Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Ионный гомеостаз и ионный гетерогенитет эукариотической клетки 10
1.2. Системы активного ионного транспорта, сопряженного с гидролизом АТФ 11
1.3. Системы вторичного активного транспорта 12
1.4. Na+,K+ -АТФазная транспортная система 13
1.4.1. Структура натриевого насоса 13
1.4.2. Принципы функционирования Na+,K+-АТФазы и ее роль в клетке 16
1.5. Регуляция активности Na+,K+-АТФазы 18
1.5.1. Механизмы кратковременной регуляции 19
1.5.2. Механизмы долговременной регуляции 28
1.6. Изменение транспорта ионов и их роль в запуске пролиферативного ответа лимфоцитов человека. Значение Na+,K+- АТФазы в процессах пролиферации и трансдукции сигнала в клетках разного типа 32
1.7. Особенности пролиферативного ответа нормальных лимфоцитов человека 43
1.7.1. Активация Т-клеточного рецептора 44
1.7.2. Активация рецептора ИЛ-2 и запуск Jak/STAT- сигнального пути 47
Глава 2. Материалы и методы исследования 53
2.1. Выделение и культивирование лимфоцитов периферической крови человека 53
2.2. Схемы активации лимфоцитов 53
2.3. Обработка клеток ингибиторами 54
2.4. Культивирование клеток постоянных клеточных линий 54
2.5. Получение тотальных клеточных лизатов и лизатов мембранных фракций 55
2.6. Антитела
2.7. Электрофорез и иммуноблотинг 57
2.8. Измерение входных потоков рубидия 58
2.9. Оценка пролиферативного ответа лимфоцитов 59
2.10. Оценка экспрессии высокоаффинного рецептора ИЛ-2...59
Глава 3. Результаты исследования 60
3.1. Изменение входных потоков рубидия при переходе нормальных лимфоцитов периферической крови человека, стимулированных митогенами, из состояния покоя к пролиферации.61
3.2. Внутриклеточное содержание натрия и уровень входных потоков рубидия в активированных лимфоцитах 62
3.3. Динамика экспрессии а 1-субъединицы Ка+,К+-АТФазы по ходу пролиферативного ответа ФГА-стимулированных лимфоцитов 64
3.4. Динамика экспрессии а 1-субъединицы №+,К+-АТФазы по ходу пролиферативного ответа лимфоцитов, стимулированных форболовым эфиром и иономицином 69
3.5. Влияние ингибиторов транскрипции и трансляции на экспрессию Na+,K+-ATOa3bi 72
3.6. Экспрессия а 1-субъединицы Na+,K+-ATOa3bi в активированных лимфоцитах является циклоспорин А - зависимым процессом 74
3.7. Экспрессия а 1-субъединицы Na ,К -АТФазы лимфоцитов при стимуляции экзогенным ИЛ-2 77
3.8. В долговременной регуляции экспрессии и функциональной активности Na+,K+-АТФазы участвуют JAK/STAT и МАР-киназные пути 82
Глава 4. Обсуждение результатов 93
Глав а 5. Выводы 106
- Изменение транспорта ионов и их роль в запуске пролиферативного ответа лимфоцитов человека. Значение Na+,K+- АТФазы в процессах пролиферации и трансдукции сигнала в клетках разного типа
- Получение тотальных клеточных лизатов и лизатов мембранных фракций
- Внутриклеточное содержание натрия и уровень входных потоков рубидия в активированных лимфоцитах
- Экспрессия а 1-субъединицы Na+,K+-ATOa3bi в активированных лимфоцитах является циклоспорин А - зависимым процессом
Введение к работе
Среди ионных транспортеров плазматической мембраны первостепенная роль в поддержании внутриклеточного ионного гомеостаза и осмотического баланса клеток животных отводится натриевому насосу. Na+,K -АТФаза, составляющая основу натриевого насоса, является встроенным в цитоплазматическую мембрану ферментом, который осуществляет гидролиз АТФ и сопряженный с ним перенос ионов натрия и калия через мембрану против электрохимического градиента (Glynn, Karlish, 1975; Beguin et al., 1998; Schiener-Bobis, 2002; Jorgensen et al, 2003). В последнее десятилетие основное внимание исследователей сосредоточено не на структурных и кинетических параметрах Na+,K+-ATOa3bi, а на ее роли в ответе клетки на различные физиологические стимулы и ростовые факторы. №+,К+-АТФазу рассматривают не только как основной компонент натриевого насоса, регулирующего внутриклеточную концентрацию натрия и калия, но и как сигнальную молекулу или рецептор эндогенных уабаин-подобных гликозидов (Xie, Askari, 2002).
Являясь компонентом системы жизнеобеспечения клетки, натриевый насос находится под контролем регуляторных механизмов разного типа, которые обеспечивают как быстрое, так и долговременное изменение интенсивности ионных потоков через плазматическую мембрану (Clausen, 1996; Clausen, 1998; Therien, Blostein, 2000; Dunbar, Kaplan, 2001; Лопина 2001). Можно считать установленным, что индуцированное активацией рецепторов ростовых факторов и гормонов быстрое изменение функциональной активности натриевого насоса, связано с изменением кинетических параметров присутствующих в плазматической мембране транспортных единиц, а также с рекрутированием в мембрану новых транспортных комплексов из неактивного внутриклеточного пула (Clausen, 1998; Therien, Blostein, 2000). В последнее время особое внимание исследователей привлекают более поздние, длящиеся во времени изменения в работе ионных транспортеров и ионных каналов, непосредственно связанные с клеточным циклом. Сравнительно недавно на Т-лимфоцитах человека было обнаружено зависимое от пролиферации возрастание численности CRAC-каналов и кальций-зависимых калиевых каналов (Chanshani, 2000, Fomina, 2000). Отмечено, что повышенная функциональная экспрессия этих каналов важна для поддержания пролиферативного статуса лимфоцитов. Именно лимфоциты периферической крови человека благодаря своей способности под действием митогенов выходить из состояния покоя Go, и начинать клеточный цикл являются удобным объектом для проведения исследований, посвященных событиям, сопровождающим прогрессию клетки в цикле. На лимфоцитах человека получены данные о динамике уабаин-чувствительных потоков во время прогрессии Go Gi S и установлена связь между повышением активности натриевого насоса, бласттрансформацией и синтезом ДНК (Веренинов и др., 1991; Marakhova et al, 1998). Ключевую роль в пролиферативном ответе лимфоцитов играет синтез Т-клеточного ростового фактора интерлейкина-2 (ИЛ-2), сборка на мембране высокоаффинного рецептора ИЛ-2 и активация ассоциированных с ним сигнальных молекул, в том числе нерецепторной тирозинкиназы JAK3 и адаптерного белка ras/MAP-киназного пути She (Berridge, 1997; Lin, Leonard, 1997; Wang et al., 1999; Lin, Leonard, 2000).
Природа связанных с клеточным циклом изменений транспортной активности натриевого насоса не изучена. Усиление входных потоков калия в переходный период из состояния покоя к пролиферации возможно за счет увеличения числа работающих ионных помп в поверхностной мембране активированной клетки. Не известно, может ли нарастание численности мембранных ион-транспортирующих комплексов быть следствием рекрутирования готовых №+,К+-АТФазных комплексов в мембрану из внутриклеточных компартментов, или это нарастание контролируется на уровне транскрипции и синтеза белковых субъединиц, входящих в состав натриевого насоса. Для понимания роли ионных изменений, обусловленных работой натриевого насоса по ходу клеточного цикла, представляется важным выяснить природу механизмов, которые контролируют уровень потоков через плазматическую мембрану, и исследовать возможность участия сигнальных путей, инициируемых при активации рецепторов ростовых факторов и цитокинов, в регуляции систем ионного транспорта.
Цель и задачи исследования.
Целью данной работы являлось изучение механизмов, обеспечивающих долговременное изменение транспортной активности натриевого насоса при развертывании пролиферативного ответа лимфоцитов периферической крови человека. В задачи исследования входило изучение динамики ионных потоков, контролируемых натриевым насосом, при переходе лимфоцитов из состояния покоя к пролиферации; исследование экспрессии каталитической а 1-субъединицы Na+,K+-ATOa3bi по ходу запуска пролиферативного ответа нормальных лимфоцитов человека; выявление связи между бласттрансформацией нормальных лимфоцитов и синтезом новых транспортных единиц натриевого насоса; установление возможной взаимосвязи экспрессии Na+,K+-
АТФазы с ИЛ-2-зависимой стадией пролиферации нормальных лимфоцитов человека; выявление сигнальных путей, контролирующих экспрессию Ма+,К+-АТФазы при запуске клеточной пролиферации и связанное с этим исследование статуса фосфорилирования транскрипционных факторов STAT3 и STAT5 и протеинкиназ ERK1/2 в активированных лимфоцитах человека.
Изменение транспорта ионов и их роль в запуске пролиферативного ответа лимфоцитов человека. Значение Na+,K+- АТФазы в процессах пролиферации и трансдукции сигнала в клетках разного типа
Таким образом, даже небольшие изменения внутриклеточной концентрации Na+, обусловленные активацией других транспортеров или каналов, оказывают значительное действие на активность натриевого насоса (Soltoff, Mandel, 1984а; Therien, Blostein, 2000).
Изменение внутриклеточной концентрации Na+ может являться компонентом более сложных регуляторных механизмов. Например, повышение уровня Na+ в клетке служит сигналом для рекрутирования Ыа+,К+-АТФазных комплексов в мембрану под действием альдостерона (Blot-Chabaud et al., 1990).
Молекула Ыа+,К+-АТФазы характеризуется высокой аффинностью для К+. В нормальных физиологических условиях, когда концентрация К+ во внешней среде стабильна, внеклеточные ионы К фактически не оказывают регулирующего действия на активность Ма+,К+-АТФазы (Garay, Garrahan, 1973). В то же время, экспериментальное помещение клеток в среду, обедненную калием, приводит вначале к увеличению внутриклеточной концентрации Na+ и повышению функциональной активности натриевого насоса, а затем -к увеличению числа уабаин-связывающих единиц в мембране (Kennedy et al., 1990). Природа этого долговременного эффекта не ясна. Подобный результат наблюдался на клетках разных постоянных линий in vitro, а также на эритроцитах морской свинки in vivo. Однако, в других случаях in vivo ( в клетках скелетной мускулатуры человека, крысы и морской свинки) гипокалиемия снижала или не влияла (в кардиомиоцитах морской свинки) на активность и число натриевых насосов (Clausen, Kjeldsen, 1987; Kennedy et al., 1990; Dorup et al., 1993; Clausen, 1998). Оказалось, что в этих случаях вызванное гипокалиемией снижение содержания Ма+,К+-АТФазных единиц в плазматической мембране клеток при гипокалиемии обеспечивается механизмами долговременной регуляции (Clausen, Kjeldsen, 1987).
Концентрация АТФ в большинстве клеток является для Na+,K+-АТФазы насыщающей. Однако в некоторых тканях и при определенных условиях концентрация АТФ оказывается пониженной (например, в медуллярных почечных клетках) (Soltoff, Mandel, 19846). В таких клетках, изменения в концентрации АТФ, или в аффинности фермента к АТФ, могут оказывать регуляторное действие на Na+,K+-АТФазу.
Регулирующее действие на активность Ма+,К+-АТФазы могут оказывать компоненты, ассоциированные с мембранами, компоненты цитоскелета и у-субъединица. Липиды, формирующие бислой, обеспечивают оптимальные для функционирования Na+,K+-АТФазы толщину и текучесть плазматической мембраны (Johannsson et al., 1981; Marcus et al., 1986), в том числе отрицательно заряженные фосфатидилсерин, фосфатидилглицерин (Kimelberg, Papahadjopoulos, 1972) и холестерин (Giraud et al., 1981). Свободные жирные кислоты, являющиеся продуктами действия фосфолипазы А, ведут к ингибированию На+,К+-АТФазы (Karly et al., 1979; Satoh et al., 1993a; Satoh et al., 1993b; Nowicki et al., 1997).
Компонентами цитоскелета, способными прямо или опосредованно взаимодействовать с натриевым насосом, являются анкирин (Nelson, Veshnock, 1987), пазин (Kraemer et al., 1990), актин (Koob et al., 1990), спектрин или фодрин (Kashgarian et al., 1988) и аддуцин (Tripodi et al.,1996). Взаимодействие Na+,K+-АТФазы с белками цитоскелета и у-субъединицей обеспечивает корректный процессинг, сортировку и локализацию натриевых насосов в соответствующих мембранных компартментах (Devarajan et al., 1997; Dunbar, Kaplan, 2001). Анкирин играет роль связующего звена между интегральными белками клеточных мембран и элементами примембранного цитоскелета (спектриновыми или фодриновыми фибриллами). Как правило, анкирин опосредует связь между Na+,K+-АТФазой и белками цитоскелета (Лопина, 2001). Na+,K+-АТФаза несет 2 сайта связывания анкирина на а-субъединице (Devarajan et al., 1994). Анкирин связывается с ферментом в соотношении 1:4, и, таким образом, участвует в олигомеризации протомеров (Лопина, 2001). Кроме того, спектрин-анкириновый комплекс участвует в транспорте субъединиц Ыа+,К+-АТФазы из эндоплазматического ретикулума (ЭПР) в комплекс Гольджи (Devarajan et al., 1997). Роль цитоскелетных белков в регуляции активности Ма+,К+-АТФазной помпы пока остается на уровне предположения, однако есть сведения о способности мономерного (но не полимеризованного) актина стимулировать работу натриевого насоса с участием механизма, опосредованного активацией протеинкиназы А (РКА) (Cantiello et al., 1997). Совсем недавно на кардиомиоцитах показано, что мембранный белок кавеолин-1, а также холестерин ответственны за локализацию молекул Ыа+,К+-АТФазы в комплексе с Src-киназой в липидных рафтах плазматической мембраны кардиомиоцитов (Xie, 2003, Wang et al., 2004). Такая «ко-локализация» необходима для сигнальной функции Ма+,К+-АТФазы, которая рассмотрена ниже. Как уже было отмечено выше, исследователям еще предстоит выяснить точное функциональное значение у-субъединицы.
Особую группу регуляторов формируют эндогенные ингибиторы, к которым относятся дигиталисоподобные факторы (родственные сердечным гликозидам дигоксину и уабаину). Применение экстрактов наперстянки (в которых дигиталисоподобные сердечные гликозиды строфантин, уабаин, дигоксин являются основным действующим веществом) для лечения сердечной недостаточности впервые описано более двухсот лет назад (Blaustein, 1996). Значительный клинический и экспериментальный материал свидетельствует о том, что дигиталисоподобные факторы, способные ингибировать Na+,K+-ATOa3y, содержатся в различных тканях млекопитающих. В настоящее время установлено, что эндогенные ингибиторы являются избирательными лигандами к двум специфическим местам связывания на а-субъединице Na+,K+-АТФазы, которую рассматривают в качестве своеобразного рецептора, специфичного для дигиталисоподобных факторов (Маслова и др., 1991; Anner et al., 1994; Hamlyn et al., 1996; Doris, Bagrov, 1998). Известно, что частичное ингибирование сердечными гликозидами натриевого насоса в кардиомиоцитах вызывает повышение внутриклеточной концентрации Na+, и, как следствие, снижение выходного потока Са2+ (или даже его закачку) через Na ,Са -обменник (Clausen, 1998).
Получение тотальных клеточных лизатов и лизатов мембранных фракций
На основе большого экспериментального материала, накопленного, в основном, в 80-е годы XX века, сформулировано положение, что изменение ионного состава внутриклеточной среды играет существенную роль в регуляции размножения и трансформации клеток (см. обзоры: Kaplan, Owens, 1978; Moolenaar et al., 1981; Rozengurt, 1981; Rosoff, Cantley, 1985; Веренинов, Марахова, 1986; Grinstein, Dixon, 1989). На культурах клеток разного типа было показано, что действие ростовых факторов сопровождается активацией основных ион-транспортирующих систем плазматической мембраны и изменения внутриклеточной концентрации ионов кальция, натрия и рН цитозоля являются обязательными компонентами раннего ответа клеток на митогенный сигнал. Также известно, что выключение отдельных систем ионного транспорта специфическими ингибиторами обратимо останавливает запуск пролиферативного ответа (Dornand et al., 1986; Szamel, Resch, 1981; Orlovetal., 2001).
Исследование индуцированного пролиферативного ответа проводится, главным образом, на трансформированных клетках постоянных линий. Однако, культивируемые клетки не нуждаются в добавлении ростовых факторов для запуска процессов размножения, поскольку сами способны их продуцировать. Кроме того, для изучения клеточного цикла, культуры клеток необходимо синхронизировать, что достигается удалением из среды необходимых для роста компонентов (аминокислотный блок) или добавлением некоторых химических веществ (тимидина или оксимочевины). Однако, в случае инициации клеточного цикла у клеток, синхронизированных добавлением химических агентов, удалением из среды изолейцина, или Са , входные потоки К , как правило, не изменяются. Возможно, что такие клетки уже до остановки миновали стадию, зависимую от ионных изменений (Веренинов, Марахова, 1986). В связи с этим, лимфоциты периферической крови человека являются наиболее адекватной модельной системой для изучения процессов, связанных с запуском пролиферации: свежевыделенные лимфоциты здоровых доноров находятся в состоянии покоя Go, а добавление к таким клеткам митогенов индуцирует переход в фазу Gi и запускает клеточный цикл. Большое количество работ, посвященных изучению событий по ходу клеточного цикла, проведено именно на лимфоцитах периферической крови человека.
Еще в 70-80 годы было показано, что митогенные лектины (конканавалин А, фитогемагглютинин - ФГА) повышают проницаемость плазматической мембраны лимфоцитов для Na+ и стимулируют трансмембранные потоки Na+, К+, Н+, Mg2+ и Са2+ (Kaplan, Owens, 1978; Segel et al., 1979; Averdunk, Gunther, 1980; Grinstein, Dixon, 1989). Каплан с соавторами одними из первых стали рассматривать изменение внутриклеточной концентрации натрия в качестве необходимого компонента раннего сигнала для пролиферации и последующей дифференцировки лимфоцитов (Prasad et al., 1987). Эти исследователи обнаружили, что вслед за быстрым усилением трансмембранного потока Na+ в клетку, через 3-5 часов после митогенной активации, резко увеличивается число уабаин-связывающих сайтов, причем это увеличение не связано с процессами синтеза белка (Severini et al., 1987). В те годы предполагалось, что изменение интенсивности потоков моновалентных катионов (К+ и Na+) через плазматическую мембрану может служить сигналом для пролиферации, дифференцировки и регуляции роста клеток (Rozengurt, 1981; Rosoff, Cantley, 1985; Rozengurt, 1986).
Более поздние исследования показали, что, хотя ингибирование отдельных систем ионного транспорта на начальных этапах ответа клетки на митоген тормозит пролиферацию, ионные изменения не являются достаточными для ее запуска. Известно, что в пролиферирующих клетках имеются такие же системы транспорта ионов, как и в дифференцированных клетках. Значительная часть потоков моновалентных катионов в этих клетках составляет транспорт через Ка+,К+-АТФазную систему, а большая часть уабаин-резистентных потоков обусловлена работой фуросемид-чувствительной системы симпорта Na+/K+/Cl". Было показано, что механизмы, вызывающие изменения трансмембранного ионного транспорта, разнятся в зависимости от типа клеток. Так, при индукции дифференцировки под действием ростовых факторов в фибробластах (линия ЗТЗ, клетки китайского хомячка), клетках нейробластомы, миоцитах мыши и лягушки, почечных клетках собаки, пре-В лимфоцитах мыши (70Z/3) увеличение внутриклеточной концентрации Na+ происходит благодаря активации амилорид-чувствительного Ыа+,Н+-обменника (Rosoff, Cantley, 1985; Rozengurt, 1986; Grinstein, Dixon, 1989). При этом, хотя амилорид блокировал пролиферативный ответ данных клеток, но, одной только активации Ка+,Н+-обменника было недостаточно для усиления пролиферации и дифференцировки, вызванных действием ростовых факторов. В то же время, в клетках эритроидной лейкемии мышей (MEL) увеличение концентрации внутриклеточного Na+ при дифференцировке, индуцированной DMSO, было обусловлено ингибированием Na+,K+-АТФазы (путем снижения степени фосфорилирования его каталитической субъединицы), что вело к спаду интенсивности выходного потока Na+ (Rosoff, Cantley, 1985).
Значительный прогресс в понимании роли катионов в регуляции пролиферации связан с тем, что модуляции трансмембранного транспорта ионов стали соотносить с разными стадиями пролиферативного ответа.
Внутриклеточное содержание натрия и уровень входных потоков рубидия в активированных лимфоцитах
Лимфоциты — это единственные иммунокомпетентные клетки организма, способные специфически распознавать разные антигены и отвечать активацией на контакт с определенным антигеном. Эти клетки необходимы для реализации иммунного ответа. Существуют 2 основных типа иммунных ответов. Гуморальный иммунитет направлен против экстраклеточных патогенов, он опосредован созревающими в костном мозге В-лимфоцитами и связан с выработкой антител - иммуноглобулинов. Иммунный ответ клеточного типа направлен против интраклеточных патогенов и состоит в образовании специализированных клеток, реагирующих на чужеродные антигены, которые экспрессированы на поверхности других «собственных» клеток организма. Популяция таких специализированных клеток, проходящих дифференцировку в тимусе, получила название Т-лимфоцитов (Abbas et al., 1991; Berridge, 1997; Фрейдлин, 1998). Зрелые Т-лимфоциты отличаются от тимоцитов резистентностью к кортизону и способностью отвечать пролиферацией на Т-клеточные митогены: фитогемагглютинин (ФГА) и конканавалин А (Кон А). Как указывалось выше, лимфоциты периферической крови человека являются удобной модельной системой для изучения сопряженных с клеточным циклом событий, ионных изменений в том числе. Жизненный цикл лимфоцитов можно разделить на две фазы - антигеннезависимую, завершающуюся формированием покоящегося лимфоцита (фаза G0), и антигензависимую активацию лимфоцитов (фаза Gb S, G2, М). Активация лимфоцита - сложнейший биохимический процесс, начинающийся с взаимодействия клетки со стимулирующим агентом (антигеном в комплексе с молекулой главного комплекса гистосовместимости (МНС) или митогеном), при этом индуцируется ее переход из фазы Go в фазу Gi. Происходящие при этом события можно разделить на две стадии: первая начинается с активации Т-клеточного рецептора антигеном или митогеном и условно заканчивается синтезом Т-клеточного ростового фактора ИЛ-2 (см. схему на рис. 5). Следующая стадия, связанная с индуцированным ИЛ-2 прохождением последовательных фаз клеточного цикла, завершается синтезом ДНК и клеточным делением.
Схема активации Т-клеток представлена на рис. 5 (по Berridge, 1997). Сигнальные механизмы и структуры, принимающие участие в активации Т-клеток, достаточно детально исследованы. Несмотря на многоступенчатость этого процесса, участвующие в нем сигнальные каскады, передающие рецептор-индуцированный сигнал на геном, «работают» по единому плану, который включает последовательную активацию рецептора и ассоциированных с ним киназ, сигнальных молекул, транскрипционных факторов, мигрирующих в ядро и связывающихся там с промоторами соответствующих генов.
Т-клеточный рецептор (TCR) состоит из трансмембранных протеинов (а, 3 и Q, ассоциированных с CD3 комплексом (CD3y, 5 и є) и корецепторными молекулами (CD4 или CD8) (Weiss, Littman, 1994; Berridge, 1995). TCRa- и (3- цепи формируют гетеродимерный иммуноглобулино-подобный рецептор, отвечающий за распознавание антигена. Поскольку цитоплазматические концы этих цепей короткие, то они не могут рекрутировать сигнал-передающие элементы. Эту функцию выполняют CD3 и -полипептид, обладающие более длинными цитоплазматическими доменами. TCR не обладает собственной энзиматической активностью, но цитоплазматические участки несут ІТАМ-мотив (immunoreceptor tyrosine-based activation motif), служащий докинг-сайтами для нерецепторных тирозиновых киназ семейств Src (Lck, Fyn) и Syk (ZAP70). Полипептиды CD3 комплекса несут по одному ITAM, -цепь - три таких мотива. Корецепторы (CD4 или CD8) связывают молекулы МНС (И или I класса соответственно), экспрессированные на мембране антиген-презентирующих клеток (Weiss, Littman, 1994). После связывания TCR-комплексом антигена, ассоциированного с молекулой МНС, активированные Lck и Fyn автофосфорилируются, а также фосфорилируют друг друга и ITAM. Фосфорилированные ITAM становятся активными сайтами для рекрутирования других киназ, в частности ZAP70. В итоге, на активированном TCR появляются докинг-сайты для последующих сигнальных молекул, таких как PLCy, адаптерные белки Ras/MAP-киназного пути She, Grb2, Sos и РІЗ-киназа (Cantrell, 1996; Berridge, 1995).
Как уже сказано выше (в разделе 1.6), PLCy гидролизует фосфатидилинозитол-4,5-бифосфат (РІРг) До инозитол-1,4,5-трифосфата (IP3) и диацилглицерола (DAG) и запускает цепь биохимических превращений, приводящих к увеличению внутриклеточной концентрации Са и активации РКС. В результате под действием РКС происходит активация ядерного компонента транскрипционного фактора NFAT - NFATn, а внутриклеточный Са2+ стимулирует Са /кальмодулин-зависимую серин/треониновую фосфатазу кальцийнейрин, которая дефосфорилирует цитоплазматический компонент NFAT-содержащего комплекса -NFATc и таким образом индуцирует его транслокацию в ядро (Crabtree, Clipstone, 1994; Rao, 1994; Kelly, Siebenlist, 1995). В ядре NFATc и NFATn димеризуются и формируют комплекс NFAT, который имеет 2 отдельных сайта связывания в промоторе гена ИЛ-2. Для активации одного из них необходимо кооперация NFAT и транскрипционного фактора АР-1 (activating protein-1), представляющего собой конъюгат протеинов c-Fos/c-Jun (Karin, Hunter, 1995). Помимо участков для NFAT и АР-1 в промоторе гена ИЛ-2 есть сайт для связывания транскрипционного фактора NF-KB, гетеродимера состоящего из протомеров р50 (NF-кВІ) и р65 (RelA).
Экспрессия а 1-субъединицы Na+,K+-ATOa3bi в активированных лимфоцитах является циклоспорин А - зависимым процессом
На нормальных лимфоцитах человека, активированных разными митогенами, показано, что возрастание ионных потоков на ранней стадии активации (до 5 часов) сменяется стойким долговременным повышением транспортной активности натриевого насоса на поздних стадиях перехода G0 Gi S (16 - 48 ч) (Веренинов и др., 1991; Marakhova et al., 1998). В наших опытах мы проводили параллельно оценку ингибируемых уабаином входных потоков рубидия (Rb+) и экспрессии каталитической субъединицы Ма+,К+-АТФазы и подтвердили полученные ранее данные о двухфазном изменении активности натриевого насоса при активации лимфоцитов периферической крови человека фитогемагглютинином (ФГА) или форбол-дибутириловым эфиром (ФДБ) в сочетании с иономицином (ИМ). На рис. 6 видно, что в течение первых часов после стимуляции, как ФГА, так и ФДБ и ИМ, ингибируемый уабаином входной поток Rb+, рассчитанный на 1 г общего белка клетки, определенного по методу Лоури, увеличивается в среднем в 1.5 раза. К пятому часу активации поток несколько снижается и до 16 ч практически не меняется. Далее наблюдается вторая фаза нарастания уабаин-чувствительного входного потока Rb+, и к концу вторых суток культивирования лимфоцитов в присутствии митогенов вход Rb+ в клетку в 3 раза превышает поток в покоящихся клетках.
Характерно, что уабаин-резистентный поток Rb практически не меняется в том интервале времени, когда уабаин-чувствительный вход Rb+ значительно возрастает. Быстрые изменения ионных потоков в ответ на митогенную стимуляцию Т-клеток хорошо изучены (Kaplan, Owens, 1978; Segel et al., 1979; Averdunk, Gunther, 1980; Prasad et al., 1987; Severini et al., 1987; Grinstein, Dixon, 1989), в то время как механизмы, отвечающие за нарастание активности Ыа+,К+-АТФазы в течение длительного периода развертывания пролиферативного ответа нормальных лимфоцитов, не исследованы.
Как обсуждалось в обзоре литературы, основным механизмом, который регулирует уровень ионных потоков через Ма+,К+-АТФазную систему, является внутриклеточная концентрация Na+. Зависимость величины входных потоков К+ (Rb+) от внутриклеточной концентрации Na+ является одной из важных кинетических характеристик натриевого насоса (Glynn, 2002). В нормальных, физиологических условиях именно изменение концентрации Na+ в клетке контролирует скорость работы (число каталитических циклов в единицу времени) Ыа+,К+-АТФазы и определяет величину направленного в клетку потока К+. Общепризнанно, что в лимфоцитах быстрое возрастание входа К+ в ответ на ФГА обусловлено интенсификацией транспортной активности ]Ча+,К+-АТФазы в результате усиления работы Ма+,Н+-обменника и увеличения внутриклеточной концентрации Na+ (Kaplan, Owens 1978).
Как было показано ранее и как видно из табл. 1, через 5 ч и в течение следующих двух суток после активации лимфоцитов ФГА внутриклеточное содержание Na+ практически не изменяется, поэтому высокую транспортную активность натриевого насоса во время пререпликативной стадии нельзя связать с повышенной концентрацией Na+ в лимфоцитах (Marakhova et ah, 1998а). Этот вывод подтверждают данные экспериментов, в которых оценивали изменение уабаин-чувствительных входных потоков Rb+ при дополнительном повышении содержания Na+ в лимфоцитах с помощью Na+,H+ ионофора - моненсина. Моненсин (20 мкМ) вносили в культуру лимфоцитов на разных сроках активации на 30 мин и нашли, что на поздних сроках активации моненсин повышает внутриклеточное содержание Na+ в среднем в 3 раза и также увеличивает ингибируемый уабаином вход Rb+ примерно в 2 раза (табл. 1).
Из этих данных следует, что в бластах натриевый насос не работает в режиме максимального переноса ионов через мембрану, он сохраняет способность увеличивать транспортную активность в ответ на повышение внутриклеточной концентрации Na+.
Таким образом, нарастание входных потоков Rb+, которое сопутствует прогрессии Go-»Gi-»S, нельзя объяснить повышенной скоростью работы присутствующих в мембране Ма+,К+-АТФазных транспортных единиц.
В функционально-активном комплексе натриевого насоса а- и {3-субъединицы находятся в соотношении 1:1, при этом каталитическую функцию выполняет а-субъединица. Установлено, что у человека al31 изоформа №+,К+-АТФазы встречается почти во всех типах клеток (Crambert et al., 2000). Показано также, что в активированных лимфоцитах человека в течение 2 суток происходит постепенное увеличение количества al мРНК (Vereninov et аі., 1993), в то время как сведения о динамике экспрессии 01 мРНК противоречивы (Masat et al., 1996, Веренинов и др., 2001). Исходя их этих данных, изменение содержания активных комплексов натриевых насосов при запуске пролиферативного ответа лимфоцитов оценивали по изменению содержания а 1-субъединицы.
На иммуноблотах тотальных лизатов свежевыделенных покоящихся лимфоцитов полоса, соответствующая молекулярной массе а 1-субъединицы (около 100 кДа), практически не выявляется (рис. 7). В общих лизатах активно пролиферирующих клеток эритроидной лейкемии К562 и Т-клеточной линии Jurkat, а также лимфоцитов, стимулированных ФГА в течение суток, эта полоса имеет слабую интенсивность, в то время как в мембранных фракциях этих же клеток она отчетливо идентифицируется.
