Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Археоциты губок (Porifera) 14
2.2. Интерстициальные клетки (Cnidaria) 16
2.3. Необласты планарий (Platyhelminthes) 18
2.4. Колониальные корнеголовые ракообразные (Arthropoda) 19
2.5. Стволовые клетки колониальных асцидий-ботриллид (Chordata) 23
3. Материал и методы 26
3.1. Сбор материала 26
3.1.1. Oscarella malakhovi 26
3.1.2. Obelia longissima 26
3.1.3. Girardia (Dugesia) tigrina 26
3.1.4. Peltogasterella gracilis, Polyascus polygenea, Peltogaster reticulatus 26
3.1.5. Botryllus tuberatus 27
3.2. Гистологические исследования 27
3.3. Трансмиссионная электронная микроскопия 27
3.4. Сканирующая электронная микроскопия 27
3.5. Цитохимические исследования 28
З.б.Иммунохимические исследования 28
3.7. Выявление продукта гомолога гена vasa Л 29
4. Результаты 30
4.1. Oscarella malakhovi (Porifera) 30
4.3. Girardia (Dugesia) tigrina (Platyhelminthes) 44
4:4. Peltogasterella gracilis, Polyascus polygenea, Peltogaster reticulaius (Arthropoda) 49
4.5. Botryllus tuberatus (Chordata) 63
5. Обсуждение 71
5.1. Археоциты губки Oscarella malakhovi 80
5.2. Интерстициальные клетки книдарии Obelia longissima 81
5.3. Необласты планарий Girardia tigrina 83
5.4. Стволовые клетки корнеголовых ракообразных Peltogasterella gracilis, Polyascus polygenea и Peltogaster reticulatus 84
5.5. Стволовые клетки асцидии Botryllus tuberatus 89
Заключение 91
6. Выводы 95
Список литературы
- Интерстициальные клетки (Cnidaria)
- Girardia (Dugesia) tigrina
- Цитохимические исследования
- Peltogasterella gracilis, Polyascus polygenea, Peltogaster reticulaius (Arthropoda)
Введение к работе
Актуальность проблемы
Эмбриональные стволовые клетки человека широко исследуются ввиду перспектив их практического применения для клеточной терапии; такие исследования составляют основу новых биомедицинских технологий. Для понимания клеточных, субклеточных и молекулярных механизмов, определяющих особенности морфофункциональной организации тотипотентных стволовых клеток, дающих начало всем клеточным линиям и всему спектру дифференцировок клеток Metazoa, необходимо их сравнительное исследование у различных представителей многоклеточных животных. Однако стволовые клетки беспозвоночных животных, как правило, значительно менее изучены сравнительно с эмбриональными стволовыми клетками млекопитающих. У беспозвоночных с бесполым размножением линия тотипотентных стволовых клеток поддерживается в течение всей жизни организма: это археоциты губок, интерстициальные клетки кишечнополостных, необласты турбеллярий и стволовые клетки колониальных асцидий (Agata, Watanabe, 1999; Shibata et al., 1999; Weissman, 2000; Gschwenter et al., 2001; Peter et al., 2001 и др.). Стволовые клетки колониальных беспозвоночных других таксонов почти не изучены; стволовые же клетки корнеголовых ракообразных, некоторые представители которых имеют колониальную стадию жизненного цикла, впервые обнаружены нами (Isaeva et al., 2001; Shukalyuk et al., 2005, 2007).
Множество молекулярно-биологических данных свидетельствует о том, что поддержание организации и функциональной активности зародышевой плазмы обеспечивается консервативными механизмами, общими для всех исследованных Metazoa от губок, гидроидов и планарий до млекопитающих (Ikenishi, 1998; Shibata, 1999; Wylie, 1999; Metazoa, Cooley, 2000; Исаева, Реунов, 2001; Исаева и др., 2007). Основываясь на литературных и собственных данных, мы» предполагаем подобную консервативность ультраструктурной организации стволовых клеток.
Стволовые клетки исследованных нами колониальных беспозвоночных обладают морфологическими характеристиками, общими для стволовых, эмбриональных и первичных половых клеток всех Metazoa: крупным светлым ядром с деконденсированным хроматином, крупным ядрышком, компактной базофильной цитоплазмой, детерминантами зародышевой плазмы характерной ультраструктурной морфологии (Isaeva et al., 2001, 2005; Shukalyuk et al., 2005, 2007; Ахмадиева и др., 2007; Исаева и др., 2007).
Работа направлена на решение проблемы общности и консерватизма морфофункциональной организации тотипотентных стволовых клеток Metazoa путем изучения беспозвоночных животных с бесполым размножением и постоянной-самоподдерживающейся линией тотипотентных стволовых клеток, способных продуцировать как половые, так и соматические клетки. Молекулярно-биологические данные других авторов свидетельствуют о древних консервативных механизмах функциональной организации детерминантов линии половых клеток Metazoa. Половые, или зародышевые детерминанты исследовались в качестве ультраструктурного маркера тотипотентных стволовых клеток беспозвоночных животных. Цитохимическим маркером стволовых клеток была избрана цитохимическая реакция выявления активности щелочной фосфатазы, ранее широко использованная для идентификации эмбриональных стволовых клеток и первичных половых клеток млекопитающих (Chiquoine, 1954; Mintz, 1959; Talbot et al., 1993; Thomson et al., 1995, 1998 и др.). На беспозвоночных животных подобные исследования впервые проведены нами. В качестве молекулярного маркера тотипотентных стволовых клеток (Shibata et al., 1999; Mochizuki et al., 2001; Shukalyuk et al., 2007) применено выявление специфической избирательной экспрессии продукта гена vasa методом гибридизации in situ. Цель работы - исследовать структурную и функциональную организацию стволовых клеток представителей пяти типов многоклеточных животных: Porifera, Cnidaria, Platyhelminthes, Arthropoda и Chordata в связи с теоретической и практической важностью изучения эмбриональных стволовых клеток, а также проблемами обособления линий половых и соматических клеток, бесполого размножения, колониальное™, стратегии размножения и развития Metazoa.
Для достижения цели исследования поставлены следующие задачи:
1. Изучить ультраструктурные особенности стволовых клеток губки Oscarella malakhovi (Porifera).
2. Изучить ультраструктурные, цитохимические и иммунохимические особенности стволовых клеток гидроидного полипа ОЪвИа longissima (Cnidaria).
3. Изучить ультраструктурные особенности стволовых и гониальных клеток планарии Girardia (Dugesia) tigrina (Platyhelminthes).
4. Изучить ультраструктурные, цитохимические и иммунохимические особенности стволовых и эмбриональных клеток корнеголовых ракообразных Peltogasterella gracilis и Polyascus polygenea (Arthropoda).
5. Изучить ультраструктурные и цитохимические особенности стволовых клеток асцидии Botryllus tuberatus (Chordata).
6. Провести сравнительный морфофункциональный анализ стволовых клеток исследованных представителей Metazoa.
Научная новизна
Сведения о стволовых клетках большинства колониальных беспозвоночных неполны, а для некоторых таксонов до сих пор отсутствуют. Мы впервые начали проводить на беспозвоночных животных исследования с выявлением активности щелочной фосфотазы как маркера, тотипотентных (или плюрипотентных) стволовых клеток. Исследованы стволовые клетки (археоциты) у недавно- описанного вида бесспикульной губки Oscarella malakhovi. В цитоплазме археоцитов впервые обнаружены терминальные гранулы.
В больших интерстициальных клетках колониального гидроида Obelia longissima найдены терминальные гранулы (именуемые у других исследованных видов гидроидов плотными телами). Выявлено специфическое окрашивание интерстициальных клеток при цитохимической реакции на щелочную фосфатазу; найдена позитивная реакция больших интерстициальных клеток при иммунохимической реакции выявления ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA).
В необластах (стволовых клетках) и гениальных клетках планарии Girardia tigrina найдены терминальные гранулы типичной морфологии (именуемые у планарии хроматоидными телами).
Стволовые клетки колониальных корнеголовых ракообразных впервые обнаружены и исследованы нами. Показано, что при почковании столонов интерны стволовые клетки дают начало зачаткам бластозооидов, а затем мигрируют в зачаток яичника, становясь гониальными клетками. В стволовых клетках Peltogasterella gracilis найдены терминальные гранулы типичной морфологии. В терминальных гранулах дробящихся эмбрионов Polyasciis polygenea обнаружена специфическая избирательная экспрессия-продукта гена vasa - маркера клеток половой линии и тотипотентных стволовых клеток беспозвоночных. Стволовые клетки Peltogasterella gracilis - единственный тип клеток, проявляющих интенсивную- позитивную1 реакцию при выявлении ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA).
В ранних почках и сосудистой системе колонии Botryllits tuberatus впервые обнаружены недифференцированные клетки, обладающие морфологическими признаками стволовых и первичных половых клеток многоклеточных животных. Стволовые клетки, содержат мелкие терминальные гранулы, сходные с материалом nuage позвоночных животных. В развивающихся почках и некоторых клетках популяции гемоцитов выявлена интенсивная экспрессия активности щелочной фосфатазы, цитохимического маркера эмбриональных стволовых и первичных половых клеток позвоночных животных.
Таким образом, в результате проведенного анализа выявлены общие ультраструктурные, а также некоторые цитохимические и молекулярные особенности строения стволовых клеток у исследованных представителей типов Porifera; Cnidaria, Platyhelminthes; Arthropoda и Ghordata;
Теоретическое и практическое значение
Для; понимания фундаментальных механизмов; обеспечивающих поддержание тотипотентности и потенциального бессмертия клеток половой линии и стволовых клеток необходимо сравнительное исследование таких клеток у различных представителей многоклеточных животных. У беспозвоночных животных с бесполым размножением тотипотентные: (по меньшей мере, плюрипотентные). клетки:.— источник клеточного материала для; реализации жизненной стратегии, включающею и половое m бесполое размножение; эти клетки способны дифференцироваться в= половые: и соматические клетки. В цитоплазме клеток половой линии / найдены специфические ультраструктурные маркеры (половые детерминанты) — плотные фибриллярные или гранулярные тельца, именуемые у разных животных терминальными гранулами; полярными гранулами; хроматоидными телами, плотными телами, нуаж (nuage) и т.д. Молекулярно-биологические данные (Ikenishi, 1998; Saffman, Lasko;-1999; Houston; King, 2000; Matova; Gooley, 2001) свидетельствуют о том; что некоторые молекулы, локализованные в гранулах половых детерминантов, действительно вовлечены в детерминацию клеток половой линии, а особенности структурной организации цитоплазмы и функциональной активности; клеток половой линии обеспечиваются консервативными механизмами;.общими;для исследованных . многоклеточных животных. Предполагается подобный консерватизм ультраструктурной организации тотипотентных стволовых клеток.
Апробация работы
Материалы исследований докладывались на ежегодной конференции молодых ученых ИБМ ДВО РАН (2007 г.), на научных семинарах лаборатории продукционной биологии ИБМ ДВО РАН (2005, 2006, 2007 гг.), были представлены в виде стенда на конференции по клеточной биологии в Сан-Франциско: The American Society for Cell Biology, 45th Annual Meeting, 2005.
Публикации
По теме диссертации опубликованы 5 статей (в том числе 4 статьи из списка, рекомендуемого ВАК), 2 тезисов; 1 статья принята к печати.
Структура работы
Диссертация содержит 117 страниц, работа включает 75 рисунков и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материал и методы, собственные данные, обсуждение, заключение, выводы и список литературы, включающий 213 наименований, из них 187 на иностранных языках.
Благодарности
Выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю, главному научному сотруднику ИБМ имени А. В. Жирмунского ДВО РАН Валерии Васильевне Исаевой за ее постоянную поддержку и внимание и неоценимую помощь в течение всего периода работы по данной теме, а также директору ИБМ имени А. В. Жирмунского ДВО РАН академику Андрею Владимировичу Адрианову. Искренне благодарю А. С. Майорову за помощь в освоении техники работы с трансмиссионным и сканирующим электронными микроскопами, а также в сборе и обработке материала, Я. Н. Александрову за помощь, оказанную при обработке и просмотре материала. Благодарю весь коллектив кафедры клеточной биологии АЭМББТ ДВГУ за полученные знания в области цитологии, а также коллектив лаборатории продукционной биологии ИБМ ДВО РАН за возможность проведения моей научной работы. Я искренне признательна руководителю лаборатории электронной микроскопии ИБМ ДВО РАН Д. В. Фомину за возможность работы на сканирующем и трансмиссионном электронных микроскопах.
Исследования проводились при финансовой поддержке грантов РФФИ (№ 06-04-48744, № 03-04-49544), ДВО РАН (№06-Ш-А-06-162, № 04-2-0-00-009), и программой поддержки научных школ Минобрнауки № 1219.2003.4
Интерстициальные клетки (Cnidaria)
Бесполое размножение - характерная особенность Cnidaria, позволяющая поддерживать количественное постоянство популяции. Широкое разнообразие бесполых процессов обеспечивает как формирование отдельных гидроидов, так и увеличение колонии, и специализацию индивидов колонии.
Новые индивиды развиваются из почек, образованных другими полипами, из медузоидных почек полипов, а также при почковании медуз. Как полип, так и медуза могут развиться на столоне гидроида. Почкование происходит и в медузоидных формах, и в полипоидных. Почкование найдено даже на некоторых личиночных стадиях (Thomas, Edwards, 1991).
Стволовые клетки в эпителии и производные интерстициальных клеток позволяют тканям нормально питающегося гидроида непрерывно и неограниченно расти, приводя к образованию дочерних полипов путем бесполого размножения (Teragawa, Bode, 1990).
У гидры и других представителей книдарий большие интерстициальные клетки (і-клетки) - стволовые клетки, непрерывно находящиеся в митотическом цикле, - продуцируют и половые клетки, и некоторые типы соматических клеток (Campbell, 1974; Айзенштадт, 1984; Tomas, Edwards, 1991; Bode, 1996; Полтева, 1996). Интерстициальные клетки, дающие начало гаметам, способны активно мигрировать. Половые клетки, возникающие из крупных интерстициальных клеток, сначала отличимы от них только большим размером (Айзенштадт, Полтева, 1981, 1982; Tomas, Edwards, 1991). Способность крупных интерстициальных клеток книдарий дифференцироваться в половые клетки позволяет рассматривать их как тотипотентные - независимо от широты спектра их соматических производных.
Интерстициальные клетки найдены прежде всего в пространстве между эпителиально-мышечными эктодермальными клетками, хотя некоторые i-клетки встречаются и в энтодерме (Lentz, 1966; Campbell, Bode, 1983). Эта гетерогенная популяция клеток включает стволовые клетки, которые, в конечном счете, дают начало железистым клеткам, нематоцитам, нейронам и гаметам (Lehn, 1951; Slautterback, Fawcett, 1959; Rich, Tardent, 1969; Davis, 1969, 1971; David, Gierer, 1974; Littlefield et al, 1985; Bode et al, 1987). Исторически интерстициальные клетки считались очень мобильными, ответственными за всю регенерацию и рост гидроида, но с тех пор было показано, что их роль в этих процессах и степень их миграции являются намного более ограниченными (Campbell, 1979). Более детально вклад миграции интерстициальных клеток в поддержании паттерна дифференцированных клеток в процессе роста гидроида остается не выясненным. Использовались различные методы для определения количества и путей миграции интерстициальных клеток, и они привели к противоречивым результатам (Campbell, 1967b; Herlands, Bode, 1974a; Heimfeld, Bode, 1984). Некоторые исследования указывают, что интерстициальные клетки могут мигрировать только в ответ на сигнал о ранении (Fujisawa, 1989).
В крупных і-клетках гидры Pelmatohydra robusta были найдены электронно-плотные тела, подобные или идентичные терминальным телам клеток половой линии (Noda, Kanai, 1977; Mochizuki et al., 2001) У этого вида гидры показано таюке присутствие белкового продукта гомолога гена vasa, вовлеченного в детерминацию тотипотентности клеток, не только в клетках половой линии, но и в тотипотентных стволовых клетках (Mochizuki et al., 2001). Североамериканская пресноводная планария Dugesia (Girardia) tigrina De Vries, Sluys, 1991 (Platyhelminthes, Tricladida, Paludicola), носившая множество синонимов: Planaria tigrina, Euplanaria tigrina, Planaria maculata, Dugesia maculata (Hyman, 1939), представлена на родине двумя расами. Черви одной расы размножаются только бесполым путем, тогда как планариям другой расы свойственно и половое, и бесполое размножение (Kenk, 1937). Планарий Dugesia tigrina бесполой расы культивируется в лабораторных условиях в течение практически неограниченного времени. Пищей им служат мотыль и трубочник. Бесполое размножение планарий происходит путем архитомии с отделением заднего фрагмента тела, после чего оба фрагмента регенерируют недостающие части тела. При регенерации планарий к раневой поверхности мигрируют необласты, образующие раневую бластему, клетки которой дифференцируются, давая все типы соматических клеток. Необласты размножающихся бесполым путем планарий - классические тотипотентные клетки, способные дифференцироваться в половые и соматические клетки (Hori, 1982, 1997; Agata, Watanabe, 1999; Shibata et al., 1999; Orii et al., 2005).
Girardia (Dugesia) tigrina
Корнеголовые ракообразные (Crustacea: Cirripedia: Rhizocephala), Peltogasterella gracilis, Kriiger, 1912 (Kentrogonida: Peltogastridae), паразит раков-отшельников Pagurus pectinatus и Pagurus ochotensis, Polyascus polygenea Glenner, Liitzen, Takahashi, 2003 (Rhizocephala: Kentrogonida: Sacculinidae), паразитирующая на прибрежном крабе Hemigrapsus sanguineus, Peltogaster reticulatus Shiino (Kentrogonida: Peltogastridae), паразит раков-отшельников Pagurus proximus Komai были собраны в осенне-летний период 1998-2007 гг. в зал. Восток (Японское море) в районе Морской биологической станции (МБС) «Восток» Института биологии моря-имени А.
В. Жирмунского ДВО РА№с глубины 1,5-5 w(Peltogasterella gracilis) и 0,1-0,5 м (Polyascus polygenea, Peltogaster reticulatus).
Колонии асцидии Botryllus tuberatus Ritter et Forsyth, 1917 были собраны в районе Морской: биологической станции (МБС) «Восток» Института биологии моря имени А. В: Жирмунского ДВО РАН (на «Бакланьих камнях») с глубины 0;35-0;55 мвсентябре 2005 г. и в августе 2006 г.
Для гистологического исследования участки колоний Obelia longissima, Botryllus tuberanis и Oscarella malakhovi фиксировали - жидкостью Буэна, образцы обрабатывали по стандартным гистологическим методикам, обезвоживали, заливали в парафин; серийные срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином Караччи и заключали в канадский бальзам.
Для? электронно-микроскопического анализа участки колоний фиксировали 2.5% раствором глютаральдегида в.какодилатном буфере (рН 7.4), дофиксировали в 2% четырехокиси осмия (Os04), дегидратировали этанолом и ацетоном и заключали в эпон-аралдит. Ультратонкие срезы (50-60 нм) получали с помощью ультратома Ultracut-E (Reichert), контрастировали 2% водным раствором уранилацетата и цитрата свинца и изучали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEM 100В;
Для сканирующей электронной микроскопии (SEM) небольшие участки колонии Obelia longissima и целых медуз фиксировали 10% формалином на морской воде и 2.5% глутаральдегидом на какодилатном буфере с осмомолярностью 1100 моем. В» дальнейшем материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне, высушивали методом критической точки. Затем образцы монтировали на металлические столики электропроводным клеем и после напыления золотом и платиной исследовали в сканирующих микроскопах Hitachi и LEO-430.
Для выявления активности щелочной фосфатазы использовали принятый для эмбриональных стволовых клеток млекопитающих протокол с некоторыми модификациями методики применительно к использованному материалу (Исаева и др., 2003).
Для метода непрямого авидин-биотинового пероксидазного (АБС-метод) иммунохимического мечения с выявлением ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) парафиновые срезы толщиной 5-10 мкм депарафинировали, устраняли неспецифическое окрашивание (фон). Для увеличения проницаемости мембран прогревали препараты с водным раствором детергента: Препараты, находящиеся в растворе детергента, охлаждали до комнатной температуры, промывали бидистиллированной водой, нагретой до 37С. Затем предварительно окантованные препараты инкубировали в растворе 3% перекиси водорода на 2 М фосфатном буфере и промывали троекратно в бидистиллированной воде.
Для связывания первых (специфических) антител с тканевым антигеном препараты инкубировали во влажной камере с моноклональными антителами мыши (monoclonal mouse anti-PCNA antibodies, clone PC 10, readyo-use) при температуре 37C. Далее многократно промывали дистиллированной водой. Для взаимодействия вторых антител, связанных с биотином, с первыми антителами препараты при температуре 37 С инкубировали со вторыми, биотинилированными антителами (Biotinilated link Dako). Далее отмывали дистиллированной водой.
Цитохимические исследования
Внутри каждой почки столона формируется компактный кластер недифференцированных стволовых клеток, такие же клетки поодиночке мигрируют внутри столона. По нашим данным, стволовые клетки корнеголовых ракообразных обладают морфологическими чертами, общими для эмбриональных, стволовых и половых клеток других многоклеточных животных: высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, крупным ядром с деконденсированным хроматином, крупным ядрышком, тонким ободком интенсивно базофильной цитоплазмы с детерминантами зародышевой (половой) плазмы характерной ультраструктурной морфологии (рис 46, 47, 48). После формирования зачатков бластозооидов стволовые клетки мигрируют в развивающийся яичник будущей экстерны, становясь первичными половыми клетками (Isaeva et al., 2004; Shukalyuk et al., 2005). Таким образом, тотипотентные стволовые клетки колониальных корнеголовых ракообразных служат предшественниками как соматических, так и половых клеток и тем самым обеспечивают их уникальную для представителей членистоногих репродуктивную стратегию с реализацией бесполого и полового размножения.
В ходе дальнейшего развития бластозооидов наблюдаются типичные эпителиальные морфогенезы путем образования складок - инвагинаций и эвагинаций эпителиальных поверхностей; осуществляется раздельное формирование зачатков трофической системы и экстерны, соответственно представляющих собой два различных развивающихся модуля - трофический модуль интерны и модуль экстерны (рис. 49). До выхода зачатка экстерны на поверхность тела краба-хозяина дифференцированы все тканевые и органные системы экстерны, включая яичник с оогониями и ооцитами (рис. 50). В зачатках экстерн осуществляются процессы органогенеза; развивается яичник, окружающая его мантия с полостью и наружным выводным отверстием, рецептакулы (самцеприемники). В поздних зачатках экстерн незадолго до их выхода на поверхность тела хозяина видны ооциты - процесс оогенеза, включая цт
Ультраструктура стволовых клеток нуклеуса P. gracilis Рис. 47. Ультраструктурное строение стволовой клетки P. gracilis: герминальная гранула вблизи ядерной оболочки: м - митохондрия, гг - герминальная гранула
Герминальная гранула в стволовой клетке P. gracilis: гг — герминальная гранула Рис. 49. Развитие зачатков экстерны и трофической системы Polyascus polygenea: зт - зачаток трофической системы, зэ - зачаток экстерны, тк - транспортный канал стебелька зачатка, ппк - первичные половые клетки, мигрирующие в зачаток экстерны. вителлогенез, начинается в зачатках экстерн до их появления на поверхности тела хозяина, т.е. в интерне. Таким образом, визуализировано колониальное строение интерны P. polygenea с множественными элементами репродуктивной и трофической систем. По-видимому, репродуктивный потенциал интерны Р. polygenea весьма велик и способен обеспечить воспроизводство экстерн в течение нескольких лет жизни хозяина и паразита.
Визуализировано и исследовано также колониальное строение интерны Peltogasterella gracilis (рис. 51), прослежено бесполое размножение интерны. В пределах каждой единой связной интерны P. gracilis выявляется множество модульных элементов репродуктивной и трофической систем разного размера и разных стадий развития (рис. 52). Репродуктивные модули могут быть представлены зачатками различных стадий развития: от ранней почки до почти сформированного зачатка экстерны. По-видимому, каждый зачаток интерны, связанный с основной массой колониальной интерны, обеспечен собственным трофическим модулем, локализованным вблизи будущей экстерны (рис. 53, 54) подобно тому, что было выявлено при исследовании колониальной организации Peltogasterella sulcata и схематически изображено в работе Хега и Лютцена (Hteeg, Lutzen, 1995).
Репродуктивная система P. gracilis представлена в каждой интерне многочисленными (многими десятками) бластозооидов разных стадий развития. Самые ранние зачатки возникают в виде почек на эпителиальной столоноподобной структуре, внутри которой рассеяны стволовые клетки, морфологически подобные стволовым клеткам P. polygenea, с компактной базофильной цитоплазмой и крупным ядром с большим ядрышком. Под эпителием почки формируется агрегат таких клеток. Развивающиеся бластозооиды P. gracilis с характерным морфологическим маркером, нуклеусом - более крупные, вытянутые и многочисленные по сравнению с Р. polygenea, образуют на столоне большие связные группы (рис. 53). Выявляется единство колониальной интерны P. gracilis с множеством почек нескольких генераций.
Peltogasterella gracilis, Polyascus polygenea, Peltogaster reticulaius (Arthropoda)
Необласты размножающихся бесполым путем планарии - классические тотипотентные клетки, способные дифференцироваться и в половые, и в соматические клетки (Rieger et al., 1991; Auladell et al., 1993; Agata, Watanabe; 1999; Shibata et al., 1999; Orii et al., 2005). Необласты планарии G. tigrina могут становиться гениальными клетками. По нашим данным, необласты и гониальные клетки планарии Girardia tigrina имеют морфологическое строение, типичное для необластов планарии, а также эмбриональных, стволовых и половых клеток других многоклеточных животных (Isaeva et al., 2005).
Нами получены данные о присутствии хроматоидных тел (терминальных гранул) в необластах и гениальных клетках планарии G. tigrina; терминальные гранулы располагаются вблизи ядерной оболочки, часто в контакте с порами ядерной оболочки, и окружены митохондриями.
Ранее были получены ультраструктурные свидетельства митохондриального происхождения хроматоидных тел (терминальных гранул) в гениальных клетках и необластах планарии G. tigrina -преобразование митохондриального матрикса с кристами внутренней мембраны в терминальные тела (Isaeva et al., 2005). Подобные наблюдения сделаны и нами на необластах этого же вида.
У планарий (Shibata et al., 1999), как и у гидры P. robusta, показано присутствие продукта гомолога гена vasa не только в клетках половой линии, но и в тотипотентных стволовых клетках. Поэтому продукт родственных vasa генов может быть полезен как молекулярный маркер для исследования не только клеток половой линии, но и тотипотентных стволовых клеток (Shibata et al., 1999; Mochizuki et al., 2001).
5.4. Стволовые клетки корнеголовых ракообразных Peltogasterella gracilis, Polyascus polygenea и Peltogaster reticulatus
Колониальная организация некоторых представителей корнеголовых ракообразных (Crustacea: Cirripedia: Rhizocephala) возникает на паразитической стадии их жизненного цикла за счет бесполого размножения (bfoeg, Ltitzen, 1995; Takahashi, Ltitzen, 1998; Касьянов и др., 19976; Исаева и др., 1999); однако процесс бластогенеза убедительно продемонстрирован лишь на немногих видах корнеголовых. Стволовые клетки были обнаружены на паразитической стадии жизненного цикла колониальных представителей корнеголовых Polyascus polygenea и Peltogasterella gracilis (Isaeva et al., 2001, 2004; Исаева и др., 2003; Rybakov, Shukalyuk, 2004; Shukalyuk et al., 2005, 2007; Исаева, Шукалюк, 2007). В интерне этих колониальных корнеголовых ракообразных после формирования зачатков бластозооидов стволовые клетки мигрируют в зачаток яичника как первичные половые клетки (Isaeva et al., 2004; Shukalyuk et al., 2005). При исследовании серийных срезов тканей Р. polygenea вместе с тканями краба-хозяина найдены множественные ранние зачатки экстерн (нуклеусы); авторы сочли удачей выявление, причем лишь в одном случае, связи двух нуклеусов, влюченных в единую корневую систему (Takahashi, Ltitzen, 1998; Ltitzen, 2002).
Внутри каждой ранней почки столонов P. polygenea и P. gracilis найдены недифференцированные стволовые клетки, такие же клетки мигрируют внутри столона. Стволовые клетки корнеголовых обладают общими для эмбриональных, стволовых и половых клеток других многоклеточных животных морфологическими чертами.
Предпосылки к развитию колониальное у корнеголовых ракообразных, вероятно, связаны с возможностью разделения частей развивающейся интерны: как описано для саккулин, клеточная масса ранней интерны случайным образом может делиться на две части, что приводит к образованию двух экстерн с общей корневой системой (Delage, 1884). Закладка множественных нуклеусов- из- эпителиальной стенки, ранней интерны была описана у не колониальной, имеющей одну экстерну Sacculina сагсіпї; показано, что позже все эти нуклеусы исчезают, кроме одного, который развивается в половозрелую экстерну (Rubiliani et al., 1982). По нашим данным, при наличии, как правило, одной экстерны Peltogaster reticulatus в интерне этого вида имеются дополнительные зачатки экстерн, способные заместить экстерну в случае ее утраты- (в результате линьки хозяина или повреждения экстерны). Вероятно, появление нескольких дополнительных зачатков экстерн, дающее дополнительные гарантии для успешного прохождения жизненного цикла паразита - первый этап развития колониальности. Возможно, у колониальных видов с единственной экстерной и несколькими вторичными почками успешное развитие и функционирование экстерны ингибирует развитие вторичных зачатков (Isaeva et al., 2001). Можно предположить, что у всех представителей семейств Sacculinidae, Peltogastridae и Thompsoniidae появились подобные предпосылки для развития колониальной организации. Несомненно, колониальность представителей корнеголовых ракообразных вторична для Arthropoda и всех Ecdysozoa.
