Введение к работе
Актуальность проблемы. Несмотря на успехи в изучении причин и особенностей онкологических заболеваний, их частота и смертность от них продолжают увеличиваться (American Cancer Society, 2005). В последние 50 лет лечение злокачественных заболеваний, наряду с хирургическими методами, преимущественно основано на использовании различных форм цитотоксической химио- и радиационной терапии. С помощью данных видов терапии достигнуты определенные успехи в лечении ряда злокачественных заболеваний крови и некоторых солидных опухолей, а также метастазов. Однако эффективность химиотерапии часто ограничивается устойчивостью опухолевых клеток к используемым препаратам (Tsuruo Т. et al., 2003). Исследования последних лет показали, что клеточные механизмы лекарственной устойчивости разнообразны: от ограничения накопления вещества внутри клетки до отмены программы гибели клетки, индуцируемой веществом (Ставровская А.А., 2000).
Снижение накопления цитотоксического препарата в клетке может быть результатом увеличения скорости его выведения. Главную роль в этом процессе отводят трансмембранному белку - Р-гликопротеину, который функционирует как энергозависимый насос, способный выводить из клетки широкий спектр цитотоксических веществ (Ford J.M. et al., 1990). Р-гликопротеин является продуктом гена mdrl, увеличение уровня экспрессии которого коррелирует с приобретением опухолевыми клетками фенотипа множественной лекарственной устойчивости (Garraway L.A. et al., 2002). Показано, что при лечении острой лейкемии (Pirker R. et al., 1992; Zhou D.C. et al., 1992), различных миелом (Salmon S.E. et al., 1989; Musto P. et al., 1991), сарком (Chan H.S. et al., 1990) и нейробластом (Goldstein L. et al., 1990) химиотерапия является неэффективной из-за повышения экспрессии гена mdrl.
Эффективность терапевтического действия ряда противораковых препаратов зависит от способности этих веществ запускать в чувствительных опухолевых клетках апоптоз (Fisher D., 1994). Данный тип клеточной гибели имеет ряд преимуществ по сравнению с некрозом, не только в отношении эффективности действия химиопрепаратов, но и в отношении побочных явлений: некротическая гибель клеток, в отличие от апоптотической, всегда сопровождается развитием воспалительного процесса и гибелью окружающих клеток и тканей (Kroemer G. et al., 1998; Henson P.M. et al., 2001) В настоящее время в клинике используется целый ряд химиопрепаратов, которые запускают апоптоз в опухолевых клетках (Kaufmann S.H. et al., 2000). Неспособность химиопрепаратов включить апоптоз в малигнизированных клетках может являться причиной устойчивости к их действию. Это, в свою очередь, является следствием того, что в опухолевых клетках нарушены механизмы апоптоза. К наиболее часто встречающимся нарушениям относят изменение уровня экспрессии протоонкогена bcl-2 и гена онкосупрессора р53 (O'Connor P.M. et al., 1997; Dive С, 1997). Повышенная экспрессия гена bcl-2 является маркером устойчивости опухолевых клеток к химиотерапии при некоторых видах лимфом, лейкозах, а также при нейробластоме, раках предстательной железы и
яичника (DiPaola R.S. et al., 1999; Beale P.J. et al., 2000). Это объясняется тем, что белковый продукт данного гена препятствует запуску апоптоза по внутреннему (митохондриальному) пути.
Очевидно, что все изменения на молекулярно-генетическом уровне, имеют свое отражение в морфологических характеристиках опухолей. Изучение этих характеристик может дать представление о целостной картине перестроек, которые происходят в структурах тканей опухолей, приобретающих резистентность к химиопрепаратам. Однако в настоящее время работ, посвященных исследованию морфологии клеток, обладающих устойчивостью к противоопухолевым препаратам, очень мало.
Уникальной моделью для комплексного изучения особенностей опухолей, оппозитных по чувствительности к химиопрепаратам (в частности, к циклофосфану), являются высокочувствительная (LS) и резистентная (RLS) лимфосаркомы мышей. Терапевтический эффект циклофосфана на клетки опухоли LS опосредуется путем запуска в них апоптоза (Каледин В.И. и др., 2000). Субштамм RLS был получен нами из LS путем многократных внутримышечных перевивок рецидивов этой опухоли, возникающих после воздействия циклофосфаном при постепенном повышении дозы. Подобное приобретение устойчивости к химиопрепаратам во время проведения курса терапии широко распространено в клинической практике и является одной из важнейших проблем в лечении злокачественных заболеваний (Seki М. et al., 1999).
Сравнительное изучение двух лимфосарком - чувствительной (LS) и резистентной (RLS) - может дать понимание механизмов лекарственной устойчивости к циклофосфану, широко применяемому в клинике при лечении неходжкинских лимфом, разнообразных сарком костных и мягких тканей, а также острого лейкоза лимфобластического типа (Moore M.J., 1991).
Цель работы: выявить морфогенетические особенности оппозитных по чувствительности к циклофосфану лимфосарком мышей, являющиеся основой лекарственной устойчивости опухолей.
Задачи исследования:
1. Сравнить чувствительность опухолевых клеток LS и RLS к ряду
химиопрепаратов, оказывающих свой эффект на клетки посредством различных
механизмов.
2. Сравнить в клетках двух субштаммов LS и RLS лимфосаркомы мышей
уровни экспрессии генов mdrla и mdrlb, белковые продукты которых
участвуют в процессах выведения цитотоксических веществ из клеток
опухолей.
Сравнить в клетках двух субштаммов LS и RLS лимфосаркомы мышей уровни экспрессии генов р53 и bcl-2, белковые продукты которых участвуют в процессе апоптоза, запускаемого, химиопрепаратами.
На светооптическом уровне сравнить морфологию опухолей LS и RLS до и после введения животным циклофосфана через различные' временные интервалы.
5. Изучить особенности ультраструктуры клеточных элементов опухолей LS и RLS до и после введения животным циклофосфана через различные временные интервалы.
Научная новизна результатов исследования. Впервые проведено сравнительное исследование двух субштаммов лимфосаркомы LS и RLS по их чувствительности к противоопухолевому действию ряда химиопрепаратов (циклофосфана, адриамицина и цисплатина), а также к их комбинации in vivo. Показано, что лимфосаркома RLS является высокорезистентной к действию не только циклофосфана, но и к действию других исследованных химиопрепаратов.
Впервые в клетках лимфосарком LS и RLS исследована экспрессия генов р53, bcl-2, mdrla и mdrlb, изменение уровня которой может приводить к возникновению лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Показано, что для клеток лимфосаркомы RLS, по сравнению с LS, характерны повышенные уровни экспрессии генов mdrlb и bcl-2 и пониженные - р53 и mdrla.
Впервые проведено сравнение морфологии интактных лимфосарком LS и RLS, а также их структурных реакций на введение циклофосфана животным на светооптическом и электронномикроскопическом уровнях. Показано, что лимфосаркома RLS обладает признаками способности к агрессивному росту и метастазированию. Для интактной лимфосаркомы LS характерно более высокое значение апоптотического индекса, что свидетельствует о большей способности данной опухоли к спонтанному апоптозу. При этом митотические индексы интактных опухолей не различаются. Показано, что в ответ на введение циклофосфана клетки лимфосаркомы RLS отвечают накоплением липидных включений, что может являться одним из механизмов защиты опухолевых клеток от повреждающего действия циклофосфана. В отличие от лимфосаркомы LS, клетки которой подвергаются апоптозу в ответ на введение животным циклофосфана, клетки лимфосаркомы RLS, преимущественно, погибают путем некроза, сопровождаемого мощным воспалительным процессом.
Теоретическое и практическое значение работы. Комплексное изучение уникальной модели оппозитных по чувствительности к циклофосфану субштаммов LS и RLS лимфосаркомы мышей позволит выявить механизмы лекарственной устойчивости опухолевых клеток к действию химиопрепаратов и найти пути ее преодоления.
Проведенное исследование имеет общебиологическое значение в плане расширения представлений о морфогенетических механизмах защиты клеток, вообще, и опухолевых, в частности, от токсических воздействий.
Ряд полученных результатов имеет большое значение для клиники: необходимость индивидуального подбора схемы терапии злокачественных новообразований; использование в качестве одной из важных характеристик не только митотической активности, но и интенсивности спонтанной апоптотической гибели опухолевых клеток; выбор комплексного подхода при разработке инновационных методик генной терапии злокачественных заболеваний.
Основные положения, выносимые на защиту.
Пассирование чувствительной к циклофосфану лимфосаркомы LS в условиях постепенного повышения дозы препарата привело к появлению высокорезистентого субштамма - лимфосаркомы RLS.
Клетки резистентной к действию ряда химиопрепаратов лимфосаркомы RLS характеризуются повышенными (по сравнению с LS) уровнями экспрессии генов Ьс1-2 и mdrlb и пониженными - р53 и mdrla.
Одним из механизмов появления устойчивости клеток RLS к циклофосфану является снижение их чувствительности к факторам, вызывающим апоптоз (как спонтанный, так и индуцированный).
Молекулярно-генетические изменения имеют морфологические корреляты в организации клеток, составляющих резистентную к циклофосфану опухоль.
Апробация работы. Основные положения работы были представлены на XL, XLI и XLIV международных студенческих конференциях «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2002, 2003, 2006 гг.), отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, 2002 и 2005 гг.), V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005 г.), Всероссийской конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2005 г.), IX Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2005 г.), международной конференции «Cell Signaling World 2006. Signal Transduction Pathways as therapeutic targets» (Люксембург, 2006 г.), Международной конференции «Basic Science for Biotechnology and Medicine» (Новосибирск, 2006 г.), Международном междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, 2006 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, из них 5 в ведущих рецензируемых научных журналах согласно Перечню ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 192 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, описание использованных в работе материалов и методов, результаты проведенных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы, включающий 362 работы (24 отечественных и 338 зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 42 рисунками и 13 таблицами.
