Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1 Место цитохрома c в регуляции процессов жизнедеятельности клетки 8
1.2 Цитохром с, вариабельность его структуры и связанные с ним генетические модели 15
1.3 Значение процессов, в которых участвует цитохром с, для различных клеток иммунной системы 25
1.4 Избирательное редактирование генома в определенных типах клеток in vivo и генетические модели митохондриальных заболеваний 32
2. Материалы и методы 38
2.1 Материалы 38
2.2 Методы клеточной биологии 40
2.3 Методы молекулярной биологии 43
2.4 Статистическая обработка данных 46
3. Результаты и обсуждение 47
3.1 Описание модели с различными вариантами кондиционного нокдауна гена Cycs 47
3.2 Влияние снижения количества цитохрома c на жизнеспособность мышей 51
3.3 Определение механизма снижения количества цитохрома с и оценка этого количества в клетках иммунной системы 54
3.4 Анализ жизнеспособности цитохромдефицитных лимфомиелоидных клеток 60
3.5 Влияние снижения количества цитохрома c на клеточный метаболизм и апоптоз 63
3.6 Проверка иммунных функций цитохромдефицитных макрофагов 68
3.7 Обсуждение дыхательной функциональности цитохромдефицитных клеток 71
Заключение 74
Выводы 77
Список литературы 78
- Значение процессов, в которых участвует цитохром с, для различных клеток иммунной системы
- Избирательное редактирование генома в определенных типах клеток in vivo и генетические модели митохондриальных заболеваний
- Методы молекулярной биологии
- Определение механизма снижения количества цитохрома с и оценка этого количества в клетках иммунной системы
Значение процессов, в которых участвует цитохром с, для различных клеток иммунной системы
У почкующихся дрожжей S. cerevisiae также существуют две изоформы цитохрома с, которые отличаются друг от друга уровнем экспрессии (Sherman et al., 1965), и кодируются двумя разными генами, CYC1 и CYC7 (Downie et al., 1977). Примерно 95% общего количества это белка дрожжевой клетки приходится на изоформу 1, и только 5% - на изоформу 2. В то же время известно, что дрожжи с мутациями cyc1, нарушающими работу изоформы 1 цитохрома с, способны поддерживать работу дыхательной цепи посредством оставшегося небольшого количества белка изоформы 2 (Sherman et al., 1974). При этом критерием, позволяющим отличить мутантов по гену CYC1, кодирующему эту мажорную изоформу, от двойных мутантов или мутантов по другим, уникальным генам белков дыхательной цепи, является способность дрожжей расти на среде с глицеролом либо этанолом в качестве единственного метаболического субстрата. Что интересно, повышение экспрессии CYC7 в 20-30 раз в результате делеции регуляторной области CYC7-Н3 приводило к росту чувствительности дрожжевых клеток к ультрафиолетовому излучению и другим индуцирующим клеточную гибель воздействиям, однако это было связано с нарушениями работы сцепленных генов RAD23 и ANP1, но не проапототическим действием самого цитохрома с, которое на тот момент было неизвестно (McKnight et al., 1981). Дрожжевые модели также показали, что отсутствие цитохрома c в митохондриях приводит к нарушению сборки полноразмерного цитохромоксидазного комплекса дыхательной цепи и ускоренной деградации его отдельных субъединиц (Pearce and Sherman, 1995). Интересно, что цитохром c для этого необходим только в качестве лиганда, а не в качестве переносчика электронов, поскольку даже функционально неактивный белок (Schweingruber et al., 1979) восстанавливал нативную сборку и ферментативную активность цитохромоксидазы (Barrientos et al., 2003). Активность других комплексов дыхательной цепи у дрожжей от дефицита цитохрома c не страдает. В целом дрожжевые модели показали, что дыхательная цепь митохондрий может функционировать в широком динамическом диапазоне внутриклеточного количества цитохрома c, который, тем не менее, необходим для приобретения цитохром-оксидазой нативной четвертичной структуры.
Более релевантными для человека моделями по сравнению с описанными ранее являются различные линии трансгенных мышей. Генетический нокаут тестикулярного цитохрома с у мышей приводит к преждевременной атрофии семенников, однако никак не сказывается на качестве спермы и фертильности самцов (Narisawa et al., 2002). В то же время генетический нокаут Cycs приводит к гибели мышиных эмбрионов в период восьмого-десятого дней эмбриогенеза (Li et al., 2000). Именно в это время происходит переключение энергетического метаболизма клеток развивающегося зародыша с гликолиза на окислительное фосфорилирование, которое далее будет обеспечивать примерно 95% потребности организма в АТФ (Morriss and New, 1979). При этом тестикулярная изоформа является полноценным аналогом соматической, поскольку в некоторых клеточных линиях с нарушенной экспрессией соматического цитохрома с происходит компенсаторная экспрессия тестикулярного цитохрома с, который может полностью заместить соматическую изоформу (Vempati et al., 2007). На уровне первичных культур мышиных фибробластов отсутствие в них цитохрома с не является препятствием для культивирования (Vempati et al., 2007), однако требует добавления в среду пирувата и уридина, так же как в случае 0 клеток с повреждением митохондриальной ДНК (King and Atardi, 1989). Однако лишенные цитохрома с клетки имеют дефекты сборки полноразмерных комплексов дыхательной цепи I и IV, снижение доли кардиолипина среди мембранных липидов митохондрии (Vempati et al., 2009), а также нарушения индукции клеточного ответа на гипоксию из-за неспособности к накоплению стабилизированных прогипоксических факторов транскрипции HIF-1 и HIF-2 (Mansfield et al., 2005). При этом нативный комплекс III присутствует в бесцитохромных клетках, хотя и в меньшем количестве по сравнению с нормальными клетками (Vempati et al., 2009). Нарушение нативной четвертичной структуры не только цитохром-оксидазы, но и NADH-оксидазы позволяет считать, что цитохром с у мыши необходим для сборки нескольких комплексов дыхательной цепи из отдельных субъединиц. Также можно предположить, что этот белок может участвовать в образовании суперкомплексов дыхательной цепи, в том числе респирасомы, что более подробно рассмотрено в следующем разделе.
Рассматривая значимость отдельных аминокислот в составе цитохрома c, необходимо отметить, что этот белок довольно консервативен с эволюционной точки зрения, что позволило использовать его для построения одной из первых молекулярно-филогенетических схем более 50 лет назад (Margoliash, 1963). Тем не менее, у человека существует несколько распространенных в отдельных популяциях однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), приводящих к аминокислотным заменам. Их перечень, составленный на основе базы данных GeneCards, приведен в таблице 1 ниже.
Избирательное редактирование генома в определенных типах клеток in vivo и генетические модели митохондриальных заболеваний
Для изучения последствий отдельных мутаций, приводящих к генетическим заболеваниям человека, можно использовать животные модели, полученные методами так называемой «обратной генетики». Суть обратной генетики состоит в том, что в геном модельного животного вносятся изменения, либо воспроизводящие известную у больных людей мутацию, либо нарушающие экспрессию тех генов, регуляция которых у больных нарушена (Landel et al., 1990). Впервые такой подход был применен группой Марио Капеччи в отношении протоонкогена int-2 мыши, для которого была получена линия эмбриональных стволовых клеток с делецией этого гена, затем эти клетки были пересажены в бластоцисту дикого типа, из которой развилась химерная мышь, в организме которой присутствовали клетки двух генотипов (Mansour et al., 1988). Если потомки трансформированных стволовых клеток становились клетками зародышевой линии, то в следующем поколении рождались мыши, имеющий нарушенный ген-мишень во всех клетках организма. Скрестив двух гетерозиготных мышей, можно получить гомозиготную мышь, у которой нарушены обе аллельные копии гена-мишени (Hogan, Lyons, 1988), так называемый «генетический нокаут» (Hinrichs et al., 1991). В 2007 году Марио Капеччи был удостоен Нобелевской премии за разработку этой технологии.
Однако использование технологии генетического нокаута не всегда позволяет сделать заключение о функциях гена и последствиях их нарушения. Для значительного числа генов нарушение их работы на уровне всего организма несовместимо с нормальным онтогенезом и приводит к гибели эмбрионов. Проблема летальности фенотипа определенных мутаций, получаемых с помощью подхода обратной генетики, может быть решена двумя способами: либо посредством создания соматических химер на основе стволовых клеток, либо при помощи избирательного редактирования генома только в определенном типе клеток. Наиболее хорошо эта область разработана для мышей, другие модельные объекты пока не могут похвастаться таким обширным арсеналом молекулярно-генетических методов, поэтому в дальнейшем речь будет идти именно о методах работы с мышами и мышиных моделях. Для лимфоцитов в качестве реципиентов обычно используют иммунодефицитных Rag2-нокаутных мышей, у которых не развиваются В- и Т-клетки, а в качестве доноров – эмбриональные стволовые клетки из зародышей с предлетальной стадии (Chen et al., 1993a). Такой подход получил название «комплементация в бластоцисте» и впервые был применен лабораторией Фредерика Альта для изучения последствий делеции экспрессирующегося в лимфоцитах онкосупрессора Rb (Chen et al., 1993b). Что интересно, никаких последствий для лимфоцитов нокаут гена Rb не имел. Впрочем, подход с использованием химерных мышей для изучения особенностей фенотипа генетических нарушений в клетках определенного типа не получил широкого распространения, поскольку оказался более трудоемким и менее универсальным по сравнению с предложенным в то же время лабораторией Клауса Раевского методом с использованием высокоспецифических рекомбиназ под тканеспецифическими или индуцибельными промоторами (Gu et al., 1993). Наиболее широко в настоящее время для этих целей используется рекомбиназа Сre, узнающая специальные последовательности длиной 34 п.н., называющиеся LoxP. Эта рекомбиназа была открыта у умеренного бактериофага Р1 (Hoess, et al., 1982), однако может проводить специфическую рекомбинацию двух сайтов узнавания LoxP вне зависимости от того, в каком геноме они находятся (Sauer, Henderson, 1988). Последовательность LoxP представляет собой два инвертированных повтора размером 13 п.н. и специфический спейсер между ними. Последовательность внутри спейсера может варьировать, при этом рекомбиназа Cre сможет осуществить рекомбинацию только между Lox-сайтами с одинаковыми спейсерами, таким образом можно создавать сложные конструкции с большим числом Lox-сайтов, которые рекомбиназа тем не менее будет перестраивать единственно возможным способом (Missirlis et al., 2006). Мыши, несущие ген рекомбиназы Cre, называются Cre-делитерами, в настоящее время описано несколько сотен различных линий Cre-делитеров, обеспечивающих широкое разнообразие выбора клеток-мишеней (Kuhn, Wurst, 2009). Они могут быть использованы для получения гибридных мышей, у которых рекомбиназа будет синтезироваться и удалять ген-мишень только в клетках определенного типа. Принцип использования мышей Cre-делитеров и каноническая последовательность LoxP показаны на Рис. 7. При этом активность рекомбиназы может регулироваться тканеспецифическими промоторами, ограничивающими популяцию клеток, в которых будет синтезироваться рекомбиназа, либо при помощи химерного белка, у которого димеризация рекомбиназы будет зависеть от связывания регуляторной субъединицы с добавляемым извне лигандом (Lewandoski, 2001). Как правило, такой субъединицей служит фрагмент эстрогенового рецептора человека, а селективным лигандом - химический аналог стероидных гормонов тамоксифен и его производные (Metzger et al., 1995). Наиболее распространенной рекомбиназой для такой технологии в настоящее время является фермент CreERT2, обладающий повышенной селективностью к 4-гидрокситамоксифену (Leone et al., 2003).
Методы молекулярной биологии
После neor – кассеты располагается последовательность аллели цитохрома с K72W, у которой лизин в положении 72 заменён на триптофан. Различие между аллелями wt и K72W составляет четыре нуклеотида, обуславливающие вышеназванную аминокислотную замену. У обеих аллелей имеются общие промоторный участок и первый экзон. Данная замена была предложена в наших предыдущих исследованиях с целью потенциальной супрессии внутреннего пути апоптоза (Муфазалов и др., 2009). Экспрессия нокинной аллели для генотипа cfKW невозможна, так как между общим первым экзоном и вторым экзоном нокинной аллели находится достаточно длинная вставка размером 4373 п.н., в которой к тому же содержится рамка считывания аллели wt. Поскольку конструкция cfKW содержит все регуляторные элементы нативного гена Cycs, в норме в локусе cfKW транскрибируется последовательность дикого типа, причем её уровень экспрессии соответствует нормальному уровню экспрессии соматического цитохрома c на уровне как мРНК, так и белка (Рис. 9 А и Б). Тем самым, предложенная модель выгодно отличается от единственной ранее описанной в литературе модели кондиционного нокаута цитохрома c (Vempati et. al., 2007), в которой использовался LoxP-фланкированный трансген Cycs под управлением убиквитарного промотора ROSA-26.
В рамках нашей генетической модели предполагалось, что Cre-опосредованное удаление из цитохромного локуса флоксированной аллели дикого типа (генотип fKW) приведет к прекращению экспрессии цитохрома с, поскольку между первым общим экзоном и вторым экзоном нокинной аллели останется neor – кассета. В этом случае размер первого интрона за счёт neor – кассеты увеличивается с 747 п.н. до 2800 п.н. Аллель K72W не присутствует в пуле мРНК клеток cfKW/cfKW, поскольку на 3`- конце аллели дикого типа находится последовательность, терминирующая транскрипцию, а также сигнал для полиаденилирования. Действительно, анализ методом аллелеспецифической ПЦР в реальном времени на кДНК показал у гомозигот cfKW/cfKW отсутствие транскриптов с заменой K72W и нормальное количество транскриптов дикого типа. В присутствии рекомбиназы Cre аллель Cycs дикого типа может быть удалена путем рекомбинации по LoxP-сайтам, и таким образом возникает новый генотип, обозначаемый fKW. Ранее в диссертационной работе И.А. Муфазалова была показана летальность генотипа fKW/fKW и было высказано предположение о том, что эта летальность связана со значительным снижением количества цитохрома c и нарушением работы гена Cycs, вплоть до полного нокаута. В настоящей работе этот результат был подтвержден, а также было показано, что такое снижение количества белка действительно происходит, однако не до полного исчезновения цитохрома c, а до уровня, приблизительно в десять раз меньшего, чем его нормальное содержание в клетке. Именно последнее обстоятельство послужило основанием для дополнительных исследований с использованием этой генетической модели.
Рисунок 9. Локус cfKW обеспечивает нормальный уровень экспрессии гена Cycs. А) Вестерн-блоттинг лизата костномозговых макрофагов различного генотипа, показано окрашивание антителами к цитохрому с и контрольными к гистону H2B. Сокращение cyt обозначает генотип fKW/fKW cre. Б) Количество мРНК цитохрома с в костномозговых макрофагах, нормированное на количество –актина (принято за 100 единиц) определенной методом РТ-ПЦР. Экспрессия Cycs стабильна и по уровню сопоставима с экспрессией –актина и GAPDH.
Во втором поколении от скрещивания гомозиготных мышей cfKW/cfKW и мышей-делиторов, имеющих трансген cre под тканеспецифическим промотором, можно ожидать мышей, сочетающих генотип cfKW/cfKW и рекомбиназу Cre (Рис. 10). У таких мышей в клетках-мишенях будет происходить переход генотипа cfKW/cfKW в fKW/fKW, что позволяет создать модель значительного дефицита цитохрома c в определенном типе клеток организма. В данной работе подобный подход был применен с использованием трех типов кондиционных (тканеспецифических) делиторов: Cd4-cre (затрагивает Т-клетки), LysM-cre (затрагивает миелоидные клетки, преимущественно макрофаги), Nes-cre (мишенью являются стволовые клетки, экспрессирующие белок нестин) и одного убиквитарного делитора CMV-cre, обеспечивающий удаление Cycs во всех типах клеток организма. Рисунок 10. Схема скрещивания для получения потомства с кондиционным снижением экспрессии цитохрома с. Экспрессия рекомбиназы сre контролируется специфическим промотором и позволяет удалять ген цитохрома с в отдельных типах клеток, таких как макрофаги (на рисунке) или Т-клетки. После удаления аллели дикого типа начинается экспрессия аллели K72W, однако ее уровень незначителен по сравнению с базовым уровнем экспрессии.
При разведении мышей с конструкцией cfKW, несущих рекомбиназы CMV-cre и Nes-cre, наблюдались отклонения от ожидаемого менделевского соотношения потомков. Мыши генотипа cfKW/cfKW CMV-cre с полной делецией аллели Cycs дикого типа погибали в период Е9,5-Е11,5 (Муфазалов, 2011; Шилов и др., 2013). При этом цитохромдефицитные эмбрионы отставали в развитии от нормальных, а затем подвергались атрофии и редукции (Рис. 11А). Статистика для мышей этой линии приведена далее в Таблице 2. Подобное нарушение развития характерно для ранее описанного полного нокаута Cycs (Li et al., 2000), что подтверждает эффективность
Определение механизма снижения количества цитохрома с и оценка этого количества в клетках иммунной системы
После количественного обоснования корректности предложенной модели у мышей с дефицитом цитохрома c в Т-клетках и макрофагах был более подробно исследован их клеточный фенотип. Поскольку генотип fKW/fKW приводит к эмбриональной летальности в тот же период, что и полный генетический нокаут Cycs, естественным казалось предположение о том, что и для отдельных клеток, включая иммуноциты, этот генотип может воспроизводить последствия полной функциональной утраты цитохрома c. Сразу следует сказать, что это ожидание не подтвердилось, более того, снижение количества цитохрома c практически никак не затронуло жизнедеятельность и функции Т-лимфоцитов и макрофагов. Очевидно, что летальность эмбрионов со сниженным количеством цитохрома c во всех клетках организма объясняется дисфункцией других клеток-мишеней, более чувствительных, чем рассмотренные в данной работе клетки иммунной системы.
Так, мыши линий cfKW/cfKW Cd4-cre и cfKW/cfKW LysM-cre имели нормальную клеточность костного мозга, тимуса и селезенки. Количество Т-клеток, а также соотношение популяций СD4+ и CD8+ у цитохромдефицитных мышей не отличалось от таковых параметров у контрольных мышей (Рис. 15А), также как и доля CD11b+ клеток моноцитарно-макрофагального ряда в костном мозге (Рис. 15Б). Рисунок 15. Соотношение популяций клеток-мишений у нормальных и цитохромдефицитных мышей одинаково. А) Соотношение субпопуляций CD4+, CD8+ и CD4+CD8+ клеток в тимусе и селезенке контрольных cfKW/cfKW и цитохромдефицитных мышей cfKW/cfKW Cd4-cre. Б) Доля CD11b+ (Mac-1) клеток в костном мозге контрольных cfKW/cfKW и цитохромдефицитных мышей cfKW/cfKW LysM-cre.
В ходе культивирования клеток костного мозга in vitro и стимуляции их дифференцировки в направлении костномозговых макрофагов было показано, что cyt-клетки не имеют отличий в исходной численности на мышь, уровне пролиферации и скорости дифференцировки от контрольных клеток (Рис. 16 А-В). При этом параллельно дифференцировке и созреванию культуры костномозговых макрофагов, под действием рекомбиназы Cre, происходило удаление аллели Cycs wt, которое прекращалось на девятый день культивирования, оставляя около 5% неперестроенного локуса (Рис. 16Г). В дальнейшем в более старых культурах доля цитохромдефицитных макрофагов не изменялась, что указывает на их одинаковую жизнеспособность с теми макрофагами в культуре, которые не удалили аллель Cycs wt. Причины, по которым снижение количества цитохрома c не имеет влияния на жизнеспособность иммуноцитов, будут рассмотрены в следующем разделе настоящей диссертационной работы. Рисунок 16. Созревание культур цитохромдефицитных костномозговых макрофагов in vitro проходит нормально. А) Количество клеток костного мозга, млн на 2 бедренные кости (1 мышь). Б) Количественный выход зрелых макрофагов на 1 культивируемую клетку костного мозга. В) Созревание костномозговых макрофагов контрольной и cyt мыши с 7 по 10 день с момента выделения костного мозга. Окрашивание на маркер макрофагов Mac-1, проточная цитофлуориметрия. Г) Динамика количества остаточной аллели дикого типа в ходе созревания костномозговых макрофагов. В качестве контроля использованы клетки генотипа cfKW/wt, у которых соотношение аллелей Lys и Trp составляет 2:1, аллелеспецифическая ПЦР в реальном времени.
Для того чтобы сопоставить жизнеспособность cyt клеток с нормальными in vivo, было проанализировано соотношение аллелей K72W и wt у отсортированных популяций Т-клеток CD4+, CD8+ и CD4+CD8+ (для тимуса) мышей генотипа cfKW/cfKW Cd4-cre. Соотношение этих аллелей определяется эффективностью работы рекомбиназы Сre и формируется в тимусе на стадии двойных положительных тимоцитов. Предположение о том, что дефицит цитохрома c может повлиять на прохождение лимфоцитами стадий селекции в тимусе или на их жизнеспособность в периферических органах иммунной системы, позволяло ожидать различного соотношения аллелей для CD4+, CD8+ тимоцитов и CD4+ и CD8+ Т-клеток селезенки. Однако оказалось, что это соотношение остается постоянным для всех проанализированных типов клеток, а следовательно, cyt лимфоциты нормально проходят тимус-зависимую селекцию и обладают такой же жизнеспособностью на периферии, как и клетки, оставшиеся с нормальным содержанием цитохрома c (Рис. 17). Более того, доля лимфоцитов, у которых Cycs wt остается невырезанным, имет тенденцию к снижению на периферии, однако она статистически недостоверна. В целом, эти результаты соответствуют тому факту, что митохондриальные заболевания не приводят к иммунодефицитам и дисфункциям отдельных клеточных компартментов иммунной системы.
