Введение к работе
йКХУіММШСііі_ЦРС.йАШ4Ц_. Реализация клеточных программ про
лиферации, дифференцировки и' гибели, составляющих суть развития
любого многоклеточного организма, происходит на основе диффе
ренциальное экспрессии генома. Непременный этап регуляции ак
тивности генов - инициация транскрипции. Смисл этого этапа
состоит в регуляции Функционирования комплекса РНК-пслимеразы
дах-свяэываюаими транскрипционными факторами, специфически вза
имодействующими с регуляторними элементами промотора, которые
могут находиться на разном расстоянии от сайта инициации
транскрипции (места сборки комплекса РЯК-полимеразм) (Mitchell,
'Г.ііап, 19S9; Gill, Tjian. 1992j Pabo, Sauer, 1992).
Изменение транскрипционное активности генома в ответ на внесший стимул происходит в соответствии с типом клеток, на которые действует этот стимул. Поэтому специфичность транскрипционной регуляции - едва ли не самый интересный аспект ев изучения. Особенно nt-ибяекателышм прядсташляется исследование регуляции генов, продукты которых вовлечены в контроль разнообразных клеточных процессов в разных клеточных типах. Протоонкоген c-Fos - один иэ таких пэнов. Его продукт функционирует как компонент транскрипционного комплекса ДР-1, который в разных типах клеток выступает как регулятор нормальной пролиферации и диффе-ренцировкн, а также может участвовать в процессе неопластической трансформации (Ansel, Karin, 1932). Полифункциональность продукта гена c-fos определяет сложную и строгую регуляцию его экспрессии, я частности, осуществляющуюся на уровне транскрипции. В большинстве типов клеток транскрипция протоонкогена c-fos подавлена, но может быть быстро и кратковременно индуцирована большим спектром внеклеточных стимулов по типу индукции транскрипции "генов раннего откета" .
Вполне естественно предположить,' что механизмы контроля баэальяой экспрессии протоонкогена c-fos, а также способы его активации различаются в зависимости от типа клеток и Функции продукта гена c-fos. Интересной модельной системой для изучения специфичной регуляции транскрипции протоонкогена o-fos служит линии эмбриональное карциномы (тератокарциномы) мыши F9, способная к . дчффоренцировке in vitro под влиянием химических индукторов, экспрессия гена o-fos в недифференцированных клет-
- 2 -как этой линии подавлена., а в дифференцированных в направлении париетальной эндодермы она находится на високом уровне и имеет конститутивный характер (Lookett, Sleigh, 1887). При атом ряд экспериментальны!) данных указывает на то, что продукт гена c-fos относится к числу белков, участвующих в переключении клеток F8 на путь дифференцировки (HuHer, Wagner, 1B84j Edwards et al., 1SS8; Oshlma «t al., 1990). Поэтому механизм, поддерживающий транскрипцию гена o-fos в недифференцированных клетках F9 на низком базальном уровне, интересен и с точки зрения изучения клеточной специфичности регуляции промотора этого гена, и с точки зрения изучения молекулярных основ дифференцировки.
Цедн_и задачи , иссдедованиа., Цель предлагаемой работы
состояла в том, чтобы выявить специфические особенности регуляции транскрипции протоонкогена c-fos в клетках линии тератокар-циномы мыши їв. В соответствии с sthm были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1.Описание клеточной модели: отработка методики культивирования клеток эмбриональной карциномы мыши линии F6 и индукции их дифференцировки в направлении париетальной эндодермы; сравнительное научение фенотипическик характеристик недифференцированных и дифференцированных клеток линии F9.
2.Изучение функционирования промотора протоонкогена c-fos, находящегося в составе индикаторной плазмиды fosCAT,' В клетках линии F9 в различным экспериментальных условиях.
3.Анализ ядерных экстрактов клеток эмбриональной карциномы, линии F8 методом ретардации олигонуклеотидных проб в полиакри-ламидном геле с целые выявления ДНК-связывающих "белков (или их комплексрв) - вероятный участников регуляций активности o-foa-npoмотора в этих клетках.
Научная нйвизна..д,,ьау.чьа-тпракти,чег;кая, ,ибнно.сть....р,аботы. ?*-бота содержит новые данные, .касающиеся особенностей регуляции функционирования промотора протоонкогена c-fos в клетках линии тератокарциномы маши F9 .
показано, что промотор протоонкогена c-fos в недиФФеренци-'рованньж клетках F8.находится под негативным контролем со сто-. роны хороткйживувдих белков.
'Обнаружено, что ати белки не связываются непосредственно с промотором, а негативно контролируют функцию транскрипционних Факторов, его активирующих, а именно, белков, способных вэаймо-
действовать о последовательностями регуляторних элементов' DSB, TRB, CRS. Эти белки выявлены в ядерних екстрактах недифференцированных клеток F9 как образующие специфические комплексы с соответствующими ояйгонуклйотидними пробами в условиях ретардации в1 геле.
Таким образам впервые показано, что низкий баэальный уровень экспрессии прокотора гена «-fos в недифференцированных клетках ?9 обусловлен не отсутствием транскрипционных аКТИВаТО-ров і а присутствием короткоживуиих белков, которые негативно контролируют Функции активаторов.
Показано также, что промотор протоонкогена c-fos в недифференцированных клетках F9 не активируется агентами, которые в других типах клеток индуцируют экспрессию этого гена как "гена раннего ответа"j индукция дифференцировки клеток F8 ретиноевой кислотой и ди6утирил-ц(ШФ является физиологическим способом активации промотора гена c-fos в этик клетках. Этот факт, а также то, что обнаруженные закономерности негативного контроля промо-'ора гена c-fon специфичны для недифференцированных клеток F8 позволяют предположить значение этик закономерностей для поддержания недифференцированного состояния этих клеток.
Полученные данные углубляют понимание нормальной Функции протоонкогена c-fos, . механизма регуляции его транскрипции и молекулярных основ дифференцировки. Матері,алы диссертации используются в лекционном спецкурсе кафедры эмбриологии Санкт-Петербургского Государственного университета "Молекуляр-но-генетические основы' биологии развития".
. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на
двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ "Организация генома и регуля
ция активности генов" (Иркутск, 1989), на совместном со
ветско-финском симпозиуме "Sign&l transduction and cell
differentiation" (Суздаль, 1991), на совместном советско-бри
танском симпозиума "Структура и функция генома" (Лондон,
1991), на семинарах в Институте цитологии РАН. !
ЦуЗАИлации_По теме диссертации опубликовано 4 работы.
0-бЛйИ_Еаб_о_іі!и_Диссерт'ация изложена на ,стр. машинописно
го текста и состоит из введения, обзора литературы, описания
материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, вы
водов И списка литературы, содержание названий. Работа ил
люстрирована рисунками и'одной таблицей.
_ 4 -
МАТЕРИАЛЫ И МЄТОДЦ ИССЛЕДОІШІИЯ Объектом исследования служили клетки линии тератокарциноми иыыи F9 из Банка клеточных культур Института цитологии Российской йкадемии наук.
Kyb.nmilp.QJ6^111iLJO^l^JH_JllU^ л Є Ї К И
культивировали в среде DMEM (Oibco) с добавлением 10Х эмбриональной сыворотки крови коров на пластиковых чаыкак Петри, покрытых желатином (0,1 водный раствор желатина, Sigma). Культуру перс-сегали каждые двое суток с исходной плотностью посева не более 5000 клеток на кв.см. Индукцию дифференцировки в направлении париетальной эндодермы проводили по методу Стрмкланда с соавторами (Strickland et al., 1В78). Для этого клетки высевали в дозе 5000 клеток на кв.см и через сутки меняли среду на сье-жую, содержащую 1 і'Н ретиноевой кислоти (РК) (Sigma). Затем меняли среду каждые двое суток. На четвертке сутки кроме РК в среду добавляли 100 М дибутнрил-цАМФ (дб-цйМ*) (Serva). Общая продолжительность обработки индукторами составляла в разных опытах 6-10 суток.
До-лдНіі^іг_ашхціщна с к ьа_хаткіздсхкш_-кд ё.ха&.-~Дл я выявления маркера клеточной поверхности недифференцированных клеток тератокарцином гликопротеина SSEA-1 Использовали моноклональные антитела ТЕС-01 (Dr&ber, Fokorrm, 1S84), любезно предоставленные д-ром П.Драбером. Для построения кривых роста клетки сеяли в исходной плотности 5000 на кв.см и ежесуточно подсчитывали количество клеток. На отрезке времени, соответствующем логарифмической Фазе роста культуры, определяли времн удвоения популяции (Shaeffer, 1978). Насыщающую плотность определяли как максимальное число клеток на кв.см поверхности после завершения логарифмической фазы роста культуры, Исследование распределения клеток по содержанию ДНК проводили с помощью проточного цитоф-люориметра (Розанов, 1S87). Определение величины эффективности клонировании клеток на субстрате проводили, высевая 100 клеток на чашку площадью 20 кв.см, и через 7-Ь суток подсчитывали долю, которую составляло число выросших клонов от числа посеянных клеток. Оценку эффективности клонирования клеток в полужидком afape проводили по методу Млкферсона (Huopherson, 1373).
Ші&диа . акспрессии индикаторных пладмид.. Трансакцию гиаз-мндной ДНК в клетки проьодили кальций-Фосфатным способом
{Поспелова, 1991). Анмиэ активности, продукта репортерноге гена Л*аранф|*мйкол»ц*тн*тр»нсф«р|1эц (Ср.?) провадили цо методу Горман (Ооглагь 1996) черв? 48 часов после трансФенции. Для этого из транвфецирзваиных клеток получали белковые вкстракты методом аамиражийання-огтаивания а 0,28м трис-НСі, рн 8,0, тем же буфером уравнивали седеркани» белка в провчи, определенное гіо Брвд-Форду {Biadfeid, 1993) и проводили реакции ацетияироэания С*"' -кдорацфеиикояа. S*t«m вистрагировади «с* его формы етилацетатом, подвергали пробы восходящей тонкослойной яраматографик и определяли долів ацетйлированного клорамфеникояа' после высушивания кройатограФичеакой пласгийкй н экспонирования ее с рентгеновской пленкой, В некоторыя Случая» проводили дот-гивридизацйя РЙК транефецйрэваннил клеток, выделенной по методу Вирнбойма (ВіїгпЬоія, І898), о меченым Р Фрагментом гена СПГ.
Аиадна ДНК-.свя;аьіваааеДі-&к.ти8ности, белкоа ядйрннк акстваи=
toe. Ядерные экстракты получали по методу Шрайбера с'соавт.
(Behreibesr efc al., 1889) и «ранили при -70^0. содержание белка
s пробах ураанивАли, определяя его по методу Брэдфорда
(Bradford,- 1983). 8 качестве печеных радиоактивным Фосфором
про? использовали синтетические двуцепочечные олигонуклеоти'ды,
содержание последовательности элемента двоииой симметрии
o-fo9-npo«Qfopa DSE (-ЗІ7;-їв8), цйКФ-зависимого элемента
d-fos-npoMOTopa 0В1 (-в2;-54), последовательность TPft-эавйсимо-
го їлемента ТНК из промотора гена коЛлагеназы и последователь
ность сайта связывания" транскрипционного Фактора Е2? из промо
тора протоонкогена о-ауо. Реакцию ДНК-евйзнвания проводили при
Комнатной температуре, используя в качестве неспецифического
конкурента роІуА-^оІуи-сополимер. оэраздвавшиеся ДНК-белковые
комплекси отделяли от свободной меченой пробы, путем электрофо
реза реакционной смеси в 4Я полиакрила'мнднем геле, благодари ик
снижённоЛ электрофоретической подвижности (Метод ретардации в
геле). . і
Похожие диссертации на Регуляция функционирования промотора протоонкогена C-FOS в клетках линии тератокарциномы мыши F9
