Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1. Обновление эпителиальных тканей млекопитающих. Общие представления 8
1.2. Структура клеточного цикла и методы его исследования. Соотношение процессов пролиферации и дифферен-цировки клеток 15
1.3. Некоторые принципы регуляции обновления клеточных систем 27
1.4. Суточные ритмы клеточной репродукции. Ритмически пролиферирующие клеточные системы как модели для изучения закономерностей обновления клеток 31
1.5. Краткая морфо-физиологическая характеристика эпителия пищевода мышей 37
ГЛАВА 2. Собственные исследования
2.1. Задачи исследования 40
2.2. Материал и методика исследования 41
2.3. Результаты собственных исследований.
2.3.1. Исследование параметров ритмов клеточной пролиферации в контрольной серии опытов 48
2.3.2. Анализ колебаний митотической активности клеток базального слоя эпителия пищевода мышей на протяжении нескольких суток эксперимента 54
2.3.3. Исследование кинетики обновления клеток эпителия пищевода мышей
2.3.3.1. 1-я серия опытов 58
2.3.3.2. 2-я серия опытов 68
2.3.3.3. 3-я серия опытов 78
2.3.3.4. 4-я серия опытов 87
2.3.4. Сравнительная характеристика поведения популяций клеток эпителия пищевода мышей, вступающих в митотический цикл в разное время суток... 97
2.3.4.1. Сравнение кинетики пролиферации 97
2.3.4.2. Сравнение кинетики миграции 100
2.3.4.3. Сравнение суммарной продуктивности популяций 104
2.4. Обсуждение результатов
2.4.1. Структура жизненного цикла клеток эпителия пищевода мышей 106
2.4.2. Клеточно-популяционная организация эпителия пищевода мышей 117
2.4.3. Хронобиологическая характеристика пролиферации клеток эпителия пищевода мышей. Механизмы формирования суточного ритма митотической активности и временные закономерности миграции клеток в эпителии пищевода мышей 124
Выводы 129
Практические рекомендации 131
Список литературы 132
Приложения 153
- Структура клеточного цикла и методы его исследования. Соотношение процессов пролиферации и дифферен-цировки клеток
- Суточные ритмы клеточной репродукции. Ритмически пролиферирующие клеточные системы как модели для изучения закономерностей обновления клеток
- Анализ колебаний митотической активности клеток базального слоя эпителия пищевода мышей на протяжении нескольких суток эксперимента
- Хронобиологическая характеристика пролиферации клеток эпителия пищевода мышей. Механизмы формирования суточного ритма митотической активности и временные закономерности миграции клеток в эпителии пищевода мышей
Введение к работе
Обновляющиеся ткани многоклеточных организмов представляют собой сложные, многокомпонентные клеточные системы. Изучение обновляющихся тканей имеет несомненное теоретическое и практическое значение, так как в них происходят не только физиологическая, но и репаративная регенерация и опухолевый рост. Постоянство клеточного состава в обновляющихся тканях поддерживается в результате сочетания взаимосвязанных процессов репродукции и дифференцировки клеток(Романов, 1969).
Согласно современным представлениям, обновляющиеся ткани включают два принципиально отличающихся клеточных компартмента. В первом из них - пролиферативном - имеют место как репродукция, так и дифференцировка клеток. Во втором - непролиферативном -протекают только процессы дифференцировки и специализации и происходит потеря клеток из состава ткани( Wright, 1981).
В последнее время в клеточной биологии широко обсуждается вопрос о морфофункциональной гетерогенности пролиферативного компартмента обновляющихся клеточных систем(Lajtha, 1979; Романов, Антохин, 1983). Изучение гетерогенности пролиферативного компартмента представляет немалый интерес как в теоретическом аспекте, так и с точки зрения поисков возможностей управления обновлением тканей, поскольку различные клеточные субпопуляции могут обладать разной восприимчивостью к действию регуляторов пролиферации и дифференцировки(Cairns, 1975).
Одним из фундаментальных свойств клеточных систем является суточная периодичность процессов репродукции клеток(Алов, 1959; Романов, 1972; Scheving et al., 1974; Рыбаков, 1979). Уже изучены основные причины и механизмы образования суточных ритмов репродукции клеток и факторы, определяющие их параметры(Романов и др., 1979а; Кузин, 1980), однако вопрос об участии разных популяций клеток в формировании суточных ритмов пролиферативных процес-
сов окончательно не выяснен.
Учитывая важность перечисленных выше аспектов изучения обновляющихся клеточных систем, мы поставили перед собой цель исследовать клеточно-популяционнуго организацию и хронобиологические закономерности обновления эпителия пищевода мышей, а также определить роль клеточно-популяционной структуры этой ткани в формировании суточных ритмов пролиферации.
Структура клеточного цикла и методы его исследования. Соотношение процессов пролиферации и дифферен-цировки клеток
Жизненным(или клеточным) циклом считается весь период существования клетки от момента ее образования в результате деления материнской клетки до гибели или до следующего деления. В общем случае клеточный цикл представляет собой совокупность процессов самоподдержания, пролиферации и специфического функционирования клеток, однако его организация в разных клеточных системах принципиально различается. Клеткам статичных популяций, необратимо теряющим способность к репродукции, свойственны лишь самоподдержание и выполнение специфических функций, тогда как для клеток экспансирующих и обновляющихся тканей характерна гораздо более сложная структура жизненного цикла, включающая пролиферативные процессы.
Комплекс взаимосвязанных и хронологически детерминированных событий, происходящих в клетке в период подготовки к делению и на протяжении самого митоза принято условно называть пролифератив-ным или митотическим циклом(Mazia, 1961). Началом митотического цикла(МЦ) считается тот момент, когда в клетке начинается биохимическая подготовка к делению, а окончанием цикла - завершение в обеих дочерних клетках всех процессов, связанных с делением (Цанев, Марков, 1964). Если очередной МЦ начинается сразу же после окончания предыдущего, то он совпадает с жизненным циклом клетки.
Основную роль в исследовании клеточных циклов играет метод радиоавтографии. В 1953 г. Говард и Пелк(Нстага, Pelc, 1953), изучавшие включение Р в клетки корня конского боба, впервые показали, что период синтеза ДНК занимает лишь ограниченную часть интерфазы. Эти авторы предложили разбить МЦ на четыре периода: собственно митоз(М), пресинтетический период(&), период синтеза ДНЖБ) И премитотический период ). Дальнейшему изучению МЦ способствовали фундаментальные открытия в области строения и функции ,flJHK(Watscm, Crick, 1953), а также использование в качестве предшественника ДНК для радиоавтографии тимидина, меченного % или 14с. Определение параметров МЦ стало возможным, главным образом, благодаря методу "меченых митозов", разработанному Квастлером и сотрудниками(Quastler, Sherman, 1959). Продолжительность периодов МЦ по методу Квастлера-Шермана можно определять графически, регистрируя изменения процента меченых митозов(ММ) в различные про-межутки времени после однократной инъекции Н-тимидина. В течение некоторого времени после однократного введения меченого предшественника в митоз продолжают вступать немеченые клетки, находившиеся в момент инъекции в периоде & . Затем в митоз будут вступать меченые клетки, причем первыми - клетки, меченные в конце, а последними - клетки, меченные в начале s-периода. Позже в митоз начинают вступать немеченые клетки, находившиеся в момент инъекции в периоде Gj. В реальных клеточных системах отрезок времени от момента введения радиоактивного изотопа до появления первых ММ ра - 17 -вен минимальной продолжительности периода о( о min), а средняя продолжительность периода 02 включая половину длительности митоза: t„ +I/2M) равна интервалу времени между моментом введения метки и появлением 50% ММ. Длительность периода S(tg) равна отрезку прямой, соединяющей точки, соответствующие 50% ММ на восходящей и нисходящей ветвях кривой первой волны ММ. Когда меченые клетки повторно вступают в деление, наблюдается новая волна ММ. Интервал времени между первым и вторым максимумами на кривой ММ соответствует продолжительности митотического цикла(Т). Среднюю длительность пресинтетического периода Gj(включая половину длительности митоза) определяют путем расчета: t +I/2M = Т - (tg +tG +I/2M).
Параметры отдельных периодов МЦ можно анализировать и другими способами. Так, продолжительность S-периода часто определяют методом двойного маркирования клеток -тимидином( Pilgrim, Maurer, 1965; Moller, Kleidig , I?82), а также по кривым насыщения, отражающим увеличение индекса меченых клеток при непрерывном введении в клеточную систему %-тимидина(Гущин, 1975). Длительность митоза можно приближенно оценивать по кривой ММ. Для этого суммарную кривую ММ раскладывают на отдельные кривые меченых профаз, метафаз, анафаз и телофаз и определяют время, прошедшее от середины одной фазы до середины другой (Thrasher, 1966). Значительно чаще tjyj определяют с помощью статмокинетических агентов (Рыбаков, 1972; Мамонтов, Синельщикова, 1977), или с помощью малых доз рентгеновского облучения(Яковлев, 1971), вызывающих сдвиги в числе делящихся клеток за короткий, точно регистрируемый промежуток времени.
Для исследования клеточных циклов в последнее время используются методы цитофотометрии(Ьаі;і;, 1973; Darzynkiewicz et al., 1977) и проточной микрофлуориметриифеап, Jett, 1974), основанные на точной количественной оценке содержания ДНК, связанной со специфическими красителями, в ядрах клеток. Эти методы также дают воз - 18 -можность определить долю клеток, находящихся в определенной фазе цикла(Rubin et al., 1983). Микрокиносъемка или фотографирование клеток через небольшие промежутки времени позволяют следить за поведением отдельных клеток в цикле(Lengsfeld etal., 1981). В последнее время для наблюдения за поведением дочерних клеток после митоза используют дифференциальное окрашивание сестринских хро-матид и гомологичных хромосом(КиЪЫеа, Rabinovitch, 1983).
Во многих исследованиях митотического цикла, проводившихся, главным образом, на тканях и культурах клеток млекопитающих, было показано, что периоды S, Gg и М имеют, как правило, небольшую продолжительность, а весь отрезок МЦ от начала синтеза ДНК до окончания митоза более стабилен по длительности, чем период Gj, за счет которого чаще всего и происходит варьирование общей длительности клеточного цикла(ш.і;спі8оп, 1971). Длительность периода Gj сильно варьирует не только в разных тканях одного и того же вида организмов (Чумак, 1963; Quastler, Sherman, 1959; Cameron, Greulich, 1963), но и в разных популяциях клеток одной и той же ткани(Burns et al., 1976; Рыбаков и др., 1979). Изменение скорости пролиферации клеточных популяций в результате варьирования условий, или в результате экспериментальных воздействий также может быть связано с колебаниями G (Baserga, 1965). Таким образом, регуляция темпа пролиферации осуществляется в первую очередь за счет изменения длительности периода Gr(Prescott, 1968).
Суточные ритмы клеточной репродукции. Ритмически пролиферирующие клеточные системы как модели для изучения закономерностей обновления клеток
Одним из основных свойств биологических систем является их временная организация, выражающаяся в существовании ритмов различных физиологических и молекулярных процессов(Питтендрай, 1964; Романов, Рыбаков, 1973а). Одним из проявлений периодичности в живых системах являются суточные и околосуточные ритмы пролифера-тивной активности, характерные для большинства организмов(Алов, 1959; Романов, 1969). Для характеристики ритмов делящихся и ДНК-синтезирующих клеток предложен графически-параметрический метод, разработанный Ю.А. Романовым и сотрудниками(Романов и др., 1979а). Метод будет детально разобран в разделе "Материал и методы".
Наиболее подробно особенности суточных ритмов пролиферации изучены у млекопитающих. В нормальных условиях для разных органов характерна определенная структура ритма пролиферации. В частности, у грызунов в эпителии кишечника наблюдается двуфазный ритм числа . ДНК-синтезирующих и делящихся клеток(Сатегоп, Greulich, 1963), а в эпидермисе, эпителиях языка, роговицы и пищевода - монофазный (Pilgrim, Maurer, 1963; Романов, 1969; Рыбаков, 1973; Кузин, Романов, 1979). Данные, приведенные в табл. I, показывают, что в эпителии пищевода мышей ритмы индекса меченых ядер(ЙМЯ) и митотичес-кого индекса(МЙ) являются монофазными. Активная фаза ритма ИМЯ приходится, как правило, на вечерние-ночные часы, а активная фаза ритма МИ - на ночные-утренние часы. Некоторое варьирование результатов разных работ обусловлено влиянием экзогенных и эндогенных факторов регуляции ритмов.
Будучи по природе эндогенными, циркадные ритмы пролиферации синхронизируются внешними датчиками времени(Ашофф, 1964), среди которых наиболее важным является фоторежим(Романов и др., 19796). К настоящему времени выявлен ряд закономерностей фотопериодической регуляции деления клеток. В условиях свето-темнового периода, равного 24 ч, наблюдаются стабильные ритмы пролиферации клеток (Романов и др., 1979а). При постоянном освещении происходит постепенное затухание ритмов клеточной репродукции(Рыбаков, 1979), Инверсия освещения вызывает перестройку и, в конечном счете, инверсию ритмов пролиферации, происходящую путем фазового сдвига (Кузин, 1980), или в результате десинхронизации процессов пролиферации (Филиппович, 1980).
Определенное значение для формирования суточных ритмов имеют режим кормления животных(Sohulte-Hermaim, Landgraf, 1974), условия содержания животных(Moller, 1978), время года, в которое проводят опыты(Романов, 1969; Рыбаков и др., 1977,1979). Большую роль играет также возраст животных. Ю.А. Романовым и соавторами было отмечено, что в ходе онтогенеза происходит фазовая перестройка ритмов деления клеток(Романов, Рахматуллина, 1971). Ритмы пролиферации различаются также у животных разного пола и разных линий(Епифанова, 1965; Соколов, Кузнецов, 1978).
Феномен суточного ритма пролиферативной активности в настоящее время объясняется изменениями количества клеток, вступающих в пролиферацию в разное время суток(Brown, Berry , 1968; Izqui-erdo, Gibbs, 1972,1974; Романов, 1981). В результате изучения взаимосвязи ритмов ИМЯ и МИ сложилось представление о синхронизации кинетики клеток в периоде Gjtan в состоянии G ), определяющей последовательное наступление подъемов ИМЯ и МИ(Гущин, 1977; Рыбаков и др., 1977,1979).
На основании анализа параметров ритмов и кинетики репродукции клеток эпителия пищевода мышей, содержавшихся в нормальных условиях и при инвертированном фоторежиме, СМ. Кузин(1980) предложил следующую модель формирования и регуляции суточного ритма пролиферации:
Информация об изменении освещения воспринимается зрительным анализатором, что вызывает соответствующую перестройку в функционировании нервной и эндокринной систем. Это, в свою очередь, вызывает изменение интенсивности действия фактора, синхронизирующего репродукцию клеток. Влияние синхронизирующего фактора, вызывающего переход клеток из состояния G0 в Gj-период является основной причиной формирования "волн пролиферации". Наблюдаемые ежесуточные подъемы МИ и ИМЯ являются отражением синхронного прохождения клетками s-периода и митоза. Смещение действия синхронизирующего фактора во времени вызывает фазовый сдвиг ритмов ИМЯ и МИ (как это и было показано при инверсии режима освещения). Кроме того, определенную роль в регуляции ритма пролиферации играют колебания длительности всех периодов МЦ на протяжении суток и, в частности, изменения tQ . По мнению ряда авторов, изменение tG на 1,5 - 2 ч может дополнительно синхронизировать клетки перед мито-зом(Романов, Антохин, 1983). Вероятно, параметры ритма пролиферации зависят и от влияния фактора, комитирующего клетки после митоза в состояние покоя или к дальнейшей пролиферации(фактор, действующий в дихофазе). Уменьшение потока клеток в Gj-период снижает долю клеток, более поздно вступащих в S-период по сравнению с клетками, вступающими в пролиферацию из в0-состояния. Этот механизм облегчает возможность фазового сдвига ритма репродукции клеток (Кузин, 1980).
Анализ колебаний митотической активности клеток базального слоя эпителия пищевода мышей на протяжении нескольких суток эксперимента
По оси абсцисс - время суток, ч. Заштрихованный участок шкалы обозначает темновой период суток. зывается весьма существенной, следует предположить, что (IЗначительная часть клеток, синтезирующих ДНК, в течение долгого времени не вступает в митоз, задерживаясь в &г -периоде или в н -состо-янии, или что (2)длительность митоза меньше І ч. В 1-й - 4-й сериях мы установили, что число клеток, длительно задерживающихся в G 9 ) невелико. Поэтому второе предположение кажется нам более корректным. Если допустить, что tjjpp. =0,75 ч(Pilgrim, Maurer, 1965; Маркелова, 1976), то FM составит 1Ь5%, а Рмд - 96,5/оо. Эти показатели будут вполне соответствовать имеющимся значениям Ps и Рвдф. Относительные величины фракций клеток, синтезирующих ДНК и делящихся в периоды Ш соответствующих ритмов оказались весьма близкими. Это свидетельствует о том, что клетки, синтезирующие ДНК в период АШ ритма ИМЯб синхронно проходят S- и в -периоды МЦ и вступают в митоз, формируя при этом АФ ритма МИ.
Меченые ядра в слоях выше базального были обнаружены на всех сроках исследования. Максимальные значения ИМЯв приходятся на тем-новой - начало светового периода суток, минимальные - на световой период. В течение короткого промежутка времени после инъекции Н-Т мигрировать из базального слоя могут лишь меченые клетки, находящиеся в s-периоде, или меченые клетки, только что завершившие синтез ДНК и перешедшие в период 2» Быстрая миграция s- или Gg-кле-ток из базального слоя может объяснить присутствие меченых ядер через 45-60 мин после инъекции только в шиповатом слое. В то же время меченые ядра были обнаружены и в слоях, расположенных значительно выше шиповатого. Трудно представить, что за указанное время меченые клетки могут переместиться в зернистый и вышележащие слои(на 25-30 мкм). Кроме того, среднесуточная интенсивность мечения ядер в слоях выше базального составляет 9 зерен на ядро, в то время как среднесуточная интенсивность мечения ядер в базальном слое составляет 20 зерен. Эти факты свидетельствуют о том, что наличие меченых ядер в зернистом, блестящем и кератинизирующихся слоях, вероятно, обусловлено не миграцией клеток, а дополнительным синтезом ДНК или другими причинами.
В целом изменения числа меченых клеток в слоях выше базально го характеризуются суточной ритмичностью. Параметры суточного ритма ИМЯв приведены в табл. 4 и на рис. 5. Отметим, что ритм ИМЯв сходен с ритмами ЙМЯб и МИ(практически одинаковы Ьд , близ ки ОА и КС) и отстает от них по фазе на 4,5 и 0,5 ч соответствен но. Интенсивность мечения ядер в базальном слое обнаруживает ритмические изменения(максимальные значения ИМКб наблюдаются на протяжении светового, а минимальные - на протяжении, темнового периодов суток). Интенсивность мечения ядер в слоях выше базального не обнаруживает четких ритмических изменений.
Результаты контрольной серии свидетельствуют о корректности выбора времени для однократного введения %-Т в 1-й - 4-й сериях опытов. Инъекции препарата в 1.00 и в 07.00 ч позволили пометить клетки, вступающие в S-период(или находящиеся в нем) во время Ш ритма ИМЯб, а инъекции в 13.00 и в 19.00 ч - во время пассивной фазы.
В каждой из четырех основных серий опытов обнаружен монофазный ритм колебаний Мй(рис. 7, II, 15, 19), АФ которого ежесуточно приходятся на конец темнового - начало/ светового периода. Для выяснения закономерностей формирования пролийеративного ритма необходимо сравнивать показатели, полученные в разные сутки опыта. Схема постановки эксперимента позволила нам сравнивать не только те параметры ритма МИ, которые были получены в разные сутки в одной и той же серии опытов, но и параметры, полученные в разные сутки в разных сериях опытов. Поэтому можно считать, что наши результаты равноценны тем, которые могли бы быть получены в 13 - 14 -суточном эксперименте.
Графически-параметрический анализ(табл. 5, рис. 6) показал, что различные параметры суточного ритма МИ характеризуются неодинаковой вариабельностью. Наименее устойчивы коэффициент синхронизации, положение во времени начальных моментов АФ, величина Рмщ и ОА. Более стабильны величины X, АА, FM, FM и положения во времени Акрф, минимума МИ, ЬАФ, -АФ и конечных моментов АФ. Сле-дует подчеркнуть, что, хотя количество клеток, делящихся за сут-ки(Рм) варьирует значительно, относительная величина фракции клеток, делящихся в периоды АФ ритма МИ, колеблется в небольших пределах и составляет в среднем 69% от FM.
Хронобиологическая характеристика пролиферации клеток эпителия пищевода мышей. Механизмы формирования суточного ритма митотической активности и временные закономерности миграции клеток в эпителии пищевода мышей
Методом меченых митозов мы определили параметры МЦ клеток по-пуляций, маркированных Н-Т в разное время суток(см. разд. 2.3.4. I., табл. ZZ). Продолжительность S-периода для клеток исходных меченых популяций варьирует незначительно, причем минимальная длительность S-периода зарегистрирована в 1-й серии опытов(6 ч), а максимальная - в 3-й серии(8,4 ч). В общем, S-период оказался более продолжительным для клеток, включивших Н-Т в 13.00 и в 19. 00 ч. Варьирование ts в разных клеточных популяциях может быть объяснено большей синхронностью клеток, меченых в 1.00 и в 7.00 ч по сравнению с клетками, мечеными в 13.00 и в 19.00 ч. Однако, поскольку длительность S-периода, определяемая по кривой меченых митозов, является усредненным показателем для реальной клеточной популяции, можно считать, что в действительности клетки, маркирован-ные Н-Т в 1.00 и в 7.00 ч проходят S-период МЦ быстрее, чем клетки, меченые в 13.00 и в 19.00 ч.
В разных сериях опытов мы наблюдали изменения продолжительности отрезка G + I/2M МЦ в пределах от 2 до 3 ч. Это может быть связано как с изменениями продолжительности периода Gg, так и с изменениями длительности митоза в разное время суток. Данные литературы указывают на незначительные колебания t в эпителии пищевода грызунов на протяжении cyTOK(Tvermyr, 1969; Рыбаков, 1972). Поэтому можно полагать, что колебания tQ + I/2M обусловлены, глав-ным образом, изменениями длительности периода G2 Минимальная зарегистрированная продолжительность Gp-периода составляет І ч, а максимальная -2ч. Скорость прохождения клетками премитотического периода определяется несколькими механизмами. К числу эндогенных факторов контроля поведения клеток в периоде Gg можно отнести степень конденсации хроматина, состояние центриолей, содержание в клетке продуктов генов, ответственных за вступление ее в митоз(Епифанова, 1973; Фактор и др., 1979). Экзогенными регуляторами, действующими на клетки в Gp-периоде являются, прежде всего, кейлоныСРоманов, 1981; Торшина, Симбирцев, 1983) и гормоны(Рыбаков, 1972). Воздействие указанных факторов на клетки в периоде Gg может замедлить процессы подготовки к митозу или даже блокировать клетки перед делением(ОеиЄаігЬ, 1963; Епифанова, 1967; Романов и др., 1972). В последнем случае клетки, длительное время задерживающиеся в премитотическом периоде, образуют резервную популяцию, находящуюся в состоянии покоя RpCGelfant, 1977; Clausen et al#j 1981). Вопрос о наличии в эпителии пищевода мышей клеток в состоянии покоя Вп представляет интерес. Согласно данным ряда авторов, в многослойных эпителиях различных животных часть клеток базального слоя может формировать Ир-популяциюСCameron, Cleffmann, 1964; Романов, 1969; Кузин, 1980; Романов, Антохин, 1983). В нашем исследовании первая волна меченых митозов во всех сериях опытов достигает практически стопроцентного уровня. Это означает, что в митоз не входят немеченые клетки, длительное время блокированные в Gp-периоде, или находившиеся в состоянии покоя Rg. Кроме того, в 1-й, 2-й, 3-й сериях через отрезок времени после инъекции Н-Т, равный ts+ tG + I/2M мы зарегистрировали удвоение суммарного ин 2 декса мечения(ИМЯ) в эпителии. Следовательно, в популяциях, меченых в 1.00, 7.00 или в 13.00 ч, отсутствуют клетки, задерживающиеся длительное время в Gp- или S-периодах. Однако в 4-й серии опытов через ts + "t-Go + I/2M после инъекции метки удвоения ИШ2 не наблюдается. Это может быть обусловлено задержкой части меченых в 19.00 ч клеток в S-, или й -периодах. Эти данные указывают на возможность существования Rn-популяции в эпителии пищевода мышей, однако ее объем весьма незначителен.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что большая часть клеток базального слоя эпителия пищевода мышей проходит отрезок МЦ S- Gp- M без длительных задержек в этих периодах. Незначительное количество клеток после завершения редупликации ДНК может быть блокировано в периоде Gg» Продолжительность отрезка S- -Gry M в разных сериях опытов варьирует незначительно, что указывает на отсутствие существенных различий в кинетике клеток популяций, проходящих эту часть МЦ в разное время суток. Это, в свою очередь, говорит о детерминированности и одинаковой последовательности событий МЦ для большей части пролиферйрующих клеток базального слоя.
Продолжительность периода Gj сильно варьирует во всех сериях опытов. Наименьшие значения t„ + I/2M были зарегистрированы для отдельных клеток популяций, меченных Н-Т в 7.00 и в 19.00 ч(2 ч). Не исключено, что подобные клетки вступают в S-период следующего МЦ сразу после завершения митоза. Известно, что отсутствие периода Gj наблюдается при размножении прокариотов и низших эукариотов, а также на ранних этапах эмбриогенеза многоклеточных животных (Cooper, 1979; Ротт, 1980). В экспериментах по гибридизации клеток млекопитающих, находящихся в раннем периоде Gj с клетками, синхронизированными в периоде S, ядра Gj-клеток немедленно начинают редупликацию ДНК(Иао, Johnson, 1970; Stein, 1983). Эти данные показывают, что немедленное вступление клеток, завершивших митоз, в S-период следующего МЦ принципиально возможно при наличии условий для инициации репликации ДНК. Следует, однако, отметить, что в нашем исследовании обнаружено крайне незначительное число клеток, вступающих в S-период сразу после митоза.
Для большей части клеток всех изученных популяций, последовательно проходящих два и более МЦ, период Gj в среднем составляет 18 ч, хотя максимальная зарегистрированная продолжительность его равна 73 ч. Как известно, в периоде Gj происходит подготовка к редупликации ДНК. Однако подготовка к репликации занимает не весь период Gj, а лишь его часть. В тех случаях, когда продолжительность периода Gj очень велика, обычно считается, что клетки вступают в период S из состояния покоя Rj, проходя пререпли-кативный период GjS или период трансформацииСBaserga, 1974; Терских, 1979). Клетки могут перейти из состояния покоя G в пререп-ликативный период только при наличии необходимых условий, в частности - при отсутствии-эндо- и экзогенных ингибиторов пролиферации и при достаточно высоком уровне содержания внутриклеточных факторов инициации репликации. В нашем эксперименте в 1-й, 3-й и 4-й сериях опытов длительность периода Gj для клеток популяций, последовательно формирующих первый и второй подъемы кривой ПММ, оказалась практически одинаковой. Вторые подъемы кривых ПММ в 3-й и 4-й сериях опытов не совпадают во времени с АФ ритма МИ. Эти факты позволяют считать, что часть клеток популяций, маркирован-ных Н-Т в 13.00 и в 19.00 ч после завершения первого по счету МЦ не подпадает под влияние периодического синхронизатора пролиферации и продолжает размножаться в собственном ритме. Вероятно, на эти клетки не действуют также экзогенные ингибиторы пролиферации, поскольку они не задерживаются длительно в периоде GQ, а проходят период Gj в среднем за 18 ч и вступают в S-период следующего МЦ. На основании сказанного можно предположить, что период Gj для клеток 1-й - 4-й серий опытов, вступающих во второй МЦ непосредственно после первого по длительности незначительно превышает пре-репликативный период Gj-s. Тогда средняя продолжительность пререп-ликативного периода для клеток базального слоя эпителия пищевода мышей оказывается близкой к 18 ч.
