Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Клинико-морфологическая характеристика повреждений костной ткани и методы воздействия на посттравматический остеогенез
1.1. Повреждения костной ткани
1.1.1. Общие сведения о повреждениях костных органов 13
1.1.2. Повреждения костей черепа и особенности их восстановления 15
1.2. Гистогенетические основы разработки методов оптимизирующего влияния на репаративный остеогенез 22
1.3. Клеточные биотехнологии и их использование для воздействия на репаративную регенерацию костной ткани
1.3.1. Общие принципы клеточных биотехнологий 29
1.3.2. Получение культуры остеогенных клеток 32
1.3.3. Опыт использования культур остеогенных клеток в эксперименте и клинической травматологии и ортопедии 35
1.3.4. Перспективы использования клеточных биотехнологий на основе применения культивированных остеогенных клеток в клинике 38
Глава 2. Материал и методы исследования 42
Глава 3. Цитогенетическая характеристика стромальных клеток костного мозга в условиях культивирования
3.1. Морфологическая характеристика культуры стромальных клеток костного мозга 59
3.2. Проявления остеогенных свойств культуры стромальных клеток костного мозга 78
3.3. Обсуждение полученных данных 84
Глава 4. Влияние трансплантированной культуры стромальных клеток костного мозга на репаративный остеогистогенез в зоне дефекта плоских и длинных трубчатых костей
4.1. Влияние культуры стромальных клеток костного мозга на репаративный остеогистогенез в области дефекта костей черепа 88
4.1.1. Гистоархитектоника костей крыши черепа 88
4.1.2. Посттравматический гистогенез в области дефекта теменной кости 91
4.1.3. Остеогистогенез в области дефекта теменной кости при трансплантации культуры стромальных клеток 106
4.1.4. Остеогистогенез в области дефекта теменной кости после трансплантации культуры стромальных клеток в коллагеновом геле 113
4.2. Влияние культуры стромальных клеток костного мозга на репаративный остеогистогенез в области дефекта длинной трубчатой кости 124
4.2.1. Посттравматический гистогенез в области дефекта болыпеберцовой кости 124
4.2.2. Восстановительный остеогистогенез в области дефекта болыпеберцовой кости при трансплантации культуры стромальных клеток костного мозга в коллагеновом геле 127
4.3. Обсуждение полученных данных 134
Заключение 141
Выводы 144
Практические рекомендации 146
Приложение 147
Список литературы 151
- Гистогенетические основы разработки методов оптимизирующего влияния на репаративный остеогенез
- Клеточные биотехнологии и их использование для воздействия на репаративную регенерацию костной ткани
- Проявления остеогенных свойств культуры стромальных клеток костного мозга
- Влияние культуры стромальных клеток костного мозга на репаративный остеогистогенез в области дефекта длинной трубчатой кости
Введение к работе
Актуальность.
Восстановление целостности костных органов, необходимое при лечении патологии костей - переломов, замедленной консолидации, ложных суставов и дефектов, является актуальной проблемой современной травматологии и ортопедии, а также фундаментальных медико-биологических дисциплин морфологического профиля (Гайдуков В.М., 1995; Гололобов В.Г., 1997; Шаповалов В.М., 1999; Шаповалов В.М., Фомин Н.Ф., Дудаев А.К., Рукавишников А.С., 2000; Brueckmann F.R., Roberts G.J., 1989). Постоянная модификация средств ведения боевых действий, непрекращающиеся локальные вооруженные конфликты, увеличение количества антропогенных катастроф приводит к повышению частоты повреждений костных органов. Травмы и заболевания костно-мышечной системы с 1993 года в Российской Федерации прочно занимают второе место в структуре инвалидности после заболеваний сердечно-сосудистой системы, причем среди причин и локализаций травм 78,8% приходится на травмы опорно-двигательного аппарата (Барабаш А.П., 2000).
Травмы, вызванные современными видами оружия, приводят к резкому снижению собственных регенераторных возможностей костной ткани с формированием состояния «остеогенной недостаточности» и требуют проведения мероприятий по оптимизации репаративного остеогенеза или выполнения костной пластики (Гололобов В.Г., Дулаев А.К., Деев Р.В., Иванов Д.Е, 2001).
В вооруженных конфликтах последнего времени наблюдается тенденция к увеличению удельного веса ранений головы, а, следовательно, и повреждений костей черепа, что происходит за счет изменения тактики поражения живой силы противоборствующими сторонами. По результатам анализа санитарных потерь во время Второй мировой войны (ВМВ) и войны в Республике Афганистан (РА) ранения головы составляли соответственно 14,8% и 22,6% (Нечаев Э.А., 1992). Показано, что в дефектах костей черепа у
6 человека без проведения костной пластики восстановления гисто- и органотипической структуры не происходит (Матвеева А.И., 1962; Зотов Ю.В., Касумов Р.Д., Савельев В.И. и др., 1998). Кроме того, существенной и во многом нерешенной проблемой современной ортопедии остается повреждение суставного хряща при трамах и воспалительных заболеваниях крупных суставов, зачастую являющиеся показаниями к сложному оперативному лечению (Тихилов P.M., 1999).
В последнее время все большее место в клинической практике занимают различные методы клеточной и тканевой терапии. Значительный интерес представляет использование клеточных биотехнологий в программе лечения больных травматолого-ортопедического профиля. Применение предшественников костных клеток с целью оптимизации течения репаративных процессов при переломах и их осложнениях имеет патогенетическое обоснование. Клиницистами получены первые результаты, которые свидетельствуют о доступности подобных методик, их приемлемой стоимости и перспективности для лечения дефектов костей различных локализаций и суставного хряща (Schaefer D.J., Klemt С, Zhang Х.Н., Stark G.B., 2000; Mankani M.H., Krebsbach P.H., Satomura K. et. al, 2001; Veda M., Tohnai I., Nakai H., 2001). Однако в работах не прослежены отдаленные результаты лечения, отсутствует количественная характеристика процесса, что затрудняет оценку оптимальности выбора методов лечения и его эффективности.
Теоретические основы использования остеогенных и хондрогенных клеточных элементов в целях костной пластики и лечения повреждений суставного хряща закладывались основоположниками классической гистологии. Выдающийся гистолог А.А. Максимов, является автором учения о «мезенхимальном резерве» (Maximow А.А., 1927), согласно которому, все механоциты (фибробласты, остеобласты, хондроциты и др.) и клетки крови во взрослом организме происходят из малодифференцированных полипотентных предшественников. Более поздними исследованиями в экс-
7 периментах с культурами стромы костного мозга взрослых были выявлены клетки, которые с большой степенью доказательности являются предшественниками механоцитов, при этом они не идентичны стволовым клеткам крови (Фриденштейн А.Я., 1991).
Следует отметить, что учение о регенерационном гистогенезе, клеточно-дифференной организации тканей, внутри- и междифферонной гетероморфии в процессе заживления ран органов опорно-двигательного аппарата (Клишов А.А., 1984; Данилов Р.К., 2004) создают теоретическую основу для применения научно обоснованных лечебных мероприятий. Современные представления о закономерностях посттравматической регенерации костной ткани (Гололобов В.Г., 2001, 2004), биотехнологические разработки по восстановительной хирургии костных органов определяют необходимость культивирования остеогенных клеток in vitro с последующей трансплантацией их в зону дефекта (Дулаев А.К., Гололобов В.Г., Деев Р.В., 2003; Guo Z., Dang G., Wang Z. et al, 1999; San J.S., Tsuang Y.H., Lin F.H. et al., 1999; Petite H., Viatean V., Bensaid W. et al., 2000).
Подтверждено положительное влияние клеточных культур на восстановление дефектов длинных костей конечностей (Peterson L., 1997). Весьма актуален данный метод и для пластики дефектов костей черепа, характеризующихся крайне низким регенераторным потенциалом. Единичны работы, в которых в эксперименте в зону костного дефекта вводили взвесь культивированных клеток, а также клетки на носителе (Саргсян А.А., 1990; Shang Q., Wang Z, Liu W. et al., 2001).
Исследований морфологов, касающихся целостного гистологического и гистоморфометрического анализа репаративных процессов в костной ране при использовании клеточных биотехнологий в научной литературе недостаточно.
В качестве объектов для изучения остеогистогенеза in vitro используют культуры стромальных клеток костного мозга животных и человека
8 (Николаенко Н.С., Кухарева Л.В., Воронкина И.В. и др. 1999; Садофьев Л.А., Подгорная О.И. 1999), остеобластов костей черепа крыс (Owen Т.A., Aronow M.S., Barone L.M. et al., 1991; Asachina I., Sampath Т.К., Nishimura I., Hauschka P.V. 1993) и опухолевых клеток скелетных тканей (Садофьев Л.А., Подгорная О.И. 1999). Однако из-за отсутствия общих теоретических и прикладных подходов в трактовке результатов, единых методических приемов и критериев оценки остеогенеза полученные данные зачастую несопоставимы (Фатхудинов Т.Х., Гольдштейн Д.В., Пулин А.А. и др. 2005).
Кроме того, одной из сложных проблем является выбор адекватного носителя для культуры клеток (Иванов С.Ю., Кузнецов Г.В., Чайлахян Р.К. и др., 2001), что непосредственно влияет на судьбу клеточной культуры, привнесенной в дефект кости, и исход регенераторного гистогенеза. Разработка вопросов данной проблемы позволит дополнить сведения о морфофункциональной характеристике репаративного остеогистогенеза, изучить современные способы его оптимизации, что может быть использовано в теоретической гистологии и клинической практике.
Цель исследования. Изучить влияние культуры костномозговых стромальных клеток на посттравматический остеогистогенез при их трансплантации в область дефектов плоских и длинных трубчатых костей в эксперименте.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить цитогенетические свойства стромальных клеток костного
мозга в различных условиях культивирования и охарактеризовать их
остеогенный потенциал.
2. Выявить гистологические особенности посттравматического
остеогистогенеза в области дефекта теменной кости.
Оценить влияние трансплантированной культуры стромальных клеток костного мозга, в том числе, клеток в коллагеновом геле, на регенерадионный остеогистогенез в области дефекта теменной кости.
Определить влияние пересаженной культуры стромальных клеток костного мозга в коллагеновом геле на восстановительный остеогистогенез в области дефекта длинной трубчатой кости.
Предложить для клинического испытания модифицированный метод трансплантации культуры стромальных клеток костного мозга при дефектах плоских и длинных костей.
Научная новизна.
Модифицирован способ получения пересеваемой культуры костномозговых стромальных клеток, разработана технология их направленной остеогенной дифференцировки, охарактеризован остеогенный потенциал культуры.
Выявлены цитогенетические свойства стромальных клеток костного мозга в условиях культивирования.
С помощью комплексного остеоморфологического анализа выявлены закономерные процессы заживления раны теменной кости, свидетельствующие о преходящем остеогенезе и заместительном десмогенезе в исходе этого процесса.
Установлено оптимизирующее влияние трансплантированной культуры стромальных клеток костного мозга на посттравматическую регенерацию костной ткани в области дефекта как плоских, так и длинных костей в эксперименте.
Изучен и сопоставлен регенерационный остеогистогенез без внесения и с внесением в область дефекта плоских и длинных костей культуры стромальных клеток костного мозга в виде взвеси и в коллагеновом геле, показана их эффективность при лечении дефектов плоских и длинных трубчатых костей в эксперименте.
10 Теоретическая и практическая значимость.
В исследовании на основе цитогенетического анализа стромальных клеток костного мозга в условиях культивирования выявлены их остеогенные свойства; модифицированы и разработаны методы эксплантации и культивирования аутогенного материала с целью получения клеток - предшественников остеогистогенеза.
Предложен гистоморфометрический метод оценки эффективности влияния различных способов клеточной трансплантации на процесс остеорепарации.
Сравнительный анализ влияния культивированных стромальных клеток костного мозга на посттравматический остеогистогенез, трансплантированных в виде взвеси и в коллагеновом геле, показывает перспективность использования последнего как наиболее эффективного по показателю соотношения доли специализированной (костной) ткани в регенерате.
Примененный в работе витальный краситель РКН-26 (Sigma, США) позволяет выявить пересаженные клетки в регенерате, что дает возможность проследить формирование цитодифферонов, использовать его при изучении пролиферации, миграции, дифференцировке и интеграции клеточных популяций в процессе регенерации.
Разработанная технология эксплантации и культивирования стромальных клеток костного мозга позволяет совершенствовать и внедрять в клиническую практику методы оптимизации течения репаративной регенерации костной ткани (при сложных переломах, замедленной консолидации, ложных суставах, дефектах костей и др.).
Основные положения, выносимые на защиту:
Посттравматический гистогенез при повреждении костей крыши черепа протекает по типу заместительной регенерации, в результате которой дефект заполняется волокнистой соединительной тканью.
Разработанная технология трансплантации аутогенной культуры стромальных клеток костного мозга в область дефекта плоской кости вызывает статистически значимое увеличение доли костной ткани в составе регенерата и наиболее полное восстановление ее органотипической архитектоники.
При сегментарных дефектах длинных трубчатых костей конечностей пересадка в костную рану культуры костномозговых стромальных клеток приводит к сокращению сроков восстановления целостности костного органа.
Трансплантация культуры стромальных клеток костного мозга в коллагеновом геле является более перспективной для последующего клинического использования по сравнению с пересадкой клеточного материала без носителя.
Реализация работы.
Результаты работы служат теоретическим обоснованием для дальнейшего развития клеточных биотехнологий с целью лечения пациентов в клинике травматологии и ортопедии им. Г.И. Турнера Военно-медицинской академии. Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре гистологии (с курсом эмбриологии) Военно-медицинской академии при чтении лекций и проведении практических занятий для курсантов и студентов факультетов подготовки врачей.
По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, получены удостоверения на 4 рационализаторских предложения.
12 Апробация работы.
Основные положения диссертационного исследования доложены на итоговых конференциях военно-научного общества курсантов и слушателей Военно-медицинской академии (СПб., 2001, 2002, 2003); Пироговской студенческой научной конференции (М., 2003); конференции «Анатомия и военная медицина», посвященной 80-летию со дня рождения профессора Е.А. Дыскина (СПб., 2003); 1-м съезде Общества клеточной биологии (М., 2003); Международной научно-практической конференции «Проблемы клеточной и тканевой трансплантологии» (Иваново-Франковск, Украина, 2003); V Общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004); Международном симпозиуме по биологии клетки в культуре «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (СПб., 2004); Всероссийском научном совещании «Актуальные проблемы учения о тканях» (СПб., 2006).
Структура и объем работы.
Материалы диссертации представлены на 175 страницах. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методик исследования, двух глав собственных исследований с обсуждениями, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка литературы. Работа содержит 93 рисунка и 7 таблиц. Список литературы включает 214 источников, из них 131 отечественных и 83 иностранных авторов.
Гистогенетические основы разработки методов оптимизирующего влияния на репаративный остеогенез
При изучении проблемы регуляции посттравматической регенерации тканей используются различные методологические и методические подходы. Целостный анализ посттравматического остеогистогенеза, выбор средств и способов, оптимизирующих регенерацию костной ткани, представляется перспективным с позиции общих закономерностей гистогенеза, отраженных в классических трудах А.А. Максимова (1927), А.А. Заварзина (1953), Н.Г. Хлопина (1946).
Существенное значение для теоретической и прикладной гистологии имеют научные исследования, в которых разрабатываются вопросы реактивности, пролиферации, дифференцировки и адаптации клеточных и тканевых элементов в процессе эмбрионального, репаративного и трансплантационного гистогенеза (Саркисов Д.А., Пальцын А.А., Музыкант Л.И., и др., 1990; Валькович Э.Н, 1995; Верин В.К., 1996).
Коллектив кафедры гистологии Военно-медицинской академии им. СМ. Кирова, исследуя процесс регенерации различных тканей опорно-двигательного аппарата, творчески развивает концепции о регенерационном гистогенезе и клеточно-дифферонной организации тканей (Клишов А.А., 1984; Данилов Р.К., 1993, 2000, 2004; Гололобов В.Г., 1997, 2004; Графова Г.Я., 1997, 2004; Хилова Ю.К., 1986, 2004; Одинцова И.А., 2003, 2004), которые служат надежной теоретической базой для научно обоснованных способов оптимизации восстановительных процессов.
Процесс репаративной регенерации костной ткани, как и любой другой биологический процесс, имеет генетически обусловленные временные и пространственные константы. Временные параметры репаративного остеогистогенеза после травмы костного органа детерминированы, но зависят от многих причин. Оптимальным по времени является первичное костное сращение, однако протекает оно только при благоприятных условиях (Виноградова Т.П., Лаврищева Г.И., 1974; Ткаченко С.С., 1987). Обеспечение таких условий и есть элемент влияния на скорость остеорепарации. В случае переломов, консолидирующихся через образование мультитканевого регенерата, вступают в действие иные временные константы. В арсенале травматолога так же имеются методы обеспечения оптимального протекания остеогистогенеза - оптимизации сращения. Такие способы могут быть классифицированы на общие и местные.
К общим способам оптимизации следует отнести системное применение разнообразных анаболиков, адаптагенов, витаминов, препаратов проявляющих активность в отношении костной ткани (остеогенон, кальцитонин лосося и т.п.). Местные мероприятия нацелены на улучшение состояния костной раны. К ним следует отнести сберегательную первичную хирургическую обработку раны (по показаниям) (Дулаев А.К., 1991; Брюсов П.Г., Шаповалов В.М., Артемьев А.А. и др., 1996), качественную репозицию, стабильную фиксацию, сохранение и поддержание жизнеспособности костных осколков в ране (Михайлов СВ., 1996, Шаповалов В.М., Ерохов А.Н., 1999; Ерохов А.Н., 1999; Ерохов А.Н., Шаповалов В.М., 1999; Михайлов СВ., Дулаев А.К., Гололобов В.Г., 1999) применение различных способов костной пластики и др. Таким образом, главной целью хирургического лечения пациентов с повреждениями костей скелета можно определить, как создание благоприятных условий для протекания репаративной регенерации костной ткани, приблизив её к биологической константе (Чобану П.И., Лаврищева Г.И., Козлюк А.С, 1989; Гололобов В.Г., Дулаев А.К., Деев Р.В., 2003).
Под индукцией репаративного остеогенеза понимают активное побуждение элементов рассредоточенного камбия к прогрессивной остеогенной дифференцировке (Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С. 1973; Гололобов В.Г., Дулаев А.К., Деев Р.В., 2003). В качестве таких побуждающих агентов могут выступать различные остеоиндуцирующие вещества (костные морфогенетические белки и др.).
Все предложенные способы оптимизации остеогенеза и лечения больных с замедленной консолидацией и ложными суставами могут быть подразделены на две основные группы: консервативные и оперативные (Гайдуков В.М., Шаповалов В.М., 2000; Andersen L.R., Johannsen H.G., Ernst С, Weeth E.R., 1996). Сущность консервативного лечения сводится к стремлению различными путями оптимизировать условия для регенерации костной ткани «закрытым способом».
Основным методом в лечении различных видов нарушенной консолидации переломов остается оперативный. Широко применяемые методы внутрикостного и накостного металлоостеосинтеза, позволяют добиться сращения только в 80% случаев (Froum S.J., Tarnow D.P., Wallace S.S., 1998). Изолированное использование компрессионно-дистракционных аппаратов также не всегда приводят к хорошим анатомо-функциональным результатам (Илизаров Г.А., Капунов А.Г, Шпаер Л.И., 1972; Cibo S., 1992; Green S.A., Jackson J.M., Wall D.M., 1992).
Общепризнанно, что методом выбора при лечении дефектов костей конечностей является несвободная костная пластика по Г.А. Илизарову. На принципе дозированной дистракции по Г.А. Илизарову базируются несколько операций по замещению тотальных, краевых дефектов и исправлений деформаций длинных костей конечностей. Среди них модификация кортикотомии, кортикотомия для частичного замещения костного дефекта, собственно несвободная костная пластика и др. (Голяховский В., Френкель В., 1999). Вместе с тем, необходимо учитывать, что, например, при остеомиелите средний срок лечения составляет 657±49 суток, лечение сопряжено с развитием осложнений как со стороны опорно-двигательного аппарата (контрактуры суставов, атрофия и фиброзное перерождение мышц, спицевой остеомиелит), так и со стороны других органов и систем (Лесков Н.И., Овденко А.Г., Вовченко В.И., 2001). По мнению А.В. Шумило (1997), метод чрескостного остеосинтеза целесообразно применять при лечении больных с циркулярными дефектами кости до 8 см и с дефектами мягких тканей, которые не превышают размер дефекта кости. Несоблюдение данных положений, по мнению автора, приводит к увеличению частоты осложнений и неудовлетворительных функциональных результатов.
Клеточные биотехнологии и их использование для воздействия на репаративную регенерацию костной ткани
Трансплантация органов, тканей и клеток в современной медицине занимает важное место в системе современного здравоохранения (Шумаков В.И., Скалецкий Н.Н., 1995), поскольку зачастую остается единственным способом сохранения жизни и здоровья пациента (Парамонов Б.А., Порембский Я.О., Яблонский В.Г., 2000). Развитие клеточных биотехнологий связано с началом первых экспериментов по переливанию крови и трансплантации костного мозга в интересах онкогематологии. Применение методик клеточной трансплантологии и тканевой инженерии является частным разделом общей трансплантологии (Берсенев А.В., 2005). Применение предшественников костных клеток с целью оптимизации течения репаративных процессов при переломах и их осложнениях имеет патогенетическое обоснование. Врачи уже получили положительные результаты, которые свидетельствуют о доступности подобных методик, их приемлемой стоимости и перспективности для лечения дефектов костей и суставного хряща (Schaefer D.J., Klemt С, Zhang Х.Н., Stark G.B., 2000; Mankani М.Н., Krebsbach P.H., Satomura К. et. al., 2001; Veda M, Tohnai I., Nakai H., 2001). В теоретическом базисе таких методик лежат представления А.А. Максимова о «мезенхимальном резерве» (Maximow А.А., 1927), согласно которым фибробласты, остеобласты, хондроциты и др. механоциты, а также клетки крови во взрослом организме происходят из мало-дифференцированных полипотентных предшественников. В экспериментах с культурами стромы костного мозга были выявлены клетки, которые с большой степенью доказательности являются предшественниками механоцитов и обладают свойствами стволовых (Фриденштейн А.Я., 1991). Данные клетки способны адгезироваться к поверхности культурального сосуда, пролиферировать и образовывать колонии фибробластоподобных клеток, в связи с чем были названы клетками, образующими колонии фибробластов (КОКф - колониеобразующие фибробластические клетки, CFU-F - colony-forming unit-fibroblast) (Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С., 1973; Фриденштейн А. Я., Лурия Е.А., 1980; Фриденштейн А.Я., 1991; Kuznetsov S.A., Robey P.G., 2000). В литературе КОКф обозначаются по-разному, исторически сложившимся названием следует считать - «стволовые стромальные клетки» (Owen М.Е., Friedenstein A J., 1988), кроме этого, в качестве синонимов используют термины «стволовые механоциты» (Лаврищева Г.И., Оноприенко Г.А., 1996), «стволовые мезенхимальные клетки» и др. (Сухих Г.Т., Малайцев В.В., Богданова И.М., Дубровина И.В., 2002; Schaefer D.J., Klemt С, Zhang Х.Н., Stark G.B., 2000; Caterson E.J., Nesti L.J., Albert T. et al., 2001). На недавнем круглом столе специалистов по клеточным технологиям, было принято решение называть данную популяцию клеток «мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки» (multipotent mesenchymal stromal cells) (Horwitz E., Le Blanc K., Dominici M. et al. 2005).
Колонии, образованные высеянными КОКф из одного образца костного мозга, являются гетерогенными (Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С., 1973). Так, часть из них способна к длительному самоподдерживанию и под действием индукторов (дексаметазон, Na-p-глицерофосфат, аскорбиновая кислота, костный морфогенетический белок и др.) они дифференцируются в клетки, дающие положительные цитохимические и иммуноцитохимические реакции на щелочную фосфатазу, коллаген I типа, остеокальцин. В процессе культивирования ими синтезируются элементы волокнистого межклеточного вещества - коллагенового матрикса, на котором осаждаются минеральные компоненты, формируя узелки минерализации. Указанные особенности в совокупности считаются основными признаками остеобластического фенотипа in vitro (Деев Р.В., Николаенко Н.С., Цупкина Н.В. и др., 2004; Owen М.Е., Friedenstein A.J., 1988; Vehof J.W., de Ruijter A.E., Spauwen P.H., Jansen J.A., 2001). В классических экспериментах при обратной трансплантации под почечную капсулу эти клетки образуют гетеротопический костномозговой орган, представляющий собой фрагмент губчатой кости, заполненный мигрировавшими с током крови из костного мозга гемопоэтическими предшественниками (Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С., 1973; Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А., 1980; Kuznetsov S.A., Mankani М.Н., Gronthos S. et al., 2001). Культивирование этих клеток в диффузионных камерах, имплантированных в брюшную полость лабораторным животным, позволило получить костную, хрящевую и волокнистую соединительную ткани внутри камеры. Этот факт дал основание считать, что высеянные колонии содержат клетки-предшественники для всех трех тканей (Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А., 1980; Kuznetsov S.A., Robey P.G., 2000). Многие авторы из подобных клеток различных животных и человека, варьируя условиями культивирования, получали in vitro костную ткань, хрящ, волокнистую соединительную ткань, а также адипоциты, гладкие миоциты (Simmons P.J., Torok-Storb В., 1991; Gronthos S., Graves S.E., Ohta S., Simmons P.J., 1994; Triffitt J.T., Joyner C.J., Oreffo R.O.C., Vir-di A.S., 1998; Stewart K., Walsh S., Screen J. et al., 1999; Wakitani S., Imoto K., Yamamoto T. et al, 2002).
В экспериментах с мышами-химерами было показано, что взвесь костномозговых клеток способна дать начало костной, хрящевой и волокнистой соединительной тканям in vivo (Gould S.E., Rhee J.M., Toy B.K.etal., 2000). По нашему мнению, в технологии клеточной инженерии следует выделить три основных этапа: первый — эксплантация аутогенного материала для выделения из него клеток-предшественников; второй - культивирование полученных клеток in vitro, их направленная селективная дифференцировка; третий - трансплантация культивированного in vitro клеточного материала больному или пострадавшему. Первый этап подразумевает получение из доступных тканей предшественников остеобластов, а именно: стволовых стромальных клеток (ССК) и их более дифференцированных производных - остеогенных клеток. От качества его выполнения зависит насколько быстро и успешно будет накоплено in vitro необходимое количество клеток и осуществлена их трансплантация.
Проявления остеогенных свойств культуры стромальных клеток костного мозга
В цитологической части работы предпринята попытка выявления у полученной клеточной культуры стромы костного мозга остеогенных свойств. Одним из проявлений остеобластической дифференцировки как in vivo, так и in vitro является способность клеток к продукции щелочной фосфатазы и способность преципитировать соли кальция на волокнистых компонентах межклеточного матрикса (Садофьев Л.А., Подгорная О.И., 1999). В работе применены методы качественного определения этого фермента и выявления его активности. В части экспериментов стромальные клетки костного мозга кроликов культивировали в присутствии дексаметазона из расчета 10"8 моль. В качестве контроля использовали постоянную клеточную линию остеосаркомы крысы ROS 17-2/8, а также клетки первичной культуры основания черепа новорожденных крыс. Также исследовали культуру клеток костей черепа новорожденных крыс, являющейся традиционной моделью для изучения остеогенеза in vitro (Owen Т.A., Aronow M.S., Barone L.M. et al., 1991; Asachina I., Sampath Т.К., Nishimura I., Hauschka P.V., 1993).
Качественную реакцию на ЩФ ставили на различных сроках культивирования. При окраске культуры через 15 суток после эксплантации выявлялись дискретные группы клеток, окрашивающиеся с различной степенью интенсивности (рис. 38), при этом ядра, не содержащие фермента, выглядят как бы «пустыми». Фосфатазоположительные клетки отросчатые, что хорошо выявляется, так как гранулы с ферментом заполняют всю цитоплазму и отростки клетки, повторяя ее контур. Аналогичным образом клетки окрашивались в контроле - культуре остеосаркомы крыс (рис. 39). Количество специфически окрашенных стромальных клеток в расчете на единицу площади клеточного пласта увеличивалось с количеством пересевов.
При окрашивании более строй культуры - 10-18 суток культивирования, количество фосфатазоположительных клеток значительно увеличилось (рис. 40). В контроле синтетическая активность существенно не изменялась (рис. 41).
При исследовании количественного показателя синтетической активности культуры стромальных клеток - активности щелочной фосфатазы установлено, что суммарная активность фермента была самой низкой среди исследованных клеток - 4,0±0,6 нмоль/мин/млн. клеток. Под действием дексаметазона данный показатель достиг уровня 9,0±1,0 (табл. 3). В межклеточном матриксе обнаружены преципитаты солей кальция (рис. 42).
Клетки костей черепа новорожденных крыс характеризовались быстрыми темпами пролиферации. Они достаточно активно синтезировали остеобласт-характерный фермент, причем к 11 суткам активность ЩФ была на уровне 34±7 нмоль/мин/млн. клеток. Цитохимическое исследование на соли кальция выявило отложение минерала во внеклеточном матриксе.
Выявление активности ЩФ у клеток ROS проведенное на 5 и 11 сутки культивирования указывало на то, что активность фермента в культуре увеличилась с 15+3 до 60±12 нмоль/мин/млн. клеток (см. табл. 3). Следует отметить, что, не смотря на высокие показатели активности остеобласт-характерного фермента, было невозможно зарегистрировать достоверные признаки минерализации межклеточного матрикса (рис. 43).
Остеобласты и их менее дифференцированные предшественники по происхождению являются производными мезенхимоцитов, и по своим цитогенетическим потенциям и функциям относятся к типичным механоцитам. Основные свойства роста in vitro соединительных тканей, включающих клетки-механоциты, описаны еще в классических трудах А.А. Максимова (1916), Н.Г. Хлопина (1940, 1946). Как справедливо отмечал Н.Г. Хлопин (1946), не смотря на внешнее сходство фибробластоподобных клеток, выделенных из различных органов, они совершенно различны в плане своей биохимической активности. Так, остеогенные, в широком смысле, клетки характеризуются определенным набором признаков. К ним следует отнести свойства многих клеток соединительных тканей: способность адгезироваться к различным поверхностям, в том числе пластику культурального сосуда, что является результатом образования молекул адгезии; синтез экспортного белка коллагена; трехмерная пространственная организация клеток в волокнистом матриксе. Кроме этого они обладают совокупными специфическими признаками, являющимися маркерами дифференцировки - синтезе специфических белков, свойственных остеогенным клеткам: коллаген I типа; ряд веществ, обеспечивающих минерализацию волокнистого остова - ЩФ, остеокальцина и др., что показано на модели клеточных культур из тканей мышей, крыс, кроликов и человека (Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С., 1973; Садофьев Л.А., Подгорная О.И., 1999; Гололобов ВТ., Деев Р.В., 2003; Asachina I., Sampath Т.К., Nishimura I., Hauschka P.V., 1993; Clark B.R., Keating A., 1995; Kuznetsov S.A., Mankani M.H., Gronthos S. et al., 2001).
Влияние культуры стромальных клеток костного мозга на репаративный остеогистогенез в области дефекта длинной трубчатой кости
Дефект кости является особым видом повреждения, при котором костная ткань отсутствует на протяжении более 1,0 см (Ткаченко С.С., 1987).Несмотря на это в репаративном гистогенезе при заращении сегментарногодефекта наблюдаются те же основные фазы, описанные для повреждения костных органов (Гололобов В.Г., 1997, 2004). Через 3 суток после операции зона дефекта была заполнена гематомой с элементами разрушенного желтого костного мозга, что проявлялось обнаружением дискретных скоплений адипоцитов. Гематома была умерено инфильтрирована полиморфноядерными лейкоцитами. При изучении костных краев дефекта реактивные признаки со стороны костной ткани не обнаружены. Отсутствовали запустевшие остеоцитарные лакуны, являющиеся типичным признаком повреждения костной ткани, развивающимся в первые трое суток. Пролиферация камбиальных элементов со стороны периоста и эндоста не отмечалась.
Первые признаки некробиотических процессов зафиксированы через 15 суток после операции. Они проявлялись в незначительном количестве погибших остеоцитов у краев костного дефекта. При изучении поперечных срезов, глубина залегания пустых остеоцитарных лакун в отдельных местах достигала диаметра 1,5 остеонов. Со стороны периоста и эндоста пролиферативных изменений не наблюдалось. Регистрировались некробиотические изменения, проявлявшиеся в гибели клеток этих структур и частичной их отслойке вблизи дефектов (рис. 79). Первые признаки репаративного остеогистогенеза были обнаружены на 30-е сутки эксперимента. Они выражались в локальном утолщении периоста вблизи краев дефекта за счет пролиферации его остеогенного слоя. Со стороны эндоста наблюдали формирование небольшого количества трабекул ретикулофиброзной костной ткани, врастающих в организованную гематому.
Гематома была разделена на множество участков тяжами волокнистой соединительной ткани. Со стороны краев костных дефектов выраженных пролиферативных изменений не обнаружено. Наблюдалось расширение некоторых каналов остеонов, заполнение их реактивно измененной соединительной тканью, неоваскулогенез, локальные отложения остеоида в некоторых просветах гаверсовых систем. Через 60 суток дефект оставался незаполненным костной тканью. Дефект и костномозговой канал заполнены организованной гематомой. Края костного дефекта имели признаки остеогенеза, который, однако, оставался весьма невыраженным.
Через 90 суток после начала эксперимента в костной ране обнаружены признаки выраженного остеогистогенеза. Костномозговой канал заполнен ретикулофиброзной костной тканью, организованной в виде многочисленных ветвящихся трабекул. Межтрабекулярные пространства были заполнены соединительной тканью. Со стороны периоста наблюдали формирование развитого костного регенерата, по своему строению сходному с эндостальным. Несмотря на признаки выраженного остеогенеза, края костного дефекта не были сомкнуты и между ними продолжал оставаться видимый макроскопически дефект диафиза.
Через 120 суток наблюдали смыкание краев дефекта. На этот срок сохранялся выраженный костный регенерат как со стороны периоста, так со стороны и костномозгового канала, что подтверждается и рентгенологическими данными (рис. 80). Однако, канал в проекции дефекта был заполнен трабекулами ретикулофиброзной костной ткани, в промежутках между которыми, располагалась волокнистая соединительная ткань с редкими очагами кроветворения. Сама костная ткань диафиза, образованная на месте дефекта, обладала существенными отличиями в своих тинкториальных свойствах: преимущественно не имела остеонной организации; возникшие остеоны расположены хаотично; количество слоев костных пластинок было незначительным (1-3).
Таким образом, посттравматический остеогистогенез в области сегментарного дефекта длинных трубчатых костей протекает на основе известных закономерностей и претерпевает три фазы развития: ранних посттравматических изменений, регенерации и функциональной адаптации. Однако, последняя фаза не явилась основой восстановления органотипической архитектоники болынеберцовой кости, так как в конце наблюдения (120 сут) дефект оставался заполненным ретикулофиброзной костной тканью; структурно-функциональные единицы кости, как органа (остеоны) существенно отличались от таковых в интактной кости. Все это свидетельствовало о том, что через 120 суток процессы адаптивной перестройки не завершены.
Результаты, полученные в предыдущих экспериментах с трансплантацией культуры костномозговых стромальных клеток в коллагеновом геле, показали, что это является наиболее перспективным минимально инвазивным способом введения клеток в область дефекта, что и было использовано в дальнейшей работе.
Данные, установленные в предыдущих экспериментах, послужили основой для дальнейшей разработки способа оптимизации посттравматического остеогенеза в области сегментарного дефекта длинных трубчатых костей. С целью воздействия на регенерацию костной ткани в область дефекта болынеберцовой кости была внесена культура костномозговых стромальных клеток в коллагеновом геле. Результаты опыта свидетельствовали о том, что происходило существенное влияние на ход восстановления костной ткани, что, прежде всего, выражалось в более раннем наступлении этапов репаративного процесса. Фаза ранних посттравматических изменений к 7 суткам сменялась пролиферативной фазой регенерации. При изучении препаратов, полученных на этом сроке, установлено, что остеогенные клетки периоста и эндоста дифференцировались по остеобластическому пути, что приводило к формированию костной ткани регенерата. Регенерат был представлен петлистыми трабекулами костной ткани, промежутки между которыми заполнялись элементами красного костного мозга (рис. 81). Данные изменения наблюдались как со стороны костномозгового канала, так и со стороны периоста. Новообразованные трабекулы ретикулофиброзной костной ткани анастомозировали в области края дефекта (рис. 82). Костномозговой канал в проекции дефекта был заполнен реактивно измененной соединительной тканью, разобщенной формирующимися трабекулами костной ткани. В некоторых участках регистрировались очаги хондрогенеза (рис. 83). Следовательно, при внесении культуры клеток на ранних сроках наблюдали признаки активного остеогенеза, что отличало данных животных от контроля (без пересадки клеток).
