Введение к работе
Актуальность темы исследования. Воздействие противоопухолевых цитостатнков на клетки может приводить к двум взаимосвязанным процессам: с одной стороны, к нарушению структуры и функции макромолекул клетки, в первую очередь ДНК, с другой- к формированию клеточного ответа на ДНК-повреждающее стрессовое воздействие, выражающегося в координированных изменениях экспрессии генов. Ключевую роль в регуляции ответа клетки на повреждение ДНК играет белок опухо-лесупрессор р53 (Kastan et al.,1991). В зависимости от исходного генетического статуса и фенотипических особенностей клетки, а также характера стрессового воздействия, клеточный ответ на цитотоксические препараты может заключаться в остановке клеточного цикла в фазах Gi или G2/M, в программированной клеточной гибели (Lowe et al., 1993; Lane et al., 1994), индукции дифференцировки (Rappa et al., 1990; Aloni-Grinstein et al., 1995). В клетках с нарушенной регуляцией пролиферации и высокой генетической нестабильностью при длительном воздействии цитостатнков возможно формирование множественной лекарственной устойчивости (Gottesman, Pastan, 1993).
Характерной особенностью ответа клетки на цитостатики, также как и самого феномена лекарственной устойчивости, является плейотропность изменений фенотипа, обусловленная комплексными изменениями в экспрессии генов. Существуют данные об изменении в устойчивых к цито-токсическим агентам клетках экспрессии генов дифференцировки ( Bates et al. , 1989; Stromskaya et al., 1995), ДНК-топоизомеразы II (Beck et al. ,1990), ферментов детоксикации ксенобиотиков (Akman et al.,1990; Nakagawa et al. , 1990), цитокинов и генов главного комплекса гистосо-вместимости (Scheper et al., 1991; Zyad et al., 1994).
Изучение ответа иммунокомпетентных клеток на воздействие цито-токсических противоопухолевых препаратов представляет двоякий
-4-интерес. Во-первых, это удобная модель для изучения взаимодействия стресс-индуцибельных защитных механизмов клетки с системой тканеспецифической экспрессии генов. Во-вторых, изменение зффекторных функций клеток иммунной системы при воздействии противоопухолевых препаратов может существенно влиять на динамику развития иммунного ответа организма на опухоль .
Согласно литературным данным, большинство антинеопластиче-ских препаратов обладает иммуносупрессивным действием (Kempf, Mitchell, 1989). Однако для отдельных препаратов, в частности, противоопухолевого антибиотика адриамицина (АД) показана стимуляция активности NK-киллеров (Nanbara et al., 1991) и лимфокин-активированных киллеров (Ehrke, Gautam, 1991 ) как в клинических исследованиях, так и в системах in vitro. Кроме того, показана индукция дифференцировки клеточных линий гемолоэтического происхождения в культуре под воздействием АД (Rappa et al. , 1991; Hoffman, Newlands, 1991; Ge, 1994).
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении изменений тканеспецифической экспрессии генов в процессе развития клеточного ответа на противоопухолевый антибиотик АД и выявлении возможной зависимости этих процессов от взаимодействия препарата с внутриклеточными мишенями. В качестве объекта для исследований нами были выбраны постоянные В-клеточные линии, продуцирующие иммуноглобулины (ИГ) . Выбор объекта объяснялся тем, что регуляция экспрессии генов ИГ- наиболее хорошо охарактеризованная модель тканеспецифической экспрессии генов в клетках иммунной системы. Наличие нескольких вариантов этих линий, обладающих фенотипом множественной лекарственной устойчивости, открывало возможности для сравнительного изучения упомянутых процессов в клетках, различающихся по чувствительности к цитотоксическим препаратам. Кроме того, мы попытались проследить судьбу индуцибельных изме-
нений в экспрессии генов в процессе формирования устойчивого фенотипа при селекции клеток на устойчивость к АД, а также выявить возможную корреляцию между изменениями в тканеспецифической экспрессии генов и наличием конкретных механизмов лекарственной устойчивости в клетках отселектированных сублиний. Конкретные задачи исследования состояли в следующем:
-
Проанализировать изменения синтеза ИГ, индуцированные АД в клетках мышиных миелом (гибридом), конститутивно продуцирующих ИГ и различающихся по устойчивости к цитотоксическим препаратам.
-
Выявить механизмы изменений синтеза ИГ в присутствии АД.
-
Изучить процессы клеточной гибели под воздействием АД и проследить возможную связь между изменениями экспрессии генов ИГ и индукцией апоптоза в клетках чувствительных и устойчивых вариантов.
-
Провести сравнительный анализ экспрессии генов ИГ , mdrl и активности ДНК-топоизомеразы II в различных сублиниях гибридо-мы , отселектированных на устойчивость к бромистому этидию (БЭ) и АД.
Научная новизна работы. Работа содержит новые данные относительно механизмов воздействия противоопухолевого препарата АД на постоянные В-клеточные линии. В частности, мы показали значительное усиление конститутивного синтеза ИГ в клетках В-клеточных гибридом и миелом. Ранее нами было показано усиление индуцибельного синтеза ИГ лимфоцитами периферической крови человека в присутствии АД( Дав-тян и др., 1993). Кроме того, мы показали, что усиление экспрессии генов ИГ под влиянием АД предшествует апоптозу (программированной клеточной гибели) в клетках как чувствительных к ядам, так и обладающих фенотипом множественной лекарственной устойчивости клеток миелом. Мы обнаружили также различия в биохимических механизмах апоптоза в клетках устойчивой и чувствительной линий. Если в клетках
чувствительной миеломы Sp2/0 процесс был независим от содержания внутриклеточного кальция и был ассоциирован с активацией как Са2+-К^—эндонуклеазы. так и кислой катионнезависимой эндонуклеазы, то в клетках миеломы SpEBR-5 с фенотипом МЛУ, подвергающихся апоптозу в присутствии АД. мы зафиксировали лишь Са2+-Мд2+-зависимую эндо-нуклеазную активность. Нам удалось показать, что изменения в экспрессии генов ИГ, индуцированные кратковременной обработкой клеток АД, сохраняются в процессе селекции клеток на устойчивость к АД. Нам удалось установить, что усиление экспрессии ИГ в клетках гибридом, устойчивых к АД, коррелирует с наличием определенного механизма избирательной устойчивости к АД, а именно, с негативной регуляцией активности ДНК-топоизомеразы II, но не с экспрессией генов mdr.
Практическая ценность работы. Полученные нами результаты касаются малоисследованных аспектов противоопухолевого и иммуномоду-лирующего действия АД - препарата, широко применяющегося в клинической практике, и потому могут представлять интерес для практической онкологии. В частности, это вывод об индукции апоптоза в культивируемых клетках как одном из механизмов антинеопластического действия АД. Кроме того, возможные изменения В-клеточного иммунного ответа в организме в процессе химиотерапии АД также могут представлять интерес для клинической практики. Предложенная нами модель изучения влияния АД на В-клетки in vitro может служить основой для исследования воздействия препарата на эффекторные функции других клеток иммунной системы, принимающих участие в противоопухолевом иммунном ответе, в частности естественных и лимфокин-активированных киллеров, что весьма важно для совершенствования терапевтических подходов в онкологии. Наконец, наши результаты могут представлять интерес и для гибридом-ной техноглопш, поскольку получение гибридом и (или) их селекция в присутствии АД может способствовать получению вариантов гибридом с повышенной продукцией специфических антител .
Лпробация работы. Материалы диссертации были представлены на двустороннем советско-финском симпозиумепо морфологии клет-ки(Москва,1990), международной конференции "Современные направления терапии рака"(Тайпей,Тайвань,1994). ХШ-м Собрании Европейской Ассоциации по исследованию рака (Берлин, ФРГ.1994). на всероссийском совещании "Биология клетки в культуре"(Санкт-Петфбург,1995), а также на семинарах в Институте Цитологии.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.
Структура и объем диссератации. Диссератация содержит разделы: введение, обзор литературы, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Объем работы составляет 141 страницу. Список литературы включает 257 работ отечественных и зарубежных авторов.
Похожие диссертации на Влияние адриамицина на синтез иммуноглобулинов в клетках мышиных В-клеточных линий, различающихся по устойчивости к цитотоксическим препаратам
