Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 5
1. История изучения криптоспоридий 5
2. Положение Cryptosporidium в системе простейших 7
3. Специфичность Cryptosporidium по отношению к хозяину 10
4. Пути передачи инвазии 11
5. Жизненный цикл Cryptosporidium 12
6. Криптоспоридиоз как оппортунистическая инфекция 19
7. Патология и патофизиология криптоспоридиоза 20
8. Биохимические особенности Cryptosporidium 23
Глава II. Материал и методы исследования 27
1. Очистка и концентрация ооцистС. parvum 27
2. Заражение лабораторных животных 27
3. Электронная микроскопия 28
4. Получение и поддержание первичной культуры резидентных пе-ритонеальных макрофагов мыши 29
5. Микрофлуориметрическое измерение образования активных форм кислорода в одиночных макрофагах 29
6. Определение рН внутри фагосом макрофагов 30
Глава III. Результаты 31
1. Электронномикроскопическое исследование взаимодействия С. parvum с клетками иммунной системы хозяина (опыты in vivo) 31
2. Особенности взаимодействия С. parvum с макрофагами в культуре 32
3. Влияние паразита на окислительный взрыв в культивируемых макрофагах 33
3.1. Окислительный взрыв при контакте макрофагов с ооцистами С. parvum 33
3.2. Индукция окислительного взрыва в макрофагах хемотактиче-ским пептидом fMLP после фагоцитоза оцист 39
4. Влияние С. parvum на лизосомальную систему макрофагов 40
Глава IV. Обсуждение 43
1. Иммунный ответ хозяина при криптоспоридиозе 43
2. Окислительный взрыв в клетках хозяина и механизмы защиты от него у внутриклеточных паразитических простейших 47
3. Обсуждение результатов исследования 58
Заключение 64
Выводы 65
Список литературы 66
- Положение Cryptosporidium в системе простейших
- Биохимические особенности Cryptosporidium
- Окислительный взрыв при контакте макрофагов с ооцистами С. parvum
- Обсуждение результатов исследования
Положение Cryptosporidium в системе простейших
Род Cryptosporidium является одним из многочисленных родов простейших, принадлежащих к типу Apicomplexa (табл. 1). По современным представлениям, Cryptosporidhim относят к классу Coccidia, отряду Еи-coccidiorida, включающему как ТИПИЧНЫХ гомоксенных КОКЦИДИЙ (Eimeria, Isospora, Cyclospora и Cryptosporidium), так и гетероксенных представителей (Besnoitia, Caryospora, Frenkelia, Hammondia, Neospora, Sarcocystis и Toxoplasma). В настоящее время признается самостоятельность семейства Cryptosporidiidae Leger, 1911 (Levine et al., 1980; Levine, 1984).
Сейчас признаются валидными 8 видов кршітоспоридий (табл. 2). Кроме того, недавно описан новый вид С. andersoni (Lindsay et al., 2000), паразитирующий у крупного рогатого скота, но отличающийся от С. раг-vum и С. muris, как по размерным характеристикам, так и по генетическим маркерам.
Доказано, что С. parvum заражает около 79 видов млекопитающих, включая человека (ODonoghue, 1995). Хотя разные изоляты С. parvum имеют различия на молекулярном уровне, а также варьируют по уровню вирулентности, считается, что этих признаков все-таки недостаточно для придания им более высокого таксономического статуса.
Двумя основными препятствиями, мешающими прогрессу в этой области, являются неспособность исследователей длительное время размножать криптоспоридии in vitro и неспособность криоконсервировать их, что возможно для большинства микроорганизмов. Эти технические проблемы отражаются в отсутствии хорошо охарактеризованных стандартных штаммов Cryptosporidium, заражающих различные классы позвоночных, виды или подвиды. Немногие постоянно используемые в лабораторных исследованиях изоляты С. parvum поддерживаются путем пассирования через животных, в основном телят. Существует лишь небольшое количество изолятов С. parvum, которые широко используются в лабораторных исследованиях и частично охарактеризованы генетически и фено-типически. Среди них Iowa, MD и GCH1, которые пассируются длительное время, свыше нескольких лет. Сейчас уже невозможно узнать, идентичны ли эти изоляты фенотипически и генетически исходным изолятам, полученным в свое время от спонтанно зараженных животных, поскольку исходные изоляты до сих пор не удается сохранить таким образом, чтобы их можно было в будущем оживить и сравнить. Именно поэтому лабораторные изоляты Cryptosporidium нельзя рассматривать как типовые штаммы (Tzipori, Widmer, 2000).
В настоящее время существуют и другие точки зрения на таксономическое положение Cryptosporidium, в том числе и такие, которые ставят под вопрос саму кокігядийную природу этого паразитического простейшего. Они опираются на данные молекулярной систематики и имеют довольно противоречивый, с нашей точки зрения, характер. Эти данные были представлены в большом количестве публикаций (Johnson et al., 1990; Barta et at, 1991; Morrison, 1997; Carreno et al, 1998; Zhu et al., 2000) и предметом нашего рассмотрения не являются.
Биохимические особенности Cryptosporidium
Все внутриклеточные паразиты, и в том числе Cryptosporidium, являются объектами, неудобными дога биохимических исследований, в первую очередь потому, что сама по себе внутриклеточная локализация сильно затрудняет очистку эндогенных стадий от клеток хозяина. Поэтому большинство биохимических исследований криптоспоридий проводилось и проводится на экзогенных стадиях - ооцистах и спорозоитах, метаболизм которых, естественно, сильно отличается от такового эндогенных (внутриклеточных) стадий.
В спорулированных ооцистах С. parvum был изучен лишь состав основных липидов (Mitschler, 1994; Mitschler et al., 1994). Cryptosporidium, как и все кокцидии, имеет низкое соотношение уровня холестерола к фосфолипидам. Этот факт, наряду с преобладанием коротких цепей в жирных кислотах, высоким содержанием ненасыщенных жирных кислот и фосфатидилхолина, наводит на мысль о значительной или даже высокой степени жидкостности их мембран (Gallois et al, 1988).
Стенка толстостенной ооцисты Cryptosporidium (рис. 7) двуслойная и, как считается, довольно инертная по своей химической природе. О ее структуре известно мало. Однако она отличается от стенки ооцист Eimeria tenella как по составу жирных кислот, так и по количеству и молекулярным массам белков. Общим для Cryptosporidium и других кокцидии является лишь большое количество дисульфидных связей в стенке ооцисты. Показано, что наружный и внутренний слои стенки ооцисты иммуноло-гически различны и можно получить антитела, специфически реагирующие с белками того или другого слоя.
Наружный слой стенки ооцисты сильно гликозилирован. На поверхности ооцист при обработке рутениевым красным выявляется мощный гликокаликс (Nanduri et al., 1999) Описан целый ряд лектинов, агглютинирующих ооцисты С. parvum (подробнее см: Tilley, Upton, 1997; Ward et al., 1997).
На поверхности спорозоитов обнаружена металлозависимая цисте-инпротеиназа (Nesterenko et al., 1995; Huang, Petersen, 1997). Предполагаемые функции этого фермента включают растворение белков стенки толстостенной ооцисты в процессе эксцистирования, расщепление антител или белков комплемента на поверхности слизистой кишки, а возможно и усиление способности спорозоитов проникать через муцины или гликокаликс клетки хозяина.
В настоящее время описано несколько антигенов кршітоспоридий, участвующих как в проникновении зоита в клетку хозяина, так и в движении паразита по субстрату. Среди них выделяемые паразитом из роптрий антиген CSL (лиганд спорозоита, участвующий в процессе заражения клетки) и три главных антигена поверхности спорозоитов с молекулярной массой 17-18 кДа, 27-28 кДа и гликопротеин GP900, являющиеся адгезинами при движении зоитов по субстрату (Petersen et al., 1992, 1997; Doyle et al., 1993; Gut, Nelson, 1994; Tilley , Upton, 1994; Riggs, 1997).
Среди цитоскелетных белков у С. parvum были обнаружены актин и тубулины аир. Было показано, что за подвижность зоитов отвечает ак-тиновый цитоскелет.
Об энергетическом обмене криптоспоридий известно также немного. Митохондрии были описаны морфологически только в зонтах. Были также выявлены гены некоторых дькательных ферментов. Однако до сих пор не ясно, сколько митохондрий в зоитах, работают ли они и каков энергетический метаболизм эндогенных стадий жизненного цикла криптоспоридий, у которых митохондрии не выявлены (подробнее см. обзор: Tilley, Upton, 1997).
Между различными изолятами С. parvum были обнаружены различия по уровню эксцистирования, степени поглощения витальных красителей, инфекционности, белковым спектрам и генетическим маркерам (Tilley, Upton, 1997; Tzipori, Widmer, 2000). В одном из исследований было показано, например, что изоляты, в которых отсутствовали полосы, соответствующие молекулярным массам 15.5 и 33 кДа на Вестерн-блоте, не могли заражать мьппей-сосунков (Taghi-Kilani, Wenman, 1994). В подобных исследованиях обычно ищут удобные методы типирования изолятов и видов Cryptosporidium, хотя параллельно подтверждается, что определенные различия изолятов могут коррелировать с их инфекционностью.
Так, например, в настоящее время удалось выделить две группы изолятов С. parvum, отличающиеся по генетическим маркерам, одна из которых заражает преимущественно людей, а другая - телят (Peng et al., 1997; Awad-El-Kariem et al, 1998; Widmer et al., 1998). При сравнительном анализе литературных данных становится ясно, что, несмотря на большой интерес ученых всего мира к изучению Cryptosporidium и криптоспоридиоза, в наших знаниях об этом возбудителе все еще остается большое число "белых пятен". К числу еще не решенных и наиболее важных задач, стоящих перед исследователями крип-тоспоридий, можно отнести в частности:
1. сравнительное изучение метаболизма паразита с использованием биохимических, молекулярно-биологических и цитохимических методов с целью поиска наиболее чувствительных мишеней для химиотерапев-тического воздействия,
2. всестороннее изучение особенностей взаимоотношений паразита и хозяина на организменном, тканевом, клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях, включая особенности иммунного ответа макроорганизма и взаимодействия криптоспоридий с иммунокомпетентными клетками хозяина, что позволит приблизиться к пониманию феномена огшортунистичности этого паразита, а также поиск методов иммунотерапии криптоспоридиоза.
3. Выяснение филогенетических связей Cryptosporidium с использованием как методов классической систематики, так и новых молекулярно-биологических подходов.
Перечисленные проблемы составляют в совокупности перспективное направление исследований. Возможно именно при помощи молекулярно-биологических методов будет получено объяснение многих уникальных особенностей этого паразита.
Окислительный взрыв при контакте макрофагов с ооцистами С. parvum
Для того, чтобы выяснить отвечают ли макрофаги одной из своих главных защитных реакций (ОВ) на контакт с ооцистами С. parvum, в фотометрическую камеру с макрофагами, заполненную раствором Хэнкса, вводили ооцисты в соотношении ооциста/макрофаг 1:1.
Оказалось, что кратковременное (5-15 мин) взаимодействие прикрепленных к стеклу макрофагов с суспензией ооцист вызьшает ОВ в макрофагах. Через 2 и 4 ч совместного культивирования интенсивность ОВ макрофагов плавно снижается и через 5.5-6 ч ОВ практически прекращается (рис. 12, а). Интересно отметить, что в некоторых экспериментах после введения ооцист в среду культивирования снижение ОВ до контрольного уровня происходило не за 5-6, а за 1-2 ч (рис. 12, б). Этот факт можно объяснить тем, что первичная культура перитонеальных макрофагов представляет собой несколько популяций макрофагов, имеющих разные физиологические потенции.
Представлены два типичных варианта временной зависимости, а -медленное и б - быстрое снижение выделения макрофагами активных форм кислорода.
На рис. 12, 13 интенсивность флуоресценции АФК-зависимого зонда в контрольных клетках принята за 1,0. Для того, чтобы понять насколько специфичен ответ (ОВ) макрофагов на соприкосноновение с ооцистами, была поставлена серия опытов с использованием мертвых ооцист. Важно было получить мертвые, но морфологически целостные ооцисты, поскольку жидкость внутри ооци-сты содержит продукты обмена спорозоитов и токсична для клеток в культуре (Eggleston et al., 1994). Поэтому была проведена серия опытов по подбору условий умерщвления ооцист без их разрушения.
Оказалось, что при культивировании макрофагов с убитыми нагреванием ооцистами ОВ практически отсутствует (нет разницы с незара-женными контрольными клетками (рис. 13)). Это подтверждает специфичность ответа макрофагов ОВ именно на живые ооцисты.
Обсуждение результатов исследования
Полученные нами данные о морфологии ооцист, находящихся в фагосомах переживающих в культуре макрофагов, хорошо согласуются с нашими исследованиями, где было показано, что в зараженном кишечнике крысы находятся как интактные, так и зараженные иммунокомпетент-ные клетки, содержащие различные стадии жизненного цикла паразита (Свежова,1997; Beyer et al., 2000). При этом ооцисты Cryptosporidium, заключенные в фагосомах, не претерпевали видимых морфологических изменений, в то время как другие стадии жизненного цикла паразита находились на разных этапах деградации. Кроме того, in vivo крайне редко наблюдали истинное заражение макрофагов (но не нейтрофилов и эозино-филов) криптоспоридиями, с образованием типичных для этого паразита экстрацитоплазматических паразитофорных вакуолей.
Выход иммунокомпетентных клеток хозяина в просвет кишечника можно объяснить как разрывом эпителия ворсинок, так и способностью макрофагов встраиваться в эпителий кишки (рис. 9). Разрыв ворсинок часто наблюдается при гиперинвазии C.parvum на светооптическом уровне (Fayer, Ungar, 1986; Tzipori, 1988; Current, 1989). Мы также часто видели такие «лопнувшие» ворсинки.
Выявление способности фагоцитов захватывать криптоспоридий в просвете кишечника представляется новой и очень интересной стороной изучения паразито-хозяинных отношений. Можно представить себе механизм такого фагоцитирования: паразиты, опсонизированные кишечными IgA антителами (их выделяют плазматические клетки миндалин и кишечных лимфоидньгх образований), становятся доступными для всех способных к фагоцитозу клеток иммунной системы хозяина, какие только смогут войти с ними в контакт. Но поскольку разрыв ворсинок кишечника характерен только для гиперинвазии, то и массовый выход иммунокомпетентных клеток в просвет кишки - явление достаточно редкое. Более интересна способность криптоспоридий образовывать нормальные паразитофорные вакуоли на макрофагах и, по-видимому, претерпевать полный цикл развития в этих клетках. На поверхности макрофагов в просвете кишечника мы наблюдали практически все стадии жизненного цикла C.parvum - трофозоиты, меронты, макрогаметы и ооцисты. Можно предположить, что Cryptosporidium, подобно другим споровикам, таким как Toxoplasma или Plasmodium, способен к переживанию или даже к размножению в макрофагах (лит. см. Бейер,1989).
Выявленная нами способность макрофагов в культуре легко фагоцитировать ооцисты была показана также и другими авторами (Martinez et al., 1992; Lawton et al., 1996). При заражениии культуры эксцистирован-ными из ооцист спорозоитами этим авторам удавалось получить развитие Cryptosporidium в макрофагах. Однако по окончании цикла развития вновь образовавшиеся ооцисты не эксцистировались и самозаражения культуры не происходило. Такие ооцисты фагоцитировались макрофагами и развитие паразита в культуре без дополнительного заражения останавливалось. Лавтон с сотрудниками (Lawton et al., 1996) утверждают, что при заражении суспензионной культуры моноцитоподобных клеток человека линии ТНР-1 можно использовать интактные ооцисты, однако на приведенных в их статье электронограммах показаны скорее уже фагоцитированные ооцисты, а не меронты и другие стадии жизненного цикла, как утверждают авторы. В другой работе (Martinez et al., 1992), где описывается развитие криптоспоридий в резидентных перитонеальных макрофагах мыши после заражения их ингактными ооцистами Cryptosporidium, электронограммы и вовсе не представлены, что не позволяет полностью доверять выводам этих авторов.
Кроме того, в литературе существуют косвенные доказательства участия макрофагов в транспорте ооцист криптоспоридий в организме хозяина. Они основываются на возникновении кишечной инфекции после внутрибрюшинного (не перорального) введения мышам ооцист С. parvum (Yang, Healey, 1994). Способность кишечных кокігидий мигрировать во внекишечные ткани в общем не удивительна. В обзорной работе Болл с соавторами (Ball et al., 1989) цитируют множество исследователей, которые показали, что парэнтеральное введение споруллированньгх ооцист, спорозоитов или мерозоитов кишечных видов Eimeria приводит к инфекции с нормальной кишечной локализацией. Присутствие С. parvum во внекишечных местообитаниях было отмечено Павласеком (Pavlasek,1984). Он обнаружил стадии развития С. parvum в сердце лабораторных мышей, а также в сердце и в крови телят. Другие авторы отмечают только лишь фагоцитоз отдельных ооцист резидентными макрофагами при поражении криптоспоридиями почечных канальцев черногорло-го вьюрка (Gardiner, Imes 1984). Накамура и Абе (Nakamura, Abe 1988) описали макрофаги из лёгких цыплят, заражённых криптоспоридиями, способные фагоцитировать паразита, а затем уходить в лёгочные капилляры. Вероятно, Cryptosporidium использует циркуляторную систему как путь миграции, потому что паразиты были найдены внутри кровеносных сосудов слизистой оболочки ободочной кишки (Gentile et al., 1987). Ин-тактные ооцисты C.parvum были описаны в фагосомах макрофагов нахо-дящихся в контакте с М-клетками Пейеровых бляшек кишечника (Marcial, Madara, 1986). В недавней работе на Toxoplasma gondii (Speer, Dubey, 1998) была показана способность этого родственного криптоспо-ридиям возбудителя размножаться во всех типах фагоцитов и в некоторых других клетках lamina propria кишечника зараженных мышей.
Таким образом, ооцисты С. parvum фагоцитируются резидентными перитонеальными макрофагами мыши в культуре, а не заражают их. Оказавшись в фагосомах макрофагов, ооцисты криптоспоридий сохраняют свою морфологическую целостность в течение нескольких суток.
На основании полученных нами данных и литературных источников есть основания предполагаеть, что транспорт паразита в организме хозяина происходит при помощи макрофагов. Полученные нами данные указывают на го, что ОВ при фагоцитозе ооцист Cryptosporidium макрофагами происходит лишь на первых этапах взаимодействия клеток, а именно, когда они находятся в непосредственном контакте друг с другом и, возможно, в первое время после завершения фагоцитоза паразита. Именно этим, по-видимому, и объясняется усиление ответа на действие fMLP со стороны макрофагов первого типа (содержащих как уже фагоцитированные ооцисты, так и ооцисты, находящиеся в контакте с поверхностью макрофага). При этом происходит суммирование ответов на контакт с ооцистами и на действие fMLP. В дальнейшем, по завершении фагоцитоза, ОВ в ответ на стимуляцию fMLP не отличается от ОВ незараженных контрольных клеток. Мертвые ооцисты, полученные нагреванием на кипящей водяной бане, не теряют своей морфологической целостности, однако их поверхность может претерпевать определенные химические модификации, благодаря которым ОВ макрофагов в ответ на такие ооцисты отсутствует.
Полученные данные еще раз подчеркивают, что взаимодействие макрофагов с ооцистами носит, по-видимому, рецепторный характер.
В многочисленных исследованиях было показано, что Toxoplasma gondii, Leishmania и Trypanosoma cruzi заражают макрофаги, не вызывая ОВ (лит. см.: Bogdan, Rollinghoff, 1999). Все они оказываются способными проникать в макрофаги, не активируя NADPH-оксидазу - фермент, ответственный за возникновение ОВ (лит. см.: Hall, Joiner, 1991). Кроме того, Leishmania и Trypanosoma cruzi способны активно подавлять ОВ уже после проникновения в макрофаг. Для этого вьппеназванные паразиты используют собственные липофосфогликаны, которые подавляют активность протеинкиназы С, необходимой для активации NADPH-оксидазы. (Mauel, 1996; Bogdan, Rollinghoff, 1998; Клюбин, Гамалей, 1997) У этих паразитов выявлены также собственные супероксиддисмутазы. Значительные количества собственных ферментов, нейтрализующих АФК, (супероксиддисмутазы, каталазы и глутатион-пероксидазы) выявлены у Toxoplasma gondii (Locksley, Klebanoff, 1983; Hughes et al., 1989), Eimeria bovis (Hughes et al., 1989) и многих других паразитических простейших и гельминтов (лит. см.: Hadas, Stankiewicz, 1996). Из ферментов, нейтрализующих АФК, в выделенных из ооцист спорозоитах C.parvum обнаружена в очень небольшой концентрации супероксиддисмутаза (Michalski, Prowse, 1991; Wack et al., 1994), и лишь в одном исследовании была выявлена относительно высокая активность каталазы (при этом активность супероксиддисмутазы в этом исследовании не измерялась) (Malek et al., 1996).
