиферативная активность клеток варьировала более чем в 6 раз (от 1%о до 43%о) и в среднем составила 20.73+3.00%о.
Как видно на рис. 17, рентгеновское излучение подавляло пролиферативную активность лимфоцитов, культивировавшихся с интактной плазмой, в среднем до 81% от контрольного уровня (р 0.01): МИ варьировал от 5%о до 30%о, составляя в среднем 16.14±1.98%о. Культивирование поврежденных рентгеновским излучением лимфоцитов с плазмой лазером облученной in vitro крови приводило к ослаблению антимитотического эффекта рентгеновского излучения: варьируя от 9%о до 33%о, МИ приближался к исходному уровню и уже не отличался от него (р 0.05), составляя в среднем 18.36±2.65%о, однако достоверные отличия от варианта культивирования с плазмой интактной крови не выявлялись (рис. 17). Аналогичные, но более выраженные, изменения регистрировались и при культивировании поврежденных рентгеновским излучением лимфоцитов с плазмой, выделенной из смеси лазером облученной крови с 10-кратным объемом интактной аутологичной крови - пролиферативная активность клеток увеличивалась на 32% (р 0.05): варьируя от 9%о до 34%о, МИ в среднем составлял 20.59+2.12%о и не отличался от исходного показателя. При этом эффекты плазмы, выделенной из облученной in vitro крови и из ее смеси с интактной кровью, были сходны, что подтверждается их достоверной корреляцией: г= 0.67 (р 0.05). В то же время, плазма, выделенная из смеси интактной и облученной лазером крови, в большей степени стимулировала рост сниженной радиацией пролиферативной активности: г= -0.74 (р 0.01) против г= -0.32 (р 0.05) для плазмы неразведенной лазером облученной крови.
