Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследованиями последних лет установлено, что физиологическое обновление тканей животных и человека, в том числе и нервной ткани, происходит в значительной степени благодаря пролиферации и дифференцировке резидентных стволовых клеток (Torella D. et al. 2007; Iarygin K.N. 2008; Bruno S. et al. 2009). Однако при обширных повреждениях мозга в результате инсультов и травм, при нейродегенеративных заболеваниях, а также при утрате значительной части нерва активности нейральных стволовых клеток оказывается не достаточно для полноценного восстановления нервной ткани. Так, повреждения нервного волокна протяженностью более 3 см индуцируют его дегенерацию, поэтому в таких случаях восстановления иннервации ткани-мишени не происходит (Koeppen A.H. 2004). В свою очередь ткань, не получающая нервные импульсы в течение длительного времени, также подвергается дегенерации, поэтому скорость восстановления нервного волокна играет решающую роль в сохранении функциональной ткани (Tomanek R.J. and Lund D.D. 1973).
Поскольку в настоящее время в медицинской практике нет технологий, с помощью которых можно было бы эффективно стимулировать рост нервных волокон и восстановление нервной ткани, поиск новых подходов к активации роста нервов и репарации нервной системы является актуальной задачей в биологии и медицине. Перспективным подходом к лечению неврологических заболеваний может оказаться трансплантация клеток, способных выполнять функцию необходимых для репарации нервов шванновских клеток (Guenard V. et al. 1992). Это определяет актуальность поиска типов аутологичных клеток, которые могли бы стимулировать репарацию нервной ткани как путем секреции нейротрофических факторов роста, так и путем дифференцировки в нейральном направлении, в частности, в шванновские клетки.
Перспективным источником аутологичных прогениторных клеток оказалась жировая ткань. Ее строма содержит клетки по своему иммунофенотипу, профилю экспрессии генов и дифференцировочным способностям сходные с хорошо изученными мезенхимными прогениторными клетками костного мозга. Но в отличие от клеток костного мозга, стромальные (мезенхимные) клетки жировой ткани практически для каждого пациента можно получить в достаточном количестве. Показано, что стромальные клетки жировой ткани (СКЖТ) способны дифференцироваться во многие типы клеток: в остеогенном, хондрогенном, адипогенном направлениях (Zuk P.A. et al. 2001), в клетки нервной ткани (Fujimura J. et al. 2005) и кардиомиоциты (Planat-Benard V. et al. 2004); кроме этого, СКЖТ секретируют ангиогенные и антиапоптотические факторы (Rehman J. et al. 2004; Парфенова Е.В. с соавт. 2006; Rubina K.A. et al. 2009), нейротрофические (Peeraully M.R., Jenkins J.R. and Trayhurn P. 2004; Wei X. et al. 2008) и другие факторы роста (Nambu M., et al., 2009). На различных моделях ангиогенеза in vitro и in vivo было показано, что эти клетки эффективно стимулируют рост сосудов при их введении в ишемизированные ткани (Rehman J. et al. 2004; Трактуев Д. с соав. 2005; Парфенова Е.В. с соав. 2006; Rubina К., et. al, 2009). Стимулирующий эффект СКЖТ на рост сосудов опосредован в основном их секреторной активностью, а также способностью встраиваться в новообразованные сосуды (Miranville et al., 2004; Planat-Benard et al.,2004).
Хорошо известно, что рост сосудов сопряжен с ростом нервов. Процессы ангиогенеза и нейрогенеза имеют общие сигнальные молекулы и механизмы регуляции (Carmeliet P. 2003). Клетки эндотелия секретируют нейротрофический фактор BDNF и привлекают растущие нервные окончания (Louissaint A., Jr. et al. 2002), а шванновские клетки периферических нервов секретируют основной стимулятор ангиогенеза – VEGF (Mukouyama Y.S. et al. 2002). Сопряженность нервов и сосудов подтверждается и тем фактом, что все крупные сосуды иннервируются, а нервные волокна кровоснабжаются. Поэтому способность СКЖТ эффективно стимулировать ангиогенез дает основания предполагать, что эти клетки могут стимулировать и рост нервов. В то же время, есть данные, что эти клетки могут дифференцироваться в нейральном направлении (Ashjian P.H. et al. 2003; Safford K.M. et al. 2004; Ning H. et al. 2006) и способствуют репарации повреждений спинного мозга (Kang S.K. et al. 2006).
Цель данной работы заключалась в исследовании способности стромальных клеток жировой ткани стимулировать рост нервных волокон, экспрессировать нейротрофические факторы и их рецепторы, а также дифференцироваться в нейральном направлении.
Для достижения этой цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:
-
Проанализировать влияние стромальных клеток жировой ткани на рост нервных волокон in vivo в матригеле.
-
Оценить экспрессию нейротрофических факторов роста стромальными клетками жировой ткани при культивировании в условиях нормального и сниженного содержания кислорода.
-
Изучить экспрессию рецепторов нейротрофических факторов роста стромальными клетками жировой ткани при культивировании в условиях нормального и сниженного содержания кислорода.
-
Подобрать условия индукции нейральной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани in vitro.
-
Оценить влияние нейральной дифференцировки на экспрессию нейротрофических факторов роста in vitro, их способность стимулировать рост нервных волокон в матригеле in vivo и жизнеспособность этих клеток при трансплантации в нервную ткань.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В представленной работе впервые показано, что стромальные клетки жировой ткани способны стимулировать рост нервных волокон in vivo в подкожном имплантате матригеля, изучены механизмы такой стимуляции. Установлено, что СКЖТ секретируют нейротрофические факторы BDNF, GDNF и NGF, необходимые для поддержания жизнеспособности нейронов, роста и репарации нервных окончаний. При культивировании СКЖТ в условиях пониженного содержания кислорода (1%) экспрессия нейротрофических факторов повышается. Впервые показано, что популяция СКЖТ содержит клетки, экспрессирующие рецепторы к нейротрофическим факторам. Получены данные, свидетельствующие о присутствии в популяции СКЖТ клеток, способных дифференцироваться в нейральном направлении как спонтанно, так и под влиянием индукторов. Подобраны эффективные индукторы нейральной дифференцировки СКЖТ, которыми оказались сочетания ретиноевой кислоты или BDNF с ДНК-деметилирующим агентом 5-азацитидином. Впервые установлено, что индукция нейральной дифференцировки СКЖТ повышает их способность стимулировать рост нервных волокон при трансплантации в матригеле под кожу мыши и повышает жизнеспособность СКЖТ после трансплантации в головной мозг мыши. Активная продукция нейротрофических факторов роста стромальными клетками жировой ткани и их способность дифференцироваться в нейральном направлении открывает перспективы их использования для клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний и повреждений периферических нервов и ткани головного мозга.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на конференции «Молодые ученые в медицине-2008», Казань, 23-26 апреля 2006 г., на V конференции молодых ученых России с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 19–22 мая 2008 г, на всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения», Москва 9-11 июня 2008г., на международном форуме аспирантов Тихоокеанского региона, Омаха, США, 2-6 июня 2008г., на шестом собрании международного общества по изучению стволовых клеток (6th ISSCR Annual Meeting), Филадельфия, США, 11-14 июня 2008г., на втором международном конгрессе по стволовым клеткам и формированию ткани Дрезден, Германия, 6-9 июля 2008г.
Апробация работы состоялась 12 мая на кафедральном семинаре на факультете фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 тезисов докладов, 3 статьи в рецензируемых журналах, 1 статья отправлена в печать.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 97 страниц машинописного текста, таблицы и 17 рисунков. Список литературы включает 161 источник.
