Содержание к диссертации
Введение
Глава 2. Литературный обзор II
2.1. Устойчивые к антиметаболитам мутанты культивируемых клеток в решении проблем генетики соматических клеток II
2.1.1. Актуальность проблемы II
2.1.2. Мутанты, устойчивые к ядам II
2.2. Шожественно-измененный фенотип клеток с мембранно-обусловленной устойчивостью . 14
2.2.1. Мембранные мутанты 14
2.2.2. Изменение состава белков устойчивых клеток 18
2.2.3. Коллатеральная чувствительность и холодочувствительность клеток с множественной устойчивостью 20
2.2.4. Признаки трансформированного фенотипа в клетках с множественной устойчивостью 22
2.2.5. Характер наследования признака множественной устойчивости * 23
2.3. Высокий уровень устойчивости к анти метаболитам и амплификация генов 25
2.3.1. Амплификация генов у эукариот 25
2.3.2. Устойчивость, амплификация генов и цитологическая картина явления 27
2.3.3. Множественная устойчивость к ядам и амплификация генов 28
2.3.4. Стабильная и нестабильная амплификация 30
Глава 3. Материалы и методы
3.1. Клеточные линии и клоны. Условия культивирования 31
3.2. Селекция устойчивых к колхицину клонов . 32
3.3. Индукция мутагеном повышенной частоты появления устойчивых вариантов 32
3.4. Изучение стабильности сохранения признака . 32
3.5. Повышающая селекция 33
3.6. Особенности размножения клеток: скорость роста, насыщающая плотность и зависимость от сыворотки 33
3.7. Определение перекрестной устойчивости . 34
3.8. Потенциирование мембранной проницаемости твином 80 34
3.9. Накопление клетками -колхицина 35
3.10. Определение чувствительности клеток к вирусу везикулярного стоматита (ВВС) . 35
3.11. Онкогенность клеток . 36
3.12. Гистологическое исследование опухолей . 36
3.13. Гибридизация 36
3.14. Определение уровня устойчивости к колхицину в гибридных клонах 37
3.15. Трансформация чувствительных к колхицину клеток с помощью ДНК устойчивых клеток . 37
3.16. Кариологический анализ 38
Глава 4. Результаты 40
4.1. Селекция устойчивых к колхицину клонов . 40
4.1.1. Селекция устойчивых клонов и повышение частоты их появления мутагеном 40
4.1.2. Различная степень стабильности устойчивых к колхицину клонов первого шага селекции . 40
4.1.3. Повышающая селекция 44
4.2. Характеристика фенотипических особенностей устойчивых к колхицину клеток 44
4.2.1. Особенности размножения 44
4.2.2. Перекрестная устойчивость
резистентных клеток 47
4.2.3. Потенциирование чувствительности к колхицину твином 80 47
4.2.4. Накопление 3Н-колхицина клетками 51
4.2.5. Чувствительность к вирусу везикулярного стоматита 51
4.2.6. Онкогенность клеток МГХШа и колхицин-устойчивых клонов 51
4.2.7. Морфология опухолей 53
4.3. Стабильное и кодоминантное наследование признака устойчивости 55
4.3.1. Стабильное наследование устойчивости к колхицину в высокорезистентных клонах Г-ІОІ, Г-40І и Г-І20 55
4.3.2. Кодоминантность наследования резистентности в гибридах 57
4.3.3. Перенос признака устойчивости к колхицину из устойчивых клеток в чувствительные с помощью ДНК 60
4.4. Цитогенетическая характеристика 62
Глава 5. Обсуждение 65
5.1. Генетическая природа и различная степень стабильности признака устойчивости в изученных клонах 65
5.2. Фенотипические особенности устойчивых к колхицину клонов 66
5.2.1. Измененная проницаемость мембраны как механизм устойчивости к колхицину 66
5.2.2. Особенности трансформированного фенотипа устойчивых клеток 67
5.2.3. Сниженная чувствительность к вирусу 70
5.3. Стабильное и кодоминантное наследование признака устойчивости в высокорезистентных клонах 71
5.3.1. Стабильность устойчивости высокорезистентных клонов 71
5.3.2. Кодоминантное наследование признака устойчивости 73
5.4. Цитогенетическая характеристика устойчивых клонов 75
Заключение 78
Выводы 80
Литература
- Шожественно-измененный фенотип клеток с мембранно-обусловленной устойчивостью
- Устойчивость, амплификация генов и цитологическая картина явления
- Индукция мутагеном повышенной частоты появления устойчивых вариантов
- Различная степень стабильности устойчивых к колхицину клонов первого шага селекции
Введение к работе
В современной стратегии лечения злокачественных новообразований у человека химиотерапия занимает одно из центральных мест. Однако лечение рака с помощью химиотерапевтических препаратов осложняется тем, что после противоопухолевой обработки в организме обнаруживаются клетки, устойчивые к действию использованных веществ. Более того, довольно часто такие клетки перекрёс-но устойчивы к целому ряду цитостатикові метотрексату, пуроми-цину, эметину, винбластину, колхицину, винкристину, имеющим различные молекулярные мишени в клетках (вакек,Ling,1978 )• В связи с этим, изучение механизмов устойчивости клеток к противоопухолевым веществам является важной задачей.
Клетки с перекрёстной устойчивостью имеют изменёную плазматическую мембрану, вследствие чего снижено накопление цитоток-сических веществ внутри клеток. Стабильно наследующие признак устойчивости клеточные варианты с изменённой проницаемостью мембраны в литературе получили название мембранных мутантов (Baker, Ling,1978 ). Обнаружение в мембранных мутантах ослабления по одним и усиления по другим признакам трансформированного фенотипа, повышенной чувствительности к некоторым гормонам и местным анестетикам, генетической нестабильности по ряду свойств делает эти клетки перспективной модельной системой в исследовании проблем практического и теоретического значения.
Стабильное и доминантное наследование признака перекрёстной устойчивости к ядам позволяет использовать клетки с таким фенотипом для решения различных проблем генетики соматических клеток. Клетки с изменёнными функциями мембран уже использованы в получении различных гибридов соматических клеток, а также в опытах по ДНК-трансформации, в которых устойчивые к высоким концен - 9 трациям яда клетки служили в качестве доноров ДШкеЬепЬат et- аі.,1982, Копнин, 1982а; Копнин,Гудков, 1983а). Высокоустойчивые к ядам клетки - хорошая модель для исследования феномена амплификации генов, обуславливающих резистентность (Копнин, 1983). Обнаружение в устойчивых клетках изменений мембраны, связанных с появлением в избыточных количествах определённых белковых продуктов различных молекулярных масс, делает перспективным использование таких клеток в изучении координирующей роли плазматической мембраны в регуляции клеточной пролиферации. Наконец, закономерности в прогрессии высокого уровня устойчивости, выявляемые на хромосомном уровне, позволяют найти подходы к исследованию тонких генетических механизмов, определяющих устойчивость клеток к противоопухолевым препаратам.
Цель нашей работы заключалась в изучении генетической природы устойчивости к колхицину в клетках мышиной гепатомы ХХИа. В связи с этим, перед нами стояли следующие задачи:
1. Получение и генетическая характеристика устойчивых к КХ ,клонов высокодифференцированной клеточной линии мышиной гепатомы ХХИа.
2. Изучение особенностей фенотипа и кариотипа клеток с перекрёстной устойчивостью к различным цитостатикам по мере повышения уровня устойчивости к селективному агенту.
3. Выяснение характера наследования признака с помощью меж видовой гибридизации соматических клеток и ДНК-трансформации.
Научная новизна работы. Впервые получены мембранные мутанты из высокодифференцированной клеточной линии мышиной гепатомы, и проведена генетическая и фенотипическая характеристика признака устойчивости к КХ по мере повышения уровня резистентности.
Кроме того, осуществлён анализ изменения признаков трансформированного фенотипа клеток с перекрёстной устойчивостью на различных этапах селекции, а также выявлена роль перестроек хромосом 2 и 8 в развитии высокого уровня устойчивости к КХ.
Практическое значение работы состоит в том, что исследованные закономерности изменения генетических и фенотипических свойств клеток позволяет лучше понять механизмы появления клеток, устойчивым к веществам, применяемым в химиотерапии опухолей. Данная работа может быть использована в разработке оптимальных комбинаций цитостатиков с целью эффективного применения в лечении злокачественных образований у человека. Использование высокоустойчивых клеток в генноинженерных экспериментах по переносу устойчивости к КХ и другим противоопухолевым препаратам с помощью ДНК из устойчивых клеток в чувствительные предполагает применение признака устойчивости в решении ряда биотехнологических задач.
Шожественно-измененный фенотип клеток с мембранно-обусловленной устойчивостью
Особого внимания заслуживает обнаруженная в устойчивых клонах Г-4, Г-І и Г-І0І сниженная чувствительность к ВВС по сравнению с клетками мГХХГХа. Наиболее ярко выражены отличия в клонах Г-1 и Г-І01 (табл. 6). Перекрестная устойчивость клеток этих клонов к различным веществам аналогична перекрестной устойчивости к ряду вирусов в клетках человека.линии ЮЗ, резистентных к дифтерийному токсину (Moehring, Moehring, 1972). Эти клетки были резистентны к ґМ-содержащим вирусам: полиовирусу, менговирусу, вирусу болезни Ныокастла (Moehring, Moehring,1972). Механизм устойчивости не установлен. В то же время показано, что он реализуется на мембранном уровне, т.к. клетки исходной чувствительной и резистентной линий имели одинаковую чувствительность к чистой НЇК полиовируса (Moehring, Moehring, 1972).
Клетки китайского хомячка линии UH0, резистентные к действию вируса энцефаломиокардита, использованного в роли селективного агента, характеризовались перекрестной устойчивостью к ряду других вирусов: реовирусу, вирусам вакцины и везикулярного стоматита (ТаЪег et ai., 1976). Такие клетки имели сходные с ядо-устойчивыми вариантами свойства: обнаруживались с мутационной частотой, индуцировались мутагеном, были относительно стабильны вне селективных условий (ТаЪег et ai., 1976).
Этапы проникновения вируса в клетку включают связывание с поверхностным клеточным рецептором, интернализацию внутрь мембранного пузырька и транспорт в цитоплазму клетки.(Merion et al., 1983)-Возможно, что изменения мембраны, происходящие в устойчивых к ядам и вирусам клетках, могут влиять на любой из этапов проникновения вируса в клетку. В связи с этим вполне вероятно, что устойчивость к вирусам и ядам в некоторых случаях может иметь одинаковую природу. Клетки изученных нами клонов Г-І и Г-І0І, обладающие измененной мембраной и перекрестной устойчивостью к КХ, АД, БЭ и BBG, могут подтверждать высказанное предположение .
Клетки первого шага селекции послужили основой для получения высокоустойчивых клонов (рис. 2), уровень резистентности которых превышал устойчивость к КХ клеток МГХХПа более чем в 200 раз (табл. 4). Такой высокий уровень устойчивости, по-видимому, обеспечивается множеством аллелей или генов, обуславливающих устойчивый фенотип (Baker, Ling, 1978).
В клетках джунгарского хомячка, устойчивых к высоким концентрациям ДО и имеющих измененную клеточную мембрану, показано не стабильное сохранение признака без селективного давления (Мае-сино и др., 1981). Такая же закономерность обнаружена в высокоустойчивых к ЮС клетках джунгарского хомячка (Копнин, Гудков, 19826), которые в 170-750 раз, более устойчивы к КХ, чем чувствительные клетки. При культивировании клеток без КХ они теряли устойчивость на 2,7-452 за одно деление клеточной популяции (Копнин, Гудков, 19826). В клетках мышиной нейробластомы, перекрестно-устойчивой к высоким концентрациям винкристина, мейтан-зина и адриамицина, обнаружено нестабильное сохранение признака устойчивости в неселективных условиях (Baskin et al.,1981).
Наряду с нестабильной устойчивостью к МТ в некоторых работах обнаружено относительно стабильное сохранение признака. В этих случаях шлплифицировэнные гены, ответственные за высокий уровень устойчивости, были представлены в виде Г00 на различных хромосомах (ITunberg et al., 1978; Dolnick et al., 1979).
Изученные нами клоны Г-ІОІ, Г-40І и Г-І20, устойчивые к КХ более чем в 200 раз по сравнению с чувствительными клетками МГХХПа, сохраняли признак относительно стабильно (табл. 8 и пункт 4.3.1. "Результатов"). Отмечены различия в сохранении признака между клонами Г-І0І и Г-40І третьего шага селекции, растущих на I мкг/мл КХ и имеющих уровни устойчивости в 530 и 216 раз выше, чем в клетках МГХХПа. Если в клоне Г-40І уровень устойчивости остается на одном уровне, то в Г-І0І он падает на 30-40% и далее остается неизменным при культивировании без КХ (табл. 8). Потеря устойчивости в самом высокорезистентном клоне, Г-І20, за 1,5 месяца культивирования без яда всего на 20-25$ также свидетельствует о стабильном способе наследования высокого уровня устойчивости, напоминающем описанный в МТ-ус-тойчивых клетках ( Nunberg et al., 1978). Онтогенетическая характеристика клонов Г-ІОІ, Г-ПО и Г-І20 не показала в клетках ДМ-хромосом, что хорошо подтверждает описанный стабильный тип наследования признака.
Характер наследования (доминантный, кодоминантный или рецессивный) является другой важной генетической характеристикой признака. В клетках с множественной устойчивостью, имеющих измененную мембранную проницаемость, показан, главным образом, кодоминантный тип наследования. Так, клетки ОНО, устойчивые к ВБ, во внутривидовых гибридах сохраняли устойчивость кодоминан-тно (Harris, 1973)» Устойчивые к КХ клетки UH0 также во внутривидовых гибридах имели промежуточный уровень устойчивости по сравнению с родительскими клетками, использованными в гибридизации (Ling, Baker, 1978).
В то же время в устойчивых к КХ клетках джунгарского хомячка показан рецессивный тип наследования устойчивости в межвидовых гибридах (Копнин, 1982а). И. хотя в последнем исследовании нельзя сделать однозначного вывода о рецессивности признака, по-видимому, в каждом отдельном случае необходим анализ характера наследования устойчивости.
Особого внимания заслуживает обнаруженная в устойчивых клонах Г-4, Г-І и Г-І0І сниженная чувствительность к ВВС по сравнению с клетками мГХХГХа. Наиболее ярко выражены отличия в клонах Г-1 и Г-І01 (табл. 6). Перекрестная устойчивость клеток этих клонов к различным веществам аналогична перекрестной устойчивости к ряду вирусов в клетках человека.линии ЮЗ, резистентных к дифтерийному токсину (Moehring, Moehring, 1972). Эти клетки были резистентны к ґМ-содержащим вирусам: полиовирусу, менговирусу, вирусу болезни Ныокастла (Moehring, Moehring,1972). Механизм устойчивости не установлен. В то же время показано, что он реализуется на мембранном уровне, т.к. клетки исходной чувствительной и резистентной линий имели одинаковую чувствительность к чистой НЇК полиовируса (Moehring, Moehring, 1972).
Клетки китайского хомячка линии UH0, резистентные к действию вируса энцефаломиокардита, использованного в роли селективного агента, характеризовались перекрестной устойчивостью к ряду других вирусов: реовирусу, вирусам вакцины и везикулярного стоматита (ТаЪег et ai., 1976). Такие клетки имели сходные с ядо-устойчивыми вариантами свойства: обнаруживались с мутационной частотой, индуцировались мутагеном, были относительно стабильны вне селективных условий (ТаЪег et ai., 1976).
Этапы проникновения вируса в клетку включают связывание с поверхностным клеточным рецептором, интернализацию внутрь мембранного пузырька и транспорт в цитоплазму клетки.(Merion et al., 1983)-Возможно, что изменения мембраны, происходящие в устойчивых к ядам и вирусам клетках, могут влиять на любой из этапов проникновения вируса в клетку. В связи с этим вполне вероятно, что устойчивость к вирусам и ядам в некоторых случаях может иметь одинаковую природу. Клетки изученных нами клонов Г-І и Г-І0І, обладающие измененной мембраной и перекрестной устойчивостью к КХ, АД, БЭ и BBG, могут подтверждать высказанное предположение .
Клетки первого шага селекции послужили основой для получения высокоустойчивых клонов (рис. 2), уровень резистентности которых превышал устойчивость к КХ клеток МГХХПа более чем в 200 раз (табл. 4). Такой высокий уровень устойчивости, по-видимому, обеспечивается множеством аллелей или генов, обуславливающих устойчивый фенотип (Baker, Ling, 1978).
В клетках джунгарского хомячка, устойчивых к высоким концентрациям ДО и имеющих измененную клеточную мембрану, показано не стабильное сохранение признака без селективного давления (Мае-сино и др., 1981). Такая же закономерность обнаружена в высокоустойчивых к ЮС клетках джунгарского хомячка (Копнин, Гудков, 19826), которые в 170-750 раз, более устойчивы к КХ, чем чувствительные клетки. При культивировании клеток без КХ они теряли устойчивость на 2,7-452 за одно деление клеточной популяции (Копнин, Гудков, 19826). В клетках мышиной нейробластомы, перекрестно-устойчивой к высоким концентрациям винкристина, мейтан-зина и адриамицина, обнаружено нестабильное сохранение признака устойчивости в неселективных условиях (Baskin et al.,1981).
Наряду с нестабильной устойчивостью к МТ в некоторых работах обнаружено относительно стабильное сохранение признака. В этих случаях шлплифицировэнные гены, ответственные за высокий уровень устойчивости, были представлены в виде Г00 на различных хромосомах (ITunberg et al., 1978; Dolnick et al., 1979).
Изученные нами клоны Г-ІОІ, Г-40І и Г-І20, устойчивые к КХ более чем в 200 раз по сравнению с чувствительными клетками МГХХПа, сохраняли признак относительно стабильно (табл. 8 и пункт 4.3.1. "Результатов"). Отмечены различия в сохранении признака между клонами Г-І0І и Г-40І третьего шага селекции, растущих на I мкг/мл КХ и имеющих уровни устойчивости в 530 и 216 раз выше, чем в клетках МГХХПа. Если в клоне Г-40І уровень устойчивости остается на одном уровне, то в Г-І0І он падает на 30-40% и далее остается неизменным при культивировании без КХ (табл. 8). Потеря устойчивости в самом высокорезистентном клоне, Г-І20, за 1,5 месяца культивирования без яда всего на 20-25$ также свидетельствует о стабильном способе наследования высокого уровня устойчивости, напоминающем описанный в МТ-ус-тойчивых клетках ( Nunberg et al., 1978). Онтогенетическая характеристика клонов Г-ІОІ, Г-ПО и Г-І20 не показала в клетках ДМ-хромосом, что хорошо подтверждает описанный стабильный тип наследования признака.
Характер наследования (доминантный, кодоминантный или рецессивный) является другой важной генетической характеристикой признака. В клетках с множественной устойчивостью, имеющих измененную мембранную проницаемость, показан, главным образом, кодоминантный тип наследования. Так, клетки ОНО, устойчивые к ВБ, во внутривидовых гибридах сохраняли устойчивость кодоминан-тно (Harris, 1973)» Устойчивые к КХ клетки UH0 также во внутривидовых гибридах имели промежуточный уровень устойчивости по сравнению с родительскими клетками, использованными в гибридизации (Ling, Baker, 1978).
В то же время в устойчивых к КХ клетках джунгарского хомячка показан рецессивный тип наследования устойчивости в межвидовых гибридах (Копнин, 1982а). И. хотя в последнем исследовании нельзя сделать однозначного вывода о рецессивности признака, по-видимому, в каждом отдельном случае необходим анализ характера наследования устойчивости.
Устойчивость, амплификация генов и цитологическая картина явления
О стабильности сохранения признака устойчивости судили по изменению концентрации КХ, снижающей относительную эффективность клонирования на 50% - ЛД О или относительный Рост кле-ток на 50% - ЛДр д.
Под относительной эффективностью клонирования понимали число колоний, выросших в среде с ядом, отнесенное к числу колоний, выросших в среде без яда, выраженное в процентах. Для определения ЛДтгкпКХ по 200 клеток изучаемых клонов высевали на чашки Петри диаметром 50 мм с различным содержанием КХ (по 3-4 чашки на каждую концентрацию) в 5 мл среды (в контрольных чашках среда без КХ). Через 8-12 дней клоны окрашивали кристаллическим фиолетовым, считали и строили кривую зависимости роста колоний от концентрации КХ в среде. На кривой находили точку, соответствующую концентрации КХ, снижающей относительную эффективность клонирования на 50%. В результатах приведены средние величины ЛДтл5дКХ по 3-4 опытам для каждого клона.
Под относительным ростом понимали число клеток, выросших за 48 часов в среде с ядом, отнесенное к числу клеток, выросших в среде без яда за это же время, выраженное в процентах. Дяя оп-ределения ЛДрздКК по (1,2-1,5)40 клеток высевали на чашки диаметром 50 мм с различным содержанием КХ (по 3-4 чашки на каждую концентрацию) в 5 мл среды и через 48 часов подсчитывали клетки в камере Горяева. Затем строили кривую зависимости роста от концентрации КХ в среде и на кривой находили точку, соответствующую концентрации КХ, снижающей рост клеток на Ъ0%. В результатах даны средние величины ЛДрзд по 3-4 опытам для каждого клона.
Повышающую селекцию из стабильно устойчивых клонов Г-І и Г-4 осуществляли добавлением к культуре (во флаконах Карреля или на чашках Петри) среды с увеличенной концентрацией КХ. Выросшие на повышенной концентрации клоны суммарно вели 2-3 пассажа и затем снова добавляли более высокие концентрации КХ.
Скорость роста клеток характеризовали: определением времени удвоения популяции. Для этого клетки высевали по 2.5«10 на чашки Петри диаметром 50 мм в 5 мл среды. Среду меняли через 24, 72 и далее каждые 24 часа; одновременно со сменой среды считали клетки (2-3 чашки на каждый счет). Затем строили кривую зависимости роста клеток от времени культивирования и по участку кривой, соответствующему логарифмической фазе роста культуры, определяли время удвоения популяции. На этой же кривой определяли величину насыщающей плотности клеток, которая соответствовала максимальному числу клеток на чашку Петри диаметром 50 мм.
Зависимость роста клеток от концентрации сыворотки в среде определяли по показателю КС50 - концентрации сыворотки, снижающей рост клеток на 50% по сравнению с ростом этих клеток в среде с 10% сыворотки. Для этого на чашки диаметром 50 мм высеем вали по 2.5 10 клеток в среду, содержащую 10% сыворотки. Через 24 часа среду меняли на свежую, но содержащую разные концентрации сыворотки: О, I, 3 и 10%. Одновременно со сменой среды считали клетки в 2-3 контрольных чашках. Далее, через 72 часа считали клетки во всех четырех вариантах (2-3 чашки на каждую концентрацию сыворотки). Затем строили кривую зависимости роста клеток от концентрации сыворотки и определяли KCJ-Q.
При определении перекрестной устойчивости к КХ, актиномици-ну D (АД) (Reanal) и бромистому этидию (БЭ) (Sigma) сравнивали ЛД КХ, ЛДрр-дАД и ЛДрс-оБЭ для клеток МГХХПа и ее резистентных клонов. ЛДр50АД и ЛДр50БЭ находили аналогично ЛДр50КХ, но при определении ЛДтэг БЭ клетки инкубировали с ядом не 48, а 72 часа, т.к. эффект БЭ на клетки проявлялся несколько позже, чем для КХ и АД.
Эффективную концентрацию твина 80 (serva), необходимую для потенциирования мембранной проницаемости, находим по кривой зависимости роста клеток от концентрации твина в среде. Опыты ставились аналогично определению зависимости роста от сыворотки, где варьировали концентрации твина. За эффективную принимали концентрацию твина 80, которая снижала рост клеток на 10-15%. 0 потенциировании мембранной проницаемости судили по изменению ЛДр50КХ для клеток, выращиваемых в среде с твином и без него.
Накопление клетками Н-колхицина определяли согласно методике Минора и Роскоу (Minor, Roscoe, 1975) с некоторыми модифика-пиями. Клетки высевали по (3-5)»10 на пластиковые чашки Петри диаметром 30 мм (Plow) в I мл среды, через 24 часа добавляли в каждую чашку по 14.8%КГк 3Н-колхицина (Amercham) и 0.5 мкг КХ, в контрольные чашки добавляли только КХ; одновременно с добавлением КХ в 2-3 чашках считали число клеток на чашку. Через I, 3, 5 и 7 часов с 2-3 чашек среду сливали, трижды отмывали холодным физиологическим раствором (быстро), сушили под феном и добавляли по 0.8 мл 0.2 N раствора ИаОН на 30 минут при 37 С. После растворения клеток содержимое чашек высушивали на фильтровальной бумаге, помещали в толуоловый сцинтиллятор и считали на счетчике Mark Ш (СШ&). Затем строили кривую зависимости накопления 3Н-колхицина клетками от времени инкубации с КХ.
Индукция мутагеном повышенной частоты появления устойчивых вариантов
Клетки клонов Г-4 и Г-40І имели характерную для мышиной гепато-мы ХХПа морфологию - эпителиоподобную, тогда как клетки клонов Г-І и Г-І0І имели вытянутую, веретенообразную форму. На рис. 3 А представлены кривые роста изученных линий. Характер кривых роста клонов Г-І и Г-4 сходен с линией МГХХПа, но для Г-І отмечена повышенная насыщающая плотность, кроме того оба клона Г-І и Г-4 незначительно снижали скорость роста (рис. 3 А, табл.3). Б клонах более высокого уровня устойчивости, Г-І0І и Г-40І наблюдается снижение насыщающей плотности и также некоторое уменьшение скорости роста (рис. 3 А, табл. 3).
Другой отличительной особенностью размножения устойчивых клеток была сниженная зависимость роста от концентрации сыворотки в среде. Причем эта зависимость становилась тем меньше, чем выше был уровень устойчивости к КХ. На рис. З Б приведены кривые зависимости роста клонов от концентрации сыворотки в среде. Если для МГХХПа КС50 составляла 2.8-2.9$, то для клонов Г-І и Г-4 она снижалась до 0.8-0.9$ и далее для Г-І0І и Г-40І -до 0.05-0.1$ (табл. 3).
Итак, по мере увеличения устойчивости к КХ в клетках наблюдаются общие тенденции снижения скорости роста и зависимости размножения от сыворотки, и после некоторого повышения насыщающей плотности в клонах Г-І и Г-4 снижается насыщающая плотность в более устойчивых клонах Г-І0І и Г-40І.
Пе екрестная стоіічійость резистентных_клеток Первым этапом в выяснении природы устойчивости клеток к КХ было определение перекрестной устойчивости к ядам, имеющим другие мишени в клетке. В качестве ядов выбрали АД и БЭ. Из табл. 4 видно, что резистентные к КХ клоны перекрестно устойчивы к БЭ и АД. Так, клон Г-І имеет ЛДр5 БЭ и ЛДр5дАД 8.2 и 0.012 мкг/мл, соответственно, что в 9 и 4 раза превышает эти показатели для МГХШа. Та же закономерность обнаружена для остальных клонов: Г-4, Г-І0І и Г-40І. Более того, с повышением уровня устойчивости к КХ увеличиваются ЛДр БЭ и АД (табл. 4).
Потенцшфование чувствительноеTHJKJCX твином__80
Из рис. 5 видно, что рост клеток МГХХПа снижается на 5-20$ при концентрации твина 80 30-50 мкг/мл. Для экспериментов по потенциированию проницаемости КХ в устойчивых клонах выбрали концентрацию твина 40 мкг/мл, снижающую на 10-15$ рост клеток. В табл. 5 приведены данные о влиянии твина на изменение величины ЛДр50КХ для клеток МГХХПа и резистентных клонов. Видно, что обработка твином снижает ЛДр5дКХ исходной гепатомы всего в 2 раза, тогда как в устойчивых клонах этот показатель падает в 7.3, 22.8, 5.7 и 10.8 раз для Г-І, Г-4, Г-І0І и Г-40І, соответственно.
На рис. 5 представлены кривые накопления 3Н-колхицина клетками мышиной гепатомы ХХПа и клонов Г-І, Г-4, Г--І0І и Г-40І. Клетки линии МГХШа через час инкубации с ї-колхицином накапливают примерно в 2 раза больше метки, чем устойчивые клоны, через 3 часа инкубации - в 3 раза больше и т.д.
Чувствительноеть_к__вир2су; везикулярного стоматита В табл. 6 приведены результаты пяти опытов определения чувствительности клеток МГХШа и КХ-устойчивых клонов к вирусу везикулярного стоматита (ВВС). Наибольшие отличия в чувствительности наблюдаются между клетками МГХШа и клонами Г-І и Г-І0І, которые соответственно в 14 и II раз менее чувствительны в вирусу, чем МГХШа. Клетки клона Г-4 всего в 4 раза устойчивее к ВВС, чем МГХШа. Интересно отметить, что не обнаружено прогрессирующего снижения чувствительности к ВВС от клона Г-І к клону Г-І0І, хотя клетки последнего в 96 раз устойчивее к КХ, чем клетки Г-І по ЛДр50КХ (табл. 4).
Онкогенность_клеток Ж1ЇЇЩа_и_ІК-2;стойчившс_іиіонов Из табл. 7 видно, что при инъекции 0.5#Ю клеток линии МГХШа мышам СЗШ. опухоли появляются у 50% мышей на 6-7 день, у 100$ - на 8-9 день. 50 и 100 $-ное появление опухолей для клеток клона Г-І при введении того же количества клеток » отмечено на 13-14 и 17-18 дни, соответственно, а для клеток клона Г-І0І обнаружено только 50%-ное появление опухолей на 16-17 день, а 100%-ного не было за весь 60-дневный период наблюдения за мышами. При увеличении количества вводимых клеток этого клона в 10 раз 50%-ное появление опухолей отмечено на 7-8 день, а 100%-ное так и не зарегистрировано (табл. 7). Опухоли, образованные у мышей при введении клеток МГХКПа и КХ-устойчивых клонов Г-І и Г-І0І, отличались по морфологии. Из рис. 6 А видно, что опухоли, выросшие при инъекции клеток линии МГХШа, состоят из рыхло расположенных клеток, имеющих неправильно округлую форму. Межклеточные прстранства как правило свободны. В местах более плотного расположения клетки имеют полигональную форму. Ядра клеток крупные, округлые, содержат хорошо структурированный хроматин и часто хорошо различимые яд - 54 Рисунок 6. Морфология опухолей, образованных у мьшей линии СЗНА после введения клеток: А - МГХХІІа, Б - клона Г -І, В -клона Г—101. Окраска гематоксилин-эозином.
Опухоли, выросшие у мышей после введения клеток клона Г-І (рис. 6 Б), отличаются от предыдущих более интенсивным развитием стромы. В результате этого опухолевые клетки расположены не сплошным пластом, а сгруппированы в комплексы, которые могут содержать от 2-3 клеток до нескольких десятков. Вокруг таких комплексов расположены пучки колагенових волокон и аморфное эозинофильное вещество. Клетки и особенно их ядра значительно варьируют по величине. Ядра клеток преимущественно овальной или округлой формы, содержат хорошо структурированный хроматин и одно или несколько ядрышек. Цитоплазма розовая, слегка гранулированная. Фигуры митоза в клетках немногочисленны. Встречаются гигантские, уродливые ядра и иногда обнаруживаются двуядер-ные клетки.
В опухолях, образованных при инъекции клеток клона Г-І0І (рис. 6 В), клетки располагаются крупными комплексами, отграниченными соединительнотканными прослойками, внутри комплексов клетки расположены рыхло, образуя широкие межклеточные пространства. Обращает на себя внимание резко выраженная анизомор-фия ядер, часто встречаются очень большие, крупные, даже гигантские ядра неправильной формы. Фигуры митозов относительно редки.
Различная степень стабильности устойчивых к колхицину клонов первого шага селекции
Одной из черт транформированного фенотипа клеток может быть тип роста клеток в культуре. Клетки китайского хомячка, устойчивые к АД, 1, ВК, характеризовались фибробласто-подобным, строго ориентированным типом роста и образовывали плотный монослой трудно открепляемых от стекла клеток. Для чувствительных клеток характерен полиморфизм, рыхлый тип роста и более быстрая открепляемость от субстрата (Biedler et ai., 1975).
Изученные нами устойчивые к КХ клоны Г-І и Г-І0І представлены вытянутыми фибробласто-подобными клетками, образующими плотный монослой. В образованных у мышей линии СЗНА опухолях при введении этих клеток особенности роста сохраняются. Клетки имеют вытянутую форму и располагаются ориентированными группами (рис. 6Б,В).
В отличие от клонов Г-І и Г-І0І, клетки двух других клонов Г-4 и Г-40І не обнаружили каких либо отличий от чувствительных клеток МТХХПа при культивировании in vitro, несмотря на то, что они характеризовались множественной устойчивостью.
Таким образом, морфология клеток изученных устойчивых клонов не позволяет сделать однозначный вывод о связи изменений клеточной морфологші с устойчивостью к КХ.
Одним из свойств трансформированных клеток, растущих в культуре, является снижение зависимости роста клеток от концентрации сыворотки в Среде (Todaro, Green, 1963).
Клетки, характеризуемые множественной устойчивостью, способны размножаться на среде без сыворотки как угодно долго после предварительного длительного ведения в присутствии селективного агента (Плескач, Игнатова, 198U; Игнатова, 1983). Этот признак относят к характеристике высокотрансформированного фенотипа.
В клетках изученных нами устойчивых к ЮС клонов Г-І, Г-4, Г-І0І и Ґ-40І отмечено снижение зависимости роста от концентрации сыворотки в среде, причем эта зависимость снижается по мере повышения устойчивости к ЮС (табл. 3).
Таким образом, клетки изученных клонов с мембранно-обуслов-ленной множественной устойчивостью характеризуются с одной стороны усилением трансформированного фенотипа по признаку "зависимость размножения от сывороточных факторов роста" и ослаблением ряда признаков трансформированного фенотипа с другой стороны (табл. II).
Особого внимания заслуживает обнаруженная в устойчивых клонах Г-4, Г-І и Г-І0І сниженная чувствительность к ВВС по сравнению с клетками мГХХГХа. Наиболее ярко выражены отличия в клонах Г-1 и Г-І01 (табл. 6). Перекрестная устойчивость клеток этих клонов к различным веществам аналогична перекрестной устойчивости к ряду вирусов в клетках человека.линии ЮЗ, резистентных к дифтерийному токсину (Moehring, Moehring, 1972). Эти клетки были резистентны к ґМ-содержащим вирусам: полиовирусу, менговирусу, вирусу болезни Ныокастла (Moehring, Moehring,1972). Механизм устойчивости не установлен. В то же время показано, что он реализуется на мембранном уровне, т.к. клетки исходной чувствительной и резистентной линий имели одинаковую чувствительность к чистой НЇК полиовируса (Moehring, Moehring, 1972).
Клетки китайского хомячка линии UH0, резистентные к действию вируса энцефаломиокардита, использованного в роли селективного агента, характеризовались перекрестной устойчивостью к ряду
других вирусов: реовирусу, вирусам вакцины и везикулярного стоматита (ТаЪег et ai., 1976). Такие клетки имели сходные с ядо-устойчивыми вариантами свойства: обнаруживались с мутационной частотой, индуцировались мутагеном, были относительно стабильны вне селективных условий (ТаЪег et ai., 1976).
Этапы проникновения вируса в клетку включают связывание с поверхностным клеточным рецептором, интернализацию внутрь мембранного пузырька и транспорт в цитоплазму клетки.(Merion et al., 1983)-Возможно, что изменения мембраны, происходящие в устойчивых к ядам и вирусам клетках, могут влиять на любой из этапов проникновения вируса в клетку. В связи с этим вполне вероятно, что устойчивость к вирусам и ядам в некоторых случаях может иметь одинаковую природу. Клетки изученных нами клонов Г-І и Г-І0І, обладающие измененной мембраной и перекрестной устойчивостью к КХ, АД, БЭ и BBG, могут подтверждать высказанное предположение .
Клетки первого шага селекции послужили основой для получения высокоустойчивых клонов (рис. 2), уровень резистентности которых превышал устойчивость к КХ клеток МГХХПа более чем в 200 раз (табл. 4). Такой высокий уровень устойчивости, по-видимому, обеспечивается множеством аллелей или генов, обуславливающих устойчивый фенотип (Baker, Ling, 1978).
