Введение к работе
Актуальность исследования. Холинотропные препараты - пилокарпин и атропин – алкалоиды с противоположным действием на вегетативную нервную систему и секрецию слюнных и других желёз: м-холиномиметик (пилокарпин) стимулирует секреторную деятельность, м-холиноблокатор (атропин) - угнетает (Levin, 1992; Busch, Borda, 2007). Изучение действия нейротропных веществ (лекарственных препаратов, фосфорорганических и карбаматных соединений, используемых в качестве пестицидов и боевых отравляющих веществ антихолинэстеразного действия), воздействующих на мускариновые холинореактивные системы, актуально в связи с их широким применением в медицине, военной промышленности и сельском хозяйстве (Нежинская и др., 2008 а и др.).
Индикатором воздействия на субклеточном уровне служат изменения в интерфазных ядрах клеток человека и животных (Тимошевский, Назаренко, 2005). Уникальный модельный объект для анализа изменений функциональной активности интерфазных хромосом представляют политенные хромосомы (ПХ) клеток слюнных желез личинок двукрылых насекомых, постоянно находящиеся в интерфазном состоянии (Кикнадзе и др., 1996). Наличие м-холинергической нейромедиации у Chironomidae (Beauvais et al., 1999; Turberg et al., 1999) делает ПХ их слюнных желез, высокочувствительных к воздействию холинотропных препаратов, моделью для выявления их цитогенетических эффектов, а личинок - тест-системой для оценки действия этих препаратов на организменном, клеточном и субклеточном уровнях. Сведения о влиянии холинотропных препаратов на функциональную активность ПХ клеток слюнных желёз хирономид разрозненны, хотя цитогенетические эффекты пилокарпина изучались, начиная с 60-70-х годов (Clever, 1969; Beerman, 1973). Установлено, что под действием пилокарпина белковый секрет из слюнной железы полностью выводился (Mhr et al., 1980), введение атропина в организм личинок, наоборот, сопровождалось уменьшением секреции (Grossbach, 1977). Цитогенетические эффекты пилокарпина и атропина на ПХ хирономид не сравнивали.
Существенными недостатками подавляющего большинства проводимых ранее исследований цитогенетических эффектов лекарственных препаратов на ПХ Chironomus были визуальная или с ограниченным использованием морфометрических показателей оценка изменений активности ПХ, часто без статистической обработки результатов, и отсутствие единых стандартных подходов к условиям проведения эксперимента, что препятствовало сопоставлению данных разных авторов. Не была известна индивидуальная реакция особей на основе естественного генетического полиморфизма, не установлено - обратимы или необратимы изменения активности функционально значимых участков ПХ под действием заведомо токсических концентраций. Между тем, сравнительный анализ отклика ПХ под влиянием холинотропных препаратов на основе использования современной обработки данных позволит не только оценить ответную реакцию ядерного аппарата на их воздействие, расширив представления о функционировании интерфазных хромосом в целом, но и усовершенствовать методические подходы к анализу цитогенетических эффектов лекарственных средств.
Цель исследования: установить характер и степень воздействия холинотропных препаратов на функционирование политенных хромосом слюнных желез личинок Chironomus plumosus in vivo в остром эксперименте.
Задачи исследования:
1. Оптимизировать методические подходы к оценке действия лекарственных препаратов на основе анализа их цитогенетических эффектов, выявить особенности функциональной активности ПХ клеток слюнных желёз личинок Ch. plumosus при акклимации к лабораторным условиям и установить границы изменчивости и процент работающих активных участков ПХ в контроле.
2. Установить особенности влияния холинотропных препаратов на личинок с различными генотипическими характеристиками.
3. Изучить динамику работы функциональных участков ПХ и сравнить цитогенетические эффекты холинотропных препаратов в остром периоде.
4. Проанализировать цитогенетические эффекты холинотропных препаратов с противоположным действием на секрецию при их комбинированном влиянии.
5. Оценить обратимость изменения активности функционально значимых участков ПХ под воздействием заведомо токсической концентрации пилокарпина.
Научная новизна. Впервые на уровне функционирования интерфазных хромосом доказано доминирование м-холиноблокатора - атропина по сравнению с агонистом - пилокарпином, известное ранее на уровне функционирования м-холинорецепторов, что, наряду с универсальностью холинергической нейромедиации у эукариотических организмов, позволяет эффективнее использовать возможности холинергических структур разных уровней организации и прогнозировать ответную реакцию ядерного аппарата на воздействие холинотропных веществ. Расширены представления о функционировании интерфазных хромосом: впервые показано, что неоднородность в активности функционально значимых участков ПХ между группами особей с разными генотипическими характеристиками, проявляющаяся в период акклимации личинок, существенно снижена под воздействием токсиканта, на примере действия холинотропных препаратов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Установлено, что уровень активности специфических участков ПХ зависит от числа гетерозиготных инверсий в кариотипе (активность BR2G уменьшалась с увеличением числа инверсий в кариотипе от 1.88 при одной инверсии до 1.59 при трех.), что свидетельствует о работе генома как единой сбалансированной системы. При этом под воздействием токсикантов такая зависимость существенно снижена. Впервые показана динамика изменения функциональной активности ПХ Ch. plumosus под действием препаратов противоположного действия на секреторную активность. Установленные закономерности действия холинергических лигандов - антагонистов на секрецию желёз используются на спецкурсе по физиологической экологии животных кафедры физиологии человека и животных СГУ им. Н. Г Чернышевского.
Впервые представлены каталоги известных к настоящему времени пуфов de novo, как по данным ряда авторов, так и собственным для Ch. plumosus, что позволяет проводить мониторинг пуфинговой активности у этого вида.
Оптимизирована методика цитогенетического тестирования лекарственных препаратов на ПХ: впервые разработана десятибалльная шкала оценки морфофункциональных изменений личинок; рекомендовано изменение условий содержания личинок Chironomus в условиях острого эксперимента; доказано, что ведущим показателем служит активность NО. Обосновано отсутствие необходимости учета генотипических комбинаций в связи со снижением разброса значений функциональной активности ПХ в экспериментах на генотоксичность у особей с разными генотипическими характеристиками. Методические подходы по использованию личинок Chironomus как тест-системы в цитогенетических исследованиях внедрены в спецкурсы экологической генетики кафедры генетики и гидробиологии кафедры морфологии и экологии животных СГУ им. Н. Г Чернышевского.
Апробация работы. Результаты исследования апробированы на научно-практической конференции «Экологические проблемы урбанизированных территорий» (Елец, 2007 г.); XXI Любищевских чтениях «Современные проблемы эволюции» (Ульяновск, 2007 г.); Международной научной конференции (Астрахань, 2007 г.); XIII Международной школы-конференции молодых учёных «Биология внутренних вод» (Борок, 2007 г.); 9-ой конференции «Водные экосистемы, организмы, инновации – 9» (Москва, 2007 г.); III Всероссийской конференции по водной токсикологии (Борок, 2008 г.); Международной научно-практической конференции (Ставрополь, 2008 г.); научных конференциях аспирантов и молодых ученых (Саратов, СГМУ, 2007-2008 г.); Международной научной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 2009 г.).
Публикации. По теме диссертационного исследования опубликованы 14 работ, из них две – в реферируемых научных журналах списка ВАК; три находятся в печати.
Личный вклад автора включает проведение экспериментов, обработку данных и алгоритмическую реализацию разработанных подходов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Объём работы составляет 155 страниц, содержит 18 таблиц и 39 рисунков. Список литературы включает 194 источника, в том числе 83 на иностранном языке.
