Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
1. Нейроэндокринная регуляция иммунной системы при стрессорных воздействиях , 8
2. Морфофункщюнальные изменения органов иммунной системы при стрессорных воздействиях 22
3. Морфофункциональная характеристика тучных клеток в норме и при стрессорных воздействиях 31
4. Межлинейные различия мышей Baib/c и С57В1/6 в норме и при стрессорных воздействиях 47
Материалы и методы 54
1. Методы оценки поведенческих реакций 54
2. Гистологические 57
3. Морфометрические 57
4. Культуралыше 58
5. Иммуноферментный анализ 58
6. МП-колориметрический метод для определения цитотоксической активности спленоцитов мышей 58
7. Биохимические методы 60
8. Статистические методы 60
Результаты собственных исследований 61
1. Сравнительное исследование термогенеза, содержания кортизола и морфологических изменений внутренних органов у мышей Balb/c и С57В1/6 в норме и при холодовом воздействии 61
2. Оценка поведенческих реакций мышей Balb/c и С57В1/6 в норме и при холодовом воздействии в тесте "открытое поле" и "крестообразный приподнятый лабиринт" 65
3. Показатели уровня перекисного окисления и антиоксидантной защиты в печени мышей Balb/c и С57В1/6 при многократном холодовом воздействии 75
4. Морфофункциональная характеристика популяций тучных клеток у мышей Balb/c и С57В1/6 в норме и при холодовом воздействии 78
5. Морфофункциональная характеристика органов иммунной системы мышей Balb/c и С57В1/6 в норме и при холодовом воздействии 86
6. Сравнительная характеристика продукции цитокинов спленоцитами мышей Balb/c и С57В1/6 в норме и при холодовом воздействии 102
7. Оценка цитотоксической активности спленоцитов мышей Balb/c и С57В1/6 в норме и при холодовом воздействии 110
Обсуждение результатов исследования 114
Выводы 143
Список литературы 145
- Морфофункщюнальные изменения органов иммунной системы при стрессорных воздействиях
- МП-колориметрический метод для определения цитотоксической активности спленоцитов мышей
- Оценка поведенческих реакций мышей Balb/c и С57В1/6 в норме и при холодовом воздействии в тесте "открытое поле" и "крестообразный приподнятый лабиринт"
- Морфофункциональная характеристика органов иммунной системы мышей Balb/c и С57В1/6 в норме и при холодовом воздействии
Введение к работе
Актуальность проблемы. В развитии адаптивных реакций при
стрессорных воздействиях ключевую роль играют интегративные системы: нервная, эндокринная и иммунная (Акмаев И.Г., Гриневич В.В., 2001; Акмаев И.Г., 2002; Sternberg Е.М., 2001). Взаимодействие интегративньгх систем при патологическом стрессе освещено в литературе достаточно полно (Горизонтов П.Д. и соавт., 1983; Авцын АП. и соавт., 1985; Меерсон Ф.З, 1993). В работах, посвященных патологическому стрессу, рассматривается проблема перехода адаптации в дизадаптапию. Влияние физиологических стрессорных нагрузок на состояние нервной, эндокринной и иммунной систем изучено недостаточно. Ю.Г. Суховеем и соавт. (2004) показано, что различные температурные режимы вызывают адаптивные изменения иммунореактивности животных и человека, оказывая влияние на гуморальные и клеточные реакции. Исследование механизмов неспецифического повышения иммунореактивности позволит теоретически обосновать и разработать методы профилактики и лечения стрессорной патологии (Волчегорский ИА и соавт., 1998).
Выраженность и направленность адаптивных реакций определяется, с одной стороны, силой и длительностью стрессорного воздействиия, с другой - гено- и фенотипом (Судаков КВ., 1998; Середенин СБ. и соавт., 2000; Сибиряк СВ. и соавт., 2003). В связи с этим представляет интерес изучение факторов, определяющих индивидуальную устойчивость организма к стрессорным воздействиям. Однако, в литературе результатам исследования вариабельности реакций иммунной системы инбредных животных при стрессорных воздействиях посвящены единичные работы (Селятицкая В.Г., Обухова ЛА, 2001; ЧуринАА и соавт., 2003).
Моделирование стресс-реакции на животных разных линий позволяет оценить вклад генетического фактора в развитие адаптации и выбор адаптационной стратегии (Волчегорский И.М. и соавт., 1998; Чурин АА и соавт., 2003). В литературе имеются данные о межлинейных различиях
РОС НАЦИОНАЛЬНА»,
«ИМИОТЕКА І 3
4SWl
мышей Balb/c и С57В1/6 по генам главного комплекса гистосовместимости, устойчивости к эмоционально-стрессовому воздействию (Галактионов В.Г., 1998; Лапицкая А.С. и соавт., 2002). Характер эмоционально-стрессовой реакции во многом определяется особенностями нейромедиаторных систем головного мозга мышей Balb/c и С57В1/6 (Середенин СБ. и соавт., 1998,
2000). При антигенной стимуляции у мышей Balb/c, имеющих Н-2 гаплотип главного комплекса гистосовместимости, развивается преимущественно гуморальный иммунный ответ. Напротив, мыши С57В1/6, имеющие Н-2 гаплотип, генетически "склонны" к формированию клеточного иммунного ответа (Spellberg В., Edwards J.E., 2001). Данные литературы по внутривидовым различиям реакции иммунной системы мышей Balb/c и С57В1/6 на физиологические стрессорные воздействия отсутствуют.
Цель исследования. Цель настоящего исследования - изучение межлинейньгх морфофункциональных различий адаптивных реакций иммунной системы мышей Balb/c и С57В1/6 при холодовом физиологическом стрессе.
Задачи исследования.
1. Провести сравнительную оценку поведенческих реакций у мышей
Balb/c и С57В1/6 в норме, при однократном и многократном холодовом
воздействии.
2. Определить уровень кортизола в сыворотке крови мышей Balb/c и
С57В1/6 в норме, при однократном и многократном холодовом воздействии.
3. Исследовать уровень перекисного окисления липидов и активность
ферментов антиоксидантной защиты - каталазы и супероксиддисмутазы в
печени мышей Balb/c и С57В1/6 в норме и при холодовом воздействии.
4. Оценить морфофункциональное состояние тучных клеток
соединительной ткани мышей Balb/c и С57В1/6 в норме, при однократном и
многократном холодовом воздействии.
-
Провести морфологическое и морфометрическое исследование тимуса и селезёнки мышей Balb/c и С57В1/6 в норме, при однократном и многократном холодовом воздействии.
-
Оценить функциональное состояние иммунной системы мышей Balb/c и С57В1/6 в норме, при однократном и многократном холодовом воздействии по цитокиновому профилю (интерлейкинам-2, -3, -4, -5, -б, -10, -12,ИФН-у, ФНО-а) и уровню цитотоксической активности клеток селезёнки.
Научная новизна. В работе впервые дана характеристика структурно-функциональных особенностей иммунной системы мышей Balb/c и С57В1/6 в норме и при физиологическом холодовом стрессе. Однократное и многократное холодовое воздействие в режиме 3 мин. -20С приводит у мышей обеих линий к адаптивным изменениям иммунной системы и популяций тучных клеток соединительной ткани, реализующимся на фоне активации симпато-адреналовой системы. Установлено, что в этих условиях у мышей обеих линий развиваются разнонаправленные варианты адаптивной реакции.
Толерантная адаптивная реакция, формирующаяся у мышей Balb/c при многократном холодовом воздействии, характеризуется устойчивым ограничением поведенческой активности, нормализацией сниженных при однократном холодовом воздействии морфофункциональных показателей иммунной системы и состояния тучных клеток.
Формирование резистентной адаптивной реакции у мышей С57В1/6 при физиологическом холодовом стрессе сопровождается повышением функциональной активности тучных клеток соединительной ткани, прогрессирующим снижением объёмной плотности Т-зон селезёнки и уровня продукции основных ростовых и дифференцировочных цитокинов для Т-хелперов 1 и 2 типа.
Научно-практическая значимость. Полученные в работе теоретические данные о межлинейных различиях реакции иммунной системы на физиологическое стрессорное воздействие послужат основой для
разработки индивидуальных критериев при выделении групп риска развития вторичных иммунодефицишых состояний и методов патогенетически обоснованной иммунокоррекции. Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры гистологии и клеточной биологии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова и кафедры клинической иммунологии ФППО Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова.
Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на I Всероссийской конференции по иммунотерапии и иммунореабилитологии (Дагомыс, 2003 г.), Конференциях ГУ НИИ морфологии человека РАМН "Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии" (Москва, 2003, 2004г.), Ш Конгрессе иммунологов (Екатеринбург, 2004г.), межлабораторной конференции ГУ НИИ морфологии человека РАМН (Москва, октябрь 2004г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста, состоит из введения, глав обзора литературы, глав результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, иллюстрирована 17 таблицами и 16 рисунками. Библиография включает 93 отечественных и 116 зарубежных источников. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материал исследования. В работе использованы половозрелые мыши-самцы линий Balb/c и С57В1/6 массой тела 18-20 г. При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздрава СССР №755 от 12.08.1977 г. Мышей опытных групп подвергали в течение 3 мин. холодовому воздействию при -20С однократно и многократно 1 раз в день в течение 10 дней. Ректальная температура у животных после однократного сеанса холодового воздействия снижалась в среднем на 1,5С, после последнего сеанса многократного - на ГС, что по классификации,
предложенной Козыревой Т.В. и Елисеевой Л.С. (2002), соответствует неглубокому охлаждению.
Методы исследования. Физиологические методы. Для изучения
поведенческих реакций проводили индивидуальное тестирование животных опытных и контрольных групп в течение 10 мин в "открытом поле" и "крестообразном приподнятом лабиринте". Тестирование проводилось после однократного и десятого сеанса многократного холодового воздействия. Классификация психо-эмоциональных проявлений у мышей в поведенческих тестах проводилась по В.Н. Костенковой и КА Никольской (2003). Регистрация и первичный анализ данных осуществлялись с помощью программы Labyrinth (Костенкова В.Н., Никольская КА, 2003).
Для оценки морфофункциональных изменений иммунной системы мышей опытных и контрольных групп умерщвляли под эфирным наркозом методом цервикальной дислокации через сутки после однократного и 1-1,5 часа после многократного холодового воздействия.
Гистологические. Тимус и селезёнку фиксировали в растворе Буэна, лёгкие - в жидкости Карнуа, печень и почки - 10% растворе забуференного формалина. Фиксированный материал проводили по спиртам восходящей концентрации, заливали в парафин. Изготовляли гистологические срезы и окрашивали их гематоксилином и эозином.
С целью оценки цитофизиологического состояния тучных клеток соединительной ткани проводили забор фрагментов подкожной клетчатки из передней брюшной стенки и брыжейки, соответственно, "тепловой оболочки и ядра тела" по B.C. Новикову и соавт. (1998). Приготовляли плёночные препараты, фиксировали их в 10% растворе забуференного формалина и окрашивали 0,1% раствором толуидинового синего (рН 2) (Lee T.D. et al., 1985).
Морфометрические. При световой микроскопии (ув. 200) оценивали с помощью сетки Г.Г. Автандилова (1973) объёмную плотность функциональных зон тимуса и селезёнки. В плёночных препаратах
подкожной клетчатки и брыжейки определяли количество тучных клеток в поле зрения при ув. 400. Степень дегрануляции тучных клеток оценивали полуколичественным методом по Д.П. Линднер и соавт. (1980) с последующим вычислением индекса дегрануляции.
Кулыпуральные. Из селезёнки мышей Balb/c и С57В1/6 с помощью гомогенизатора Поттера выделяли спленоциты. Для индукции синтеза и секреции цитокинов суспензию клеток селезёнки в концентрации 5хЮ6/мл культивировали в среде RPMI с 5% фетальной сыворотки и добавлением конканавалинаАв конечной концентрации 5мкг/мл.
Иммуноферментный анализ. В надосадочной жидкости методом ИФА (тест-системы фирмы Bio Source International) определяли концентрацию итерлейкинов (ИЛ) -2, -3, -4, -5, -6, -10, -12, ингерферона-у (ИФ-у) и фактора некроза опухолей-а (ФНО-а). Определение содержания кортизола в сыворотке крови мышей проводили методом ИФА с использованием наборов фирмы MMUNOTECH.
Колориметрический метод для определения цитотоксической
активности спленоцитов мышей включал постановку цитотоксической
реакции и последующую её оценку по интенсивности биотрансформации
МТТ-тетразолия (3-[4,5-диметилтищол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолиум
бромида, Sigma) в системе "эффектор-мишень" (Шпакова А П., Павлова К. С, 2000). В качестве клеток-эффекторов использовали спленоциты мышей, в качестве мишеней - клетки мышиной лимфомы линии YAC-1. Инкубацию клеток-мишеней и клеток-эффекторов проводили в 24-луночных планшетах в соотношении 1:10, 1:20 и 1:40 в течение 4 час. в С02-инкубаторе. После инкубации в каждую лунку добавляли по 20 мкл раствора МТТ-тетразолия в концентрации 5 мг/мл и инкубировали в течение 3 час. Продукт биотрансформации МТТ-тетразолия растворяли в 150 мкл диметил-сульфоксица. Оптическую плотность содержимого лунок определяли с помощью спектрофотометра "Униплан" (ПИКОН) при длине волны 540 нм. Цитотоксичность выражали в виде цитотоксического индекса.
Биохимические методы. Проводили биохимическое исследование гомогенатов печени. Показатели перекисного окисления липидов определяли по содержанию продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, по методу В.Б. Гаврилова и соавт. (1987) на спектрофлюориметре "RF-500" (Shimadzu). Активность супероксиддисмугазы определяли по методу П. Г. Сторожук (1998) и каталазы - по МА Королюк и соавт. (1998).
Статистические методы. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием вариационной статистики. Достоверность различий между показателями определяли по F-кригерию Фишера и t-критерию Стьюдента.
Морфофункщюнальные изменения органов иммунной системы при стрессорных воздействиях
В современной научной литературе признано, что хронические стрессорные воздействия являются причиной развития приобретённых иммунодефицитных состояний, обусловленных морфофункциональными изменениями иммунной системы (Караулов А.В., 1999; Акмаев И.Г., Гриневич В.В., 2001; Sternberg Е.М., 2001). Поэтому исследование морфологической структуры органов иммунной системы при стрессорных воздействиях является актуальным. Однако, работы, посвященные этой проблеме, немногочисленны.
Морфологические изменения органов иммунной системы при стрессорных воздействиях на организм были впервые описаны в работах Г. Селье (I960, 1972). Одним из характерных признаков стресс-синдрома была названа атрофия тимико-лимфатического аппарата, обусловленная, по мнению автора, распадом лимфоидных клеток и снижением их пролиферативной активности. В последующие годы концепция Г. Селье об участии иммунной системы в развитии общего адаптационного синдрома была подтверждена в фундаментальных работах П.Д. Горизонтова и соавт. (1983), А.П, Авцына и соавт. (1985). Установлено, что при действии на организм различных физических факторов лимфоидная ткань отвечает стереотипной реакцией (Сапин М.Р., Никитюк Д.Б., 2000). В наиболее ранние сроки после начала стрессорного воздействия наблюдается лимфоцитолиз, гибель нейтрофилов, эозинофшюв, плазматических клеток, позднее -нарастание количества молодых форм лимфоцитов. Среди механизмов опустошения лимфоидных органов при остром стрессорном воздействии основное значение имеет усиленная миграция клеток (Dhabhar F.S., 1998). Гибель и снижение пролиферативной активности клеток имеют меньшее значение.
В ряде работ установлено, что выраженность адаптационных изменений органов иммунной системы зависит от силы и продолжительности стрессорного воздействия. При моделировании острого эмоционального стресса состояние тимуса крыс характеризуется гибелью клеток в корковом слое и усилением фагоцитоза ядерного детрита макрофагами (Воротникова Е.В., 1984). Атрофия коркового слоя тимуса при повышенном уровне глюкокортикоидов в крови объясняется гибелью CD4 CD8 -тимоцитов путём апоптоза (Ktnoshita Y., Hato F., 2001). После 24-часового эмоционального стресса, вызванного помещением в клетку агрессивной особи-самки, у самок крыс отмечается нарушение цитоархитектоники тимуса, угнетение пролиферативных процессов. Снижается выход зрелых тимоцитов в кровоток и пролиферативный ответ на Т-клеточный митоген (Engler Н., Ste&nski V,, 2003).
Основными морфологическими изменениями тимуса мышей Balb/c при хроническом эмоциональном стрессе являются уменьшение клеточности в субкапсулярной зоне, увеличение в этой зоне количества незрелых лимфоцитов и бластов (Волкова Л.В., 1994). По мнению автора, указанные процессы являются следствием усиления миграции предшественников из костного мозга, а также уменьшения в органе количества малых лимфоцитов. В условиях длительной гиподинамии и физических нагрузок признаки функционального истощения тимуса лабораторных животных выражены более отчетливо. Степень морфологических изменений возрастала по мере увеличения продолжительности экспериментов. Состояние тимуса характеризовалось разрастанием стромы органа, сужением коркового слоя, локальными разряжениями коркового и мозгового слоя, стиранием границ между ними и появлением в этих слоях скоплений тучных клеток. В мозговом веществе отмечалось увеличение количества и размеров телец Гассаля, что связано с гипертрофией ретикулярного эпителия (Дурнова Г.Н, Капланский А.С., 1983; Волкова Л.В., 1994).
Лимфатические узлы быстро реагируют на стрессорные воздействия. Морфологическое исследование, проведённое Царёвой СВ. (1993), выявило значительную "лабильность" брыжеечных лимфатических узлов крыс Август при моделировании эмоционального стресса. Направленность и выраженность изменений структуры лимфатических узлов связана с продолжительностью действия стресса. В течение первых суток опыта наблюдалось снижение доли коркового слоя на срезах брыжеечных лимфоузлов, значительное увеличение площади мозгового слоя, расширение мозговых синусов и появление тучных клеток и эозинофилов в мякотных тяжах. По мнению автора, выявленные изменения соответствуют стадии тревоги, характерной для общего адаптационного синдрома, и связаны с миграцией лимфоцитов в костный мозг, слизистые оболочки и кожу. На третьи сутки стрессорного воздействия морфологические и цитологические изменения в структуре лимфатических узлов свидетельствуют об активации лимфопоэтических процессов. Наблюдалось увеличение площади коркового вещества, числа и размеров лимфоидных узелков, количества бластов и митотически делящихся клеток. В эти сроки автор наблюдала постепенную нормализацию структурных компонентов брыжеечных лимфатических узлов, что соответствовало наступлению фазы резистентности (Царёва СВ., 1993).
Состояние паховых лимфатических узлов приматов при стресс-реакции, вызванной гипокинезией, исследовано в работе Л.М Ерофеевой и Д.Е. Григоренко (2000). Авторами показано, что при гипокинезии у обезьян наблюдается атрофия функциональных зон паховых лимфатических узлов и усиление деструктивных процессов.
Накоплен фактический материал, в котором определение степени адаптивных изменений органов иммунной системы проводилось не только морфологическими методами, но и с помощью оценки популяционного состава лимфоцитов, их пролиферативной и супрессорной активности, уровня антителообразования, а также ряда биохимических показателей (Фомичева Е.Е., Рыбакина Е.Г., 1998; Грязева Н.И. и соавт., 1999; Fleshner М. et а!., 1992; Fukui Y. et а!., 1997). Н.И. Грязевой и соавт. (1999) изучено влияние хронического социального стресса на показатели иммунного статуса мышей C57BI/6J. В работе выявлена взаимосвязь социального статуса животных и уровня иммунологических показателей. Наиболее значительные сдвиги отмечены у особей-жертв, проявляющиеся в снижении содержания CD4+ клеток и увеличении количества пре-Т-клеток и более низким, по сравнению с особями-доминантами, коэффициентом CD4+/CD8+ в тимусе. Состояние хронического стресса характеризовалось снижением в крови процентного содержания лимфоцитов и повышением - сегментоядерных нейтрофилов, как у особей-доминант, так и жертв.
МП-колориметрический метод для определения цитотоксической активности спленоцитов мышей
Данный метод включает постановку цитотоксической реающи и последующую её оценку по интенсивности биотрансформации МТТ-тетразолия в системе "эффектор-мишень" (Шпакова А. П., Павлова К. С, 2000). В качестве клеток-эффекторов использовали спленоциты мышей, полученные по вышеуказанной методике. В качестве мишеней служили клетки мышиной лимфомы линии YAC-1, культивирование которых проводили в полной культуральной среде. При постановке цитотоксической реакции в каждую лунку 96-луночного планшета помещали по 0,1 мл спленоцитов и по ОД мл клеток YAC-1. Соотношение эффектор/мишень составило 40:1,20:1,10:1. Цитотоксический тест проводили в течение 4ч.в ССъ-инкубаторе. Затем во все лунки добавляли по 20 мкл рабочего раствора МТТ-тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифешиттетразолиум бромида, Sigma) в концентрации 5 мг/мл и продолжали инкубировать в тех же условиях 3 ч. После центрифугирования и удаления супернатанта на дне лунок визуально определялись кристаллы формазана - продукта биотрансформации МТТ-тетразолия. Кристаллы растворяли в 150 мкл ДМСО в течение 30 мин при комнатной температуре. Оптическую плотность содержимого лунок определяли с помощью спектрофотометра "Уюшлан" (ПИКОН) при длине волны 540 нм. Цитотоксичность выражали в виде цитотоксического индекса в процентах: где ОПэш - оптическая плотность раствора МТТ-тетразолия в лунках, содержавших спленоциты и клетки-мишени, ОПэ - только спленоциты, ОПм - только мишени.
Проводили биохимическое исследование гомогенатов печени: определяли показатели перекисного окисления липидов (ПОЛ) и аптиоксидантной защиты (АОЗ). Орган рассекали на мелкие фрагменты и троекратно отмывали в физиологическом растворе. Полученые гомогенагы замораживали и хранили при -70С. После размораживания в них определяли содержание продуктов, реагирующих с тиобарбитурвой кислотой (ТБК+), по методу В.Б. Гаврилова и соавт. (1987) на спектрофлюориметре "RF-500" фирмы "Shimadzu" (Япония) по спектру флуоресценции бутанольного экстракта и выражали в мкмоль/л. Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли по методу П.Г. Огорожук (1998), каталазы (КТ) - по методике М.А. Королюк и соавт. (1998) и выражали в МЕ/г белка. Консультативная помощь при выполнении биохимических исследований была оказана ведущим научным сотрудником клинико-биохимической лаборатории экстренных методов исследования при НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифософского к.м.н. Б.В. Давыдовым. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием вариационной статистики: вычисляли средние арифметические величины, ошибку средней арифметической, среднеквадратическое отклонение. Достоверность различий между показателями определяли по t-критерию Стьюдента и F-критерню Фишера.
Сравнительное исследование термогенеза и морфологических изменений внутренних органов у мышей ВаШс и С57В1/6 в норме и при холодовом воздействии. В ряде работ показано, что направленность адаптивной реакции зависит от силы и продолжительности стрессорного воздействия. В частности, при использовании холодового воздействия формирование стресс-реакции зависит от глубины и скорости охлаждения (Козырева Т.В., Елисеева Л.С., 2002). Для того чтобы качественно охарактеризовать выбранную нами модель стрессорного воздействия, проводилась регистрация температурных параметров у мышей контрольных и опытных групп с помощью электронного термометра фирмы OMRON. В норме у мышей температура тела колеблется в пределах 37-39С (Западнюк И.П. и соавт., 1983). По нашим данным у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 контрольных групп ректальная температура составляла 37Д±0,4С и 37,4 0,3 0, соответственно. Сразу после однократного холодового воздействия ректальная температура у мышей Balb/c достоверно снижалась на 1,8±0,2С, у С57В1/6 - на 2,1±0,3С (Р 0,001). После последнего сеанса многократного холодового воздействия ректальная температуря у мышей сравниваемых линий оставалась, по сравнению с контролем, достоверно сниженной: у Balb/c на 1,4±0,4С, у С57В1/6 - на 1,2±0,5оС (Р 0,01). По данным изучения термогенеза выбранный режим стрессорного воздействия соответствует неглубокому охлаждению (Козырева Т.В., Елисеева Л. С, 2002). Одним из признаков дистресс-реакции является развитие воспалительных процессов (Селье Г., 1960). При морфологическом исследовании воспалительные изменения в лёгких, печени и почках у мышей обеих линий при холодовом воздействии отсутствовали, что свидетельствуют о формировании физиологического стресса. Сравнительное исследование содержания кортизола в сыворотке крови мышей Balb/c и С57В1/6 в норме и при холодовом воздействии. Ведущая роль в адаптации организма к стрессорыому воздействию принадлежит гормонам и медиаторам симпатической и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой систем. Одними из наиболее важных регуляторов, участвующих в реализации общего адаптационного синдрома, являются глюкокортикоидные гормоны надпочечников (Меерсон Ф.З., 1993). При стрессориых воздействиях на организм усиливается секреция кортикотропин-рилизинг фактора гипоталамусом и АКТГ гипофизом, после чего отмечается быстрое нарастание секреции глюкокортикоидов. В фазу срочной адаптации глюкокортикоиды участвуют в переключении пластических процессов на энергетические (стимулируют синтез ферментов глюконеогенеза и липолиза), индуцируют лизис тимико-лимфоидной ткани, тормозят активность иммунной системы, изменяют рециркуляцию и перераспределение лимфоцитов между органами и тканями, участвуют в повьппении антикоагулянтного потенциала крови. Анализ литературы даёт основания предполагать что, глюкокортикоиды предотвращают чрезмерную активацию защитных механизмов при остром стрессорном воздействии, реализуют срочные адаптивные изменения и способствуют формированию новых структурно-функциональных отношений в организме для перехода срочной адаптации в долговременную (Селятицкая В.Г., Обухова JLA., 2001).
Оценка поведенческих реакций мышей Balb/c и С57В1/6 в норме и при холодовом воздействии в тесте "открытое поле" и "крестообразный приподнятый лабиринт"
Способность к адаптации и переносимости экстремальных воздействий является важнейшей характеристикой всех живых существ. На современном этапе не вызывает сомнений, что различия в индивидуальных реакциях на стресс определяются комплексом наследственных и средовых факторов (Судаков К.В., 1998). Линейные животные, демонстрирующие различные фенотипы эмоционально-стрессовой реакции, являются классическими моделями для изучения механизмов генетического контроля адаптации и переносимости экстремальных воздействий (Середенин СБ. и соавт,, 2001). В данной работе тесты "открытое поле" и "крестообразный приподнятый лабиринт" применены для регистрации изменений поведенческой активности мышей Balb/c и С57В1/6 при однократном и многократном холодовом воздействии.
Сравнительная характеристика поведенческих реакций мышей Balb/c и C57BI/6 в норме. При наблюдении до и во время эксперимента у мышей Balb/c выявлялись устойчивые социально-иерархические отношения. При содержании в клетке по 10 мышей можно было выделить особь-доминанту, которая проявляла агрессивность по отношению к остальным членам социума. В течение 10 мин наблюдений за животными доминантные особи совершали от 4-х до 10-ти агрессивных актов по отношению к другим членам социума. В отличие от Balb/c, ни в одной группе мышей С57В1/6 не наблюдалось внутривидовой агрессии или каких-либо других признаков иерархического положения животных.
В тесте "открытое поле" в контрольных группах локомоторная активность животных обеих линий была практически сходной (табл.3). У мышей сравниваемых линий показатели отношения пройденных центральных зон к их общему количеству и общей локомоторной активности достоверно не различались (табл.3). В тесте "крестообразный приподнятый лабиринт" в контрольной группе мышей Balb/c время нахождения в открытых рукавах было достоверно выше, по сравнению с мышами С57В1/6 (табл.5). В тесте "открытое поле" психо-эмоциовальные проявления мышей обеих линий были более уплощенными, чем в крестообразном приподнятом лабиринте (табл.4). В тесте "открытое поле" у мышей Balb/c только показатель частоты колебаний был достоверно ниже, по сравнению с С57В1/6. В крестообразном приподнятом лабиринте мыши линии Balb/c демонстрировали большее число стрессовых психо-эмоционалышх проявлений, а мыши С57В1/6 - ориентационных проявлений и пассивного избегания. Показатели стрессовых психо-эмоциональных проявлений -"чесоток" "биение хвостом", "отряхивания" - были у мышей Balb/c достоверно выше (табл.6). У мышей С57В1/6 по сравнению с Balb/c были достоверно более высокими показатели колебаний и застываний, которые характеризуют ориентадионные реакции и пассивное избегание, соответственно.
Сравнительная характеристика поведенческих реакций мышей Balb/c и C57BV6 при однократном и многократном холодовом воздействии. При тестировании в "открытом поле" и "крестообразном приподнятом лабиринте", у животных обеих линий наблюдалось много общего в психоэмоциональных ответах на холодовое воздействие. В тесте "открытое поле" установлено, что, по сравнению с нормой, через 10 мин после однократной холодовой нагрузки у мышей Balb/c снижается вертикальная активность (число стоек), достоверно возрастает число колебаний (табл.4). Через сутки после однократного охлаждения, по сравнению с исходным уровнем, достоверно увеличилось количество остановок. Указанные изменения сохранялись и при многократном холодовом воздействии на 5-е и П-е сутки наблюдения. Можно предположить, что после холодового стресса животные испытывают затруднения при ориентации в пространстве. При многократной холодовой
Условные обозначения: - различия достоверны при сравнении показателей в группах мышей разных линий (Р 0,01), Л - различия достоверны по сравнению с нормой (Р 0,001). нагрузке на фоне общего снижения невротических реакций достоверно возрастает число сидений, что свидетельствует о выборе животными пассивно-оборонительной стратегии (табл.4). Общая локомоторная активность у мышей Balb/c, в отличие от мышей С57В1/6, снижалась уже через сутки после однократного холодового воздействия и продолжала уменьшаться до конца многодневного эксперимента. В тесте "открытое поле" через 10 мин после однократного холодового воздействия у мышей С57В1/6 достоверно повышалась локомоторная активность, а в последующих сеансах эксперимента возвращалась к исходному уровню (табл.4). Через сутки после однократного холодового воздействия у мышей С57В1/6 достоверно, по сравнению с исходным уровнем, повысилось число колебаний, остановок и сидений (табл.4). Эта закономерность сохранилась у мышей С57В1/6 в группе с многократным холодовым воздействием. При однократном охлаждении у мышей С57В1/6, как и у мышей Balb/c, нарастали признаки депрессии, о чём мы судили по возрастанию числа сидений с 1 по 1 і сутки эксперимента. В крестообразном приподнятом лабиринте у мышей Balb/c сразу после однократного холодового воздействия достоверно возросло, по сравнению с нормой, число колебаний (в 5,5 раза). Повышение числа колебаний наблюдалось на протяжении всех сроков эксперимента и сопровождалось при многократном холодовом воздействии достоверным увеличением числа остановок (после 5-го воздействия в 3,6 раза).
Морфофункциональная характеристика органов иммунной системы мышей Balb/c и С57В1/6 в норме и при холодовом воздействии
Функциональная активность органов иммунной системы во многом определяет выраженность адаптивных реакций всего организма в ответ на стрессорное воздействие. Известно, что иммунная система чрезвычайно быстро реагирует на воздействия внешней среды (Cbxousos G.P., 2000). В связи с этим, изучение адаптивных изменений центральных и периферических органов иммунной системы представляет несомненный интерес.
В рамках данной работы проведено морфологическое и морфометрическое исследование тимуса и селезёнки мышей Balb/c и С57В1/6 в норме и после однократного и многократных сеансов холодового воздействия. Морфологическая и морфометрическая характеристика тимуса и селезенки мышей Balb/c в норме и при холодовом воздействии. В контрольной группе мышей Balb/c при гистологическом исследовании тимус имел нормальное строение. Преобладал корковый слой (рис.4а, б). В мозговом слое определялись тельца Гассаля 1-2 фаз развития по классификации В.П. Харченко и соавт. (1998), образованные скоплениями из 4-5-ти эпителиальных клеток (рис.4в). Морфометрическое исследование показало, что наибольшую площадь гистологического среза тимуса занимал корковый слой - 74,4±1,8%, показатель объёмной плотности мозгового слоя составил 25,6±1,8% (табл.10). Через сутки после однократного холодового воздействия качественных и количественных изменений в структуре тимуса мышей Balb/c не выявлено. По результатам морфометрического анализа показатель объёмной плотности коркового слоя составил 81,7±3,4%, мозгового слоя -20,8±3,0% (табл.10). При многократном холодовом воздействии у мышей Balb/c при световой микроскопии выявлены признаки акцидентальнои инволюции тимуса 1-2 стадии. В субкапсулярной зоне отмечены расширения за счёт увеличения в поле зрения количества лимфобластов малодифференцированных предшественников всех популяций тимоцитов (рис.5б). В корковом слое встречались тельца Гассаля 1-2 фаз развития (рис.5в). При морфометрическом исследовании тимуса мышей Balb/c после многократного холодового воздействия не отмечалось достоверных изменений показателей объёмной плотности функциональных зон тимуса (рис.5а, табл.10).
При гистологическом исследовании селезёнки мышей Balb/c в норме преобладала белая пульпа, представленная лимфоидными фолликулами без герминативных центров и со светлыми центрами и хорошо развитыми периартериолярными лимфоидными муфтами (ПАЯМ), образованными 10-12 рядами клеток (рис.ба). По данным морфометрического исследования в норме у мышей Balb/c соотношение белой и красной пульпы составило 1,22±0,07 (табл. 12), показатель объёмной плотности лимфоидных фолликулов и ПАЛМ - 25,6±1,4 и 20,О±0,8%, соответственно (табл.11, рис.7). При гистологическом исследовании селезёнки мышей Balb/c после однократного холодового воздействия, отмечалось опустошение зоны ПАЛМ. Показатель объёмной плотности зоны ПАЛМ был достоверно ниже показателя в контроле (табл.П, рис.7). В этой опытной группе показатели объёмной плотности других функциональных зон (лимфоидных фолликулов, красной пульпы, маргинальной зоны), а также соотношение белой и красной пульпы достоверно не изменились (табл. 11,12, рис.7). При многократном холодовом воздействии в селезёнке мышей Balb/c изменений структурно-функциональных показателей на качественном и количественном уровне выявлено не было (рис.66). В этой группе показатель объёмной плотности зоны ПАЛМ не отличался от показателя в норме (табл.11,12, рис.7). Морфологическая и морфометртеская характеристика тимуса и селезёнки мышей С57В1/6 в норме и при холодовом воздействии. В контрольной группе мышей С57В1/6 при гистологическом исследовании тимус имел нормальное строение и при световой микроскопии не отличался от такового у мышей Balb/с (рис.9а, б, в). По данным морфометрии показатель объёмной плотности коркового слоя составил 73,2 1,5%, мозгового слоя - 26,8±1,5% (табл.10). При гистологическом и морфометрическом исследовании тимуса мышей C57BI/6 через сутки после однократной холодовой нагрузки изменений функциональных зон органа выявлено не было (табл.10). При многократном холодовом воздействии у мышей С57В1/6 выявлены признаки акцидентальной инволюции тимуса 1-2 стадии. При гистологическом исследовании органа отмечалось расширение субкапсулярной зоны, появление в поле зрения большого количества лимфобластов и клеток с фигурами митозов (рис.106). Тельца Гассаля определялись не только в мозговом слое (месте их обычной локализации), но и в корковом (рис.ІОв). Выявлялись тимические тельца 4-5 фаз развития с признаками кальцификации и образованием кистоподобных структур (рисЛОг, д). По данным морфометрии многократная холодовая нагрузка у мышей этой группы не сопровождалась достоверными изменениями в структуре тимуса. Показатель объёмной плотности корковой зоны не отличался от показателя в контроле и составил 72,7±1,4%, мозговой слой занимал 27,3±1,5% (табл.10). В норме в селезёнке мышей С57В1/6 белая и красная пульпа были выражены в одинаковой мере (табл.11, рис Л 1а.). Однако, такой структурно-функциональный компонент белой пульпы, как ПАЛМ, был менее развит, по сравнению с контрольной группой мышей Balb/c. Показатель объёмной плотности зоны ПАЛМ составил 14,1 ±1,8% и был достоверно ниже, чем в норме у Balb/c (22,0±0,8%) (табл.11, рис.7, 8). В селезёнке мышей С57В1/6 при однократном холодовом воздействии по сравнению с нормой различий в соотношении белой и красной пульпы не выявлено (таблЛ 2).
