Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Аналитический обзор литературы 13
1.1. Ранние изменения при ишемии головного мозга 13
1.2. Воспаление и глиальная реакция 15
1.2.1. Воспаление 16
1.2.2. Глиальная реакция 20
1.3. Реорганизация ткани после ишемического инсульта. Ограниченная репарация в головном мозге . 24
1.4. Зона ишемической полутени 29
1.5. Современные методы лечения инсульта 30
1.5.1 Улучшение перфузии 31
1.5.2 Нейропротекция 32
1.5.3. Клеточная терапия инсульта 34
1.5.4 Мезенхимные стволовые клетки как агент клеточной терапии ' 39
Глава 2. Материал и методы исследования 49
2.1. Эксперименты in vitro 49
2.1.1 Выделение и культивирование мезенхимных стволовых клеток из стромы костного мозга крыс 49
2.1.2. Фенотипирование мезенхимных стволовых клеток крыс 49
2.1.3. Дифференцировка in vitro в ортодоксальных направлениях 50
2.1.4. Дифференцировка in vitro в нейрональном направлении 53
2.1.5. Окрашивание мезенхимных стволовых клеток крыс флуорохромом РКН 26 53
2.2. Эксперименты in vivo 54
2.2.1. Введение МСК в мозг интактным животным 54
2.2.2. Моделирование экспериментального ишемического инсульта головного мозга 54
2.2.3. Введение МСК животным с экспериментальным инсультом 57
2.2.4. Фиксация тканей головного мозга 57
2.2.5. Выявление флуоресцентно меченых МСК в тканях головного мозга 57
2.2.6. Морфологический анализ тканей головного мозга 58
2.2.7. Иммуногистохимическое окрашивание срезов головного мозга 58
2.2.8. Морфометрическая оценка объема дефекта головного мозга и количества сосудов в поврежденном и неповрежденном полушарии 61
2.2.9. Поведенческое тестирование животных в водном лабиринте Морриса 62
Глава 3. Результаты исследований 63
3.1. Характеристики МСК крысы in vitro 63
3.1.1. Фенотипирование МСК 63
3.1.2. Дифференцировка МСК в ортодоксальных направлениях in vitro 64
3.1.3. Дифференцировка MCK в нейрональном направлении in vitro 67
3.1.4. Окрашивание клеток флуорохромом РКН 26 69
3.2. Характеристика головного мозга после локального введения МСК в мозг интактных крыс 70
3.3. Морфологическая характеристика головного мозга крысы после экспериментального ишемического инсульта 76
3.3.1. Распределение меченых флуорохромом РКН 26 клеток в ткани мозга 76
3.3.2. Характеристика структуры головного мозга ложнооперированных животных 78
3.3.3. Характеристика структуры головного мозга после окклюзии средней мозговой артерии (группа контроля) 79
3.3.4. Характеристика структуры головного мозга после окклюзии средней мозговой артерии
(группа клеточной терапии) 108
3.3.5. Морфометрическое исследование головного мозга 127
3.3.6. Поведенческое тестирование животных 130
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 132
Выводы 153
Список работ, обубликованных по теме диссертации 154
Список литературы
- Реорганизация ткани после ишемического инсульта. Ограниченная репарация в головном мозге
- Дифференцировка in vitro в ортодоксальных направлениях
- Дифференцировка MCK в нейрональном направлении in vitro
- Характеристика структуры головного мозга после окклюзии средней мозговой артерии (группа контроля)
Введение к работе
Клеточные технологии в настоящее время позволяют разрабатывать принципиально новые подходы для лечения ряда заболеваний, сопровождающихся необратимыми повреждениями тканей и органов. В качестве агентов для клеточной терапии могут быть использованы эмбриональные и фетальные стволовые клетки, клетки пуповинной крови, а также стволовые клетки взрослого организма [2, 75, 238, 177, 154, 173, 143, 171].
Первоначально исследования проводили на плюрипотентных эмбриональных стволовых клетках (ЭСК). Однако к тому времени, когда были получены первые линии ЭСК, появились свидетельства существования стволовых клеток (СК) взрослого организма. За последнее десятилетие эти СК были обнаружены даже в тех тканях, в которых, как считалось, не происходит самообновления и репарации, например, в сердце и головном мозге [20, 19, 64].
Одним из видов СК взрослого организма являются мезенхимные стволовые клетки (МСК). Их основным источником является костный мозг. В настоящее время разработаны и апробированы методики выделения МСК, их дальнейшего культивирования и наращивания in vitro до необходимого количества с сохранением свойств [14, 88, 28, 218, 216, 26, 29, 169, 299]. Это позволяет использовать в клеточной терапии аутологичные МСК и избежать проблем с иммунной совместимостью трансплантата и реципиента.
Экспериментально доказано, что МСК - это мультипотентные клетки, способные дифференцироваться in vitro в остеогенном, хондорогенном и адипоцитарном направлениях [123, 124, 122, 216].
При более углубленном анализе была установлена способность МСК дифференцироваться в кардиомиоцитарном и миоцитарном направлениях [217, 126]. В экспериментах с перевязкой коронарной артерии на модели инфаркта миокарда в нашем научном коллективе изучено влияние
7 трансплантации МСК на течение патологического процесса в сердце. Установлено, что введение МСК ускоряет течение воспалительной реакции и повышает васкуляризацию зоны ишемического повреждения [21].
На основании полученных в недавнее время данных о способности МСК дифференцироваться in vitro в нейроны, астроциты и олигодендроциты [192, 29, 26, 57, 299] были предприняты попытки использования МСК для лечения нейродегенеративных заболеваний и повреждений центральной нервной системы [159, 284, 11, 15, 287, 174, 288, 60, 195, 196].
Известно, что одним из самых распространенных заболеваний человека считается ишемический инсульт головного мозга. В большинстве развитых стран он занимает 2-3 место в структуре смертности, и первое место среди причин утраты трудоспособности. Около 10 % больных после инсульта остаются инвалидами. Пост-инсультные осложнения связаны с необратимой потерей нервной ткани после эпизода инсульта [5].
Головной мозг, в отличие от других органов, обладает особенностями структурно-функциональной организации, что в первую очередь объясняется существованием внутримозговых барьеров. В экспериментах на животных проведены трансплантации клеточного материала различных типов (фетальных нейронов головного мозга, фетальных нейронов, культивированных in vitro в нейросферах, а также сингенных или ксеногенных МСК) как непосредственно в место повреждения головного мозга [12, 17, 53, 175, 285], так и системно в кровь [104, 171, 73]. Полученные данные разноречивы. Ксеногенные трансплантаты, введенные непосредственно в мозг, подвержены иммунной реакции отторжения, при введении в кровь клетки могут придти к месту повреждения только при раскрытии гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Для экспериментального изучения действия МСК на головной мозг мы использовали модель инсульта, вызванного окклюзией средней мозговой артерии (ОСМА).
Эта модель имеет несколько особенностей, делающих ее весьма удобной для морфологического и морфометрического анализа изменений, происходящих в нервной ткани при внутривенной трансплантации МСК. Повреждения головного мозга при ее применении вызывают ишемический инсульт. Модель ОСМА дает стабильные результаты, у животных повреждаются одни и те же структуры головного мозга, при этом получаемое повреждение имеет значительные размеры [22]. Использование данной модели позволяет оценить некротический очаг, его очищение и образование рубца, а также проследить изменения в зоне ишемической полутени. Последнее особенно важно, поскольку граничащая с повреждением зона, в которой не нарушено кровоснабжение, подвергается негативному воздействию из-за происходящих в ишемическом очаге патологических процессов. За счет повреждения и гибели клеток в области ишемической полутени размер поврежденного в результате инсульта участка мозга может значительно увеличиваться. Изучение изменений, происходящих в этой области, и влияния на нее трансплантированных клеток является важной задачей при разработке методов клеточной терапии.
Проведенные на данный момент единичные исследования действия стволовых клеток на некротический очаг не охватывают весь спектр проблем, связанных с применением этого нового подхода для лечения инсульта. Не установлены механизмы действия МСК на поврежденную ткань, способы их проникновения в мозг при внутривенной трансплантации и распределение введенных клеток в мозге. Неизученными остаются динамика деструктивных и репаративных процессов в нервной ткани, происходящих на фоне действия введенных МСК, не проанализированы морфологические изменения на границе некротического очага в области ишемической полутени.
9 Цели и задачи исследования
Целью данной работы являлось изучение влияния трансплантации сингенных МСК на головной мозг при экспериментальном ишемическом инсульте у крыс.
Для достижения поставленной цели работы были сформулированы следующие экспериментальные задачи:
Выделить и охарактеризовать мезенхимные стволовые клетки крысы, выяснить потенции МСК к дифференцировке в нейрональном направлении in vitro и in vivo
Изучить морфологические изменения в головном мозге крысы при ишемическом инсульте
Изучить локализацию сингенных донорских МСК в поврежденном мозге при внутривенной трансплантации
Изучить морфологические изменения в головном мозге крысы при ишемическом инсульте после внутривенной трансплантации МСК
10 Основные положения, выносимые на защиту
МСК крысы способны к дифференцировке в направлении нейронального ряда in vitro. При локальном введении МСК в интактный головной мозг крысы не выявлено дифференцировки трансплантированных клеток в нейроны
МСК, введенные внутривенно на четвертый день после операции, имеют тропизм к поврежденной зоне и способны проникать через поврежденный ГЭБ
Внутривенное введение МСК ускоряет процессы асептического воспаления и образования рубца
Трансплантированные в кровеносное русло МСК стимулируют пролиферацию клеток в субэпендимной зоне латеральных желудочков головного мозга
Внутривенная трансплантация МСК оказывает нейропротекторное и ангиогенное воздействие на зону ишемической полутени после окклюзии средней мозговой артерии и способствует уменьшению объема повреждения
11 Научная новизна работы
Впервые получены данные о действии МСК на клетки головного мозга, не располагающиеся в непосредственной близости к очагу ишемии. Экспериментально показано, что при внутривенном введении МСК менее выражена диффузная гибель клеток мозга в ответ на ишемию.
Экспериментально зарегистрировано распределение внутривенно введенных МСК в субэпендимной зоне латеральных желудочков мозга после ишемического инсульта.
Впервые экспериментально продемонстрировано ускорение процессов асептического воспаления и образования глиального рубца в головном мозге после инсульта и трансплантации МСК в кровоток животного.
Впервые выявлено сохранение морфологической структуры хвостатого ядра и сосудистого сплетения после ОСМА в случае введения МСК в кровоток животных.
Показано уменьшение степени выраженности такого постинсультного осложнения, как расширение ипсилатерального желудочка головного мозга.
Теоретическое и практическое значение работы
Результаты диссертационного исследования могут быть использованы для дальнейшего изучения процессов репарации при различных видах повреждений и заболеваний головного мозга, а также исследования участия в восстановительных процессах стволовых клеток взрослого организма. С практической точки зрения, результаты работы могут служить основой для разработки нового терапевтического подхода для лечения нарушений мозгового кровообращения с помощью внутривенного введения МСК.
Апробация работы
По теме диссертации опубликовано 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК, а также в журнале "Brain Research". Основные положения работы доложены и обсуждены на международной конференции
12 общества клеточных терапевтов "International Society for Cellular Therapy" (Vancouver, Canada, 2005), на международной конференции общества клеточных терапевтов "International Society for Cellular Therapy" (Berlin, Germany, 2006), на международной конференции общества клеточных терапевтов "International Society for Cellular Therapy" (Sydney, Australia, 2007), на Британско-Российском совещании "Stem cells: Policy, Research, and Innovations. European Union - Russian Federation Perspectives." (Москва, 2007), на Всероссийском симпозиуме "Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии" (Москва, 2007 г.), Всероссийской научной конференции "Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении" (Москва, 2007).
Объём и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов, заключения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 180 страницах машинописного текста и иллюстрирована 55 рисунками и 3 таблицами.
Реорганизация ткани после ишемического инсульта. Ограниченная репарация в головном мозге
После ишемического инсульта в поврежденном участке мозга происходит массивная реорганизация ткани. По-видимому, это требуется для отграничения поврежденного участка от незатронутой ткани, что в какой-то степени способствует восстановлению нормальной архитектуры мозга. Важным условием такой перестройки является изменение взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом. Молекулы, участвующие в перестройке внеклеточного матрикса, можно отнести к трем группам: протеазы матрикса, молекулы самого матрикса и интегрины. Эти три категории молекул дают клеткам возможность запустить классический каскад репарации поврежденной ткани и образования рубца после того, как будет убран клеточный дебрис.
В головном мозге, в отличие от других органов, в реорганизации поврежденной ткани и образовании рубца участвуют глиальные клетки (астроциты и микроглия). Для того чтобы они могли изменять свою форму, пролиферировать и мигрировать, их взаимосвязь с внеклеточным матриксом должна измениться. Данный процесс опосредуется изменением состава интегринов на поверхности клеток, а также синтезом молекул ВКМ и секрецией протеаз матрикса. Последние нужны для разрушения существующих и формирования новых связей во внеклеточном матриксе. Главной молекулой, осуществляющей связь между элементами цитоскелета клетки и внеклеточным матриксом, являются рецепторы интегринов. Ранее считалось, что они служат только прикреплению клетки к матриксу, однако недавние исследования показали, что рецепторы интегринов участвуют в передаче сигналов, как в клетку, так и из нее [111].
В центральной нервной системе практически нет молекул ВКМ, которые встречаются в периферических тканях. Только вокруг кровеносных сосудов и у поверхности мягкой мозговой оболочки обнаруживается базальная пластинка, состоящая из классических молекул ВКМ - коллагена, тромбоспондина, фибронектина, ламинина и витронектина. Основными компонентами ВКМ мозга являются гиалурон-связывающие белки - члены семейства аггреканов (например, версикан и бревикан) и гликопротеины (члены семейства тенасцина). ВКМ взрослого головного мозга не дает клеткам возможности пролиферировать и мигрировать. Чтобы смогли произойти эти процессы, очень важные для репарации, ВКМ.должен быть изменен путем синтеза de novo протеаз матрикса, компонентов ВКМ и рецепторов интегринов, которые позволят микроглии, астроцитам и лейкоцитам проникнуть в поврежденный участок [260, 67].
Изменения, происходящие при перестройке поврежденной ткани головного мозга, касаются также и микрососудистого русла. Фокальная церебральная ишемия вызывает изменения микроциркуляторного русла пограничных с ишемизированными районов. Так, у грызунов в течение 1-3 дней после окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) начинается активная неоваскуляризация поврежденной и пограничных с ней областей мозга [139]. В течение первой недели после ОСМА существующие микрососуды увеличиваются, их стенка истончается. В последующую неделю снижается количество таких расширенных сосудов, а количество сосудов малого диаметра растет. Увеличенные в размерах сосуды (диаметром больше 80 мкм) с тонкой стенкой называют "материнскими". Их количество у крыс после ОСМА увеличивается и достигает максимума на 7 день после операции. Затем их количество уменьшается, и к 14 дню после ОСМА возрастает количество сосудов малого диаметра (3-8 мкм) и короткими сегментами (расстоянием между двумя ближними точками ветвления). Большие сосуды содержат активно пролиферирующие эндотелиальные клетки. Предполагают, что инсульт стимулирует образование "материнских" сосудов из обычных сосудов небольшого диаметра. Эти "материнские" сосуды являются временной структурой, из которой образуются дочерние микрососуды. Такой процесс образования новых сосудов идет в течение недель после ОСМА [212]. Процесс неоваскуляризации по времени совпадает с экспрессией нейронами, микроглией, астроцитами и эндотелиальными клетками сосудов фактора роста эндотелия сосудов - одного из самых распространенных факторов роста сосудов. VEGF стимулирует рост сосудов, а также может влиять на их проницаемость. VEGF также стимулирует экспрессию ингибиторов апоптоза и других белков, способствующих выживанию клеток в условии ишемии [276,91].
В норме экспрессия VEGF в мозге поддерживается на минимальном уровне. При ишемии происходит его быстрое накопление в зоне инсульта и зоне ишемической полутени. VEGF сохраняется в этих участках мозга до 7 дней. Таким образом происходит запуск процесса неоваскуляризации в поврежденных участках [93].
Использование VEGF может оказать положительный терапевтический эффект на течение инсульта, однако только в определенный период после наступления эпизода ишемии. Введение VEGF в латеральный желудочек мозга крысы в течение первых двух суток после ОСМА снижает объем инфаркта и отек мозга, оказывает нейропротекторный эффект. Однако, введение VEGF на ранних сроках развития инсульта, через час после наступления условий ишемии, ведет к таким осложнениям, как повышенная проницаемость ГЭБ, геморрагии, дополнительное повреждение ткани мозга. По-видимому, эти отрицательные эффекты опосредованы повышенной проницаемостью сосудов, вызванной VEGF [92].
Дифференцировка in vitro в ортодоксальных направлениях
Направленной дифференцировке подвергались мезенхимные стволовые клетки крыс после второго пересева культуры. Для индукции дифференцировки МСК использовали опубликованные протоколы и соответствующие коктейли ростовых факторов и морфогенов [216, 217, 126]. МСК наращивали до плотного монослоя. Далее для остеогенной дифференцировки в стандартную среду культивирования добавляли 10"" М Р о л глицерофосфата натрия, 10" М дексаметазона и 2x10" М аскорбиновой кислоты. Для хондрогенной дифференцировки - 1 нг/мл трансформирующего ростового фактора-Зр и 2x10"4 М аскорбиновой кислоты. Для индукции адипоцитарной дифференцировки среду культивирования меняли на содержащую 1% сыворотки крови эмбрионов коров, 10" М инсулина и 10" М дексаметазона. Во всех случаях обработка индукторами дифференцировки длилась 2 нед, половину среды культивирования меняли каждые 3 сут. Морфологические изменения после дифференцировок оценивали визуально с помощью микроскопа (Leica, Германия).
Фенотипирование полученных производных проводили с помощью анализа экспрессии маркерных генов методом обратной транскрипции и последующей полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Для этого выделяли тотальную РНК из дифференцированных клеток, и матричную РНК ревертировали с помощью обратной транскриптазы и полиА-праймера. Полученную кДНК полимеризовали со специфическими праймерами и проводили полимеразную цепную реакцию. Продукт реакции анализировали методом электрофореза в агарозном геле. В качестве маркера недифференцированных МСК был выбран ген фибронектина [144], в качестве маркеров остеогенной дифференцировки — гены остеопонтина и остеокальцина [304]. Как маркеры адипоцитов использовались ген лептина, ген родственного комплементу белка адипоцитов (adipocyte complement-related protein) и ген липид-связывающего белка адипоцитов (adipocyte lipid-binding protein) [154]. В качестве маркера хондрогенной дифференцировки использовали ген коллагена II. Для анализа экспрессии маркерных генов методом ОТ-ПЦР использовали специфические праймеры. Их подбирали с помощью программы GeneRunner по последовательностям мРНК, опубликованным на сайте Национального института Здоровья (США) (таблица 1). Таблица 1 Специфические праймеры генов маркеров дифференцировки.
Дифференцировке в нейрональном направлении in vitro подвергались MCK после второго пересева культуры. Для индукции дифференцировки использовали ростовой фактор нейротрофин-3. МСК наращивали до плотного монослоя. Затем в стандартную среду культивирования добавляли нейротрофин-3 так, чтобы его финальная концентрация составила 2,5x10"6 г/мл. Обработку индуктором дифференцировки продолжали 2 нед. При этом половину среды культивирования меняли каждые 3 сут. Фенотипирование полученных производных было проведено путем окрашивания клеток антителами против белковых маркеров нейронов: специфического ядерного белка нейронов (NeuN) (Chemicon), нейрофибриллярного белка отростков (Таи) (Chemicon), миелин-олигодендроцит специфического белка (MOSP) (Chemicon), глпального фибриллярного кислого белка (GFAP) (Chemicon). Для иммуногистохимических исследований клетки на чашках промывали 2 раза раствором ФСБ, обрабатывали 0,1 % раствором сапонина в течение 1 ч, затем добавляли раствор моноклональных антител (разведение 1:100). Далее клетки промывали 2 раза ФСБ и на 30 мин переносили в раствор биотинилированных вторичных антител. После очередной промывки ФСБ клетки обрабатывали раствором стрептавидин - пероксидазы в течение 15 мин, еще раз промывали ФСБ и наносили на клетки раствор 3, 3-диаминобензидина (DAB) (Novocastra). Течение реакции контролировали визуально с помощью микроскопа (Leica, Германия). Окрашенные препараты заключали в пропилгаллат по стандартной методике. Морфологические изменения оценивали визуально с помощью микроскопа.
Дифференцировка MCK в нейрональном направлении in vitro
При введении среды культивирования (контрольная группа) по треку иглы располагалось большое количество поврежденных клеток (рис. 6 А; рис. 7 А). В коре обоих полушарий наблюдали глиальную реакцию. Слабо выраженная глиальная реакция была отмечена также в зубчатой фасции полушария, в которое произведена инъекция.
При введении МСК в среде культивирования в мозг крысы на глубину 3 мм у всех животных была повреждена двигательная область коры больших полушарий, полуовальный центр, гиппокамп, латеральное переднее таламическое ядро, повреждение доходило до заднего латерального таламического ядра. В месте введения иглы была нарушена цитоархитектоника коры: исчезал слой 1, был практически разрушен слой 2. Наблюдали слабо выраженную глиальную реакцию в коре. В гиппокампе обоих полушарий обнаруживали небольшое количество поврежденных клеток (рис. 6 Б). По треку иглы, особенно в зубчатой фасции и Аммоновом роге, наблюдали множество поврежденных клеток. На границе повреждения определялось большое количество мелких сосудов, чего не отмечали в группе контроля (рис. 7 Б). У некоторых животных над гиппокампом в районе повреждения наблюдали небольшое количество длинных тонких извитых волокон, в отличие от остальных окрашенных структур. Эти волокна были направлены по ходу повреждения. В месте введения клеток отмечалось большое количество мелких сосудов.
У двух животных между гиппокампом и латеральным передним таламическим ядром, частично вдаваясь в последнее, наблюдали ограниченное крупное скопление клеток с просветлением в центре (рис. 8). Это скопление было отграничено от окружающего вещества мозга, по крайней мере, двумя рядами клеток с темными удлиненными ядрами. В центре образования наблюдали небольшое количество неокрашенного материала, отчетливых клеток не было выявлено. В скоплении наблюдали следующие виды клеток: 1. полигональные клетки с крупным светлым округлым ядром с 1-2 ядрышками, широким ободком цитоплазмы 2. полигональные клетки с овальным светлым ядром с 1-2 ядрышками и широким ободком цитоплазмы 3. клетки с небольшим светлым ядром, суженным с одного конца, цитоплазма которых не определяется 4. небольшое количество клеток с маленьким темным ядром неправильной формы и узким ободком темной гомогенной цитоплазмы 5. одна клетка с большим темным ядром неправильной формы, центрально расположенным ядрышком и узким ободком цитоплазмы
Между скоплением клеток и гиппокампом располагалось небольшое количество клеток, морфологически сходных с клетками эпендимы, расположенных по окружности. К ним были протянуты длинные тонкие отростки от небольшой группы клеток, находящихся между описанным ранее крупным скоплением клеток и латеральным передним таламическим ядром. Это клетки со светлым сильно вытянутым овальным ядром, морфологически сходные с эндотелиальными.
Между вышеописанным крупным скоплением и латеральным передним таламическим ядром наблюдали линейно расположенную группу клеток небольшого размера. Эти клетки имели хорошо выраженные контуры ядер, светлую нуклеоплазму. Клетки имели настолько узкий ободок цитоплазмы, что определить ее практически не было возможности. От данной группы клеток радиально отходили тонкие, слабо окрашенные волокна, соединяющие клетки с оболочкой описанного ранее скопления. Иммуногистохимическое исследование, проведенное на соседнем срезе, показало, что клетки, входящие в вышеописанные образования, не окрашивались антителами против маркерного белка нейронов NeuN. Таким образом, травматическое воздействие иглы при инъекции среды или МСК может вызывать глиальную реакцию в коре и гиппокампе ипсилатерального полушария. При введении МСК на границе повреждения наблюдали большое количество мелких сосудов, которые не выявляли у контрольных и интактных животных. При введении МСК в мозг в ряде случаев под гиппокампом наблюдали ограниченные скопления клеток, отграниченные от окружающего вещества мозга, по крайней мере, одним рядом эндотелиоподобных клеток. Дифференцировки МСК в нейроны не обнаружено. Случаев появления опухолевых образований отмечено не было.
Характеристика структуры головного мозга после окклюзии средней мозговой артерии (группа контроля)
Через одни сутки после операции окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) наблюдался обширный некроз ткани мозга, затрагивающий большую часть неокортекса, наружную капсулу и головку хвостатого ядра. Поврежденные участки головного мозга практически не окрашивались по Нисслю: была видна едва определяемая ткань мозга, инфильтрированная небольшим количеством интенсивно окрашенных клеток (рис 11, А, Б.). Сетевидная структура лишенной кровоснабжения ткани еще сохранена. Граница повреждения четкая. В пограничной области выявлялись многочисленные нейроны, имеющие признаки повреждения: вакуолизацию ядра, эктопию ядрышек, распыление вещества Ниссля, вакуолизацию цитоплазмы (рис 11, В). По всей ее толще видны поврежденные нервные клетки, которые характеризовались удлиненно-сморщенной формой и резкими угловатыми очертаниями. Их границы выглядели прямолинейными или вогнутыми. Ядра таких клеток гомогенные и гиперхромные, часто повторяли форму тела нейрона. Цитоплазма поврежденых нейронов также гомогенна и гиперхромна, граница между ядром и цитоплазмой часто неразличима, то есть наблюдался гиперхроматоз нервных клеток [6].
Наблюдались также диффузно расположенные поврежденные нервные клетки коры головного мозга по всему ипсилатеральному полушарию (рис. 12). В контралатеральном полушарии также выявлялись отдельные поврежденные нейроны, однако в этом полушарии их количество меньше. Нейроны удаленных от ишемизированных участков коры имели признаки повреждения, как и нейроны пограничной с ишемизированной области, по вышеописанному типу гиперхроматоза.
Через двое суток после ОСМА в поврежденном слабо окрашивающемся по Нисслю участке мозга еще была сохранена сетевидная структура ткани, в которой наблюдались редкие поврежденные нейроны. Продолжалась инфильтрация некротической зоны клетками воспаления, однако она не являлась ярко выраженной (рис. 13 А).
В пограничной с повреждением области наблюдалось большое количество нейронов, у которых отмечали вакуолизацию ядра, вакуолизацию или гомогенизацию цитоплазмы и распыление Нисслевского вещества. В этой же области наблюдалось большое количество гиперхромных поврежденных нейронов, которые характеризуются гомогенными ядром и цитоплазмой. Также наблюдались поврежденные нейроны с признаками типичного ишемического повреждения: ядро их гиперхромно и слегка уменьшено, цитоплазма бледная (рис 13 Б). В удаленных от ишемизированного участках ипси- и контралатерального полушарий отмечали диффузно расположенные поврежденные нейроны неокортекса.
Особо следует отметить утолщение субэпендимной зоны латеральных желудочков мозга. Ее клетки имели темные овальные ядра, и широкий ободок светлой гомогенной цитоплазмы. Через двое суток после ОСМА отростки этих клеток утолщались и вытягивались по направлению к неокортексу (рис 13 В.).
На третьи сутки в зоне повреждения усиливалась инфильтрация различными клеточными элементами, в основном - лимфоцитами, небольшим количеством макрофагов и изредка эозинофилами. Некротический очаг был полностью сформирован, но распада ткани еще не наблюдалось, сохранялась ее сетевидная структура. В пограничной области наблюдались множественные поврежденные гиперхромные нейроны. Кроме того, в этой области в связи с повышением проницаемости сосудов вокруг них появлялись скопления клеточных элементов, состоявшие из лейкоцитов, плазматических клеток и иногда эозинофилов — периваскулярные муфты (рис. 14). Таким образом, через трое суток после ОСМА начиналась инфильтрация в пограничной с повреждением зоне. Наблюдали диффузно расположенные поврежденные нейроны в удаленных от ишемизированного участках коры.
В ряде случаев отмечалось также повреждение клеток эпендимной выстилки желудочков и сосудистого сплетения. Клетки уплощались и вытягивались, расстояния между ними увеличивались.
