Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы Морфофункциональная организация тектофациальной системы млекопитающих 14
1.1. Морфофункциональная организация верхнего двухолмия 14
1.2. Морфофункциональная организация ядра лицевого нерва у млекопитающих 36
1.3. Морфофункциональная организация структур ствола мозга, претендующих на роль премоторных образований в тектофациальных влияниях 56
1.3.1. Морфофункциональная организация красного ядра, ядра Кахаля и Даркшевича, мезенцефалического ядра тройничного нерва 56
1.3.2. Морфофункциональная организация моторного ядра тройничного нерва 72
1.3.3. Морфофункциональная организация ядер шва 81 Глава II. Методы исследования 101
1. Оперативные процедуры 101
П.2. Ход исследования 101
II.2.1. Методика импрегнации серебром дегенерирующих нервных волокон 101
П.2.2. Методика с флуоресцентным красителем 104
И.2.3. Микростимуляция 107
П.2.4. Обработка данных 110
П.2.5. Морфоконтроль локализации микроэлектрода 111
Глава III. Результаты 113
III. 1. Структурная организация тектофациальной системы: выявление релейных структур данной системы у белой мыши 113
III. 1.1. Эфферентные связи верхнего двухолмия у белой
мыши, выявленные с помощью метода антерограднои дегенерации волокон с последующей их импрегнации серебром 113
III. 1.2. Афферентные связи мезенцефалического ядра тройничного нерва и ядер шва у белой мыши, выявленные с помощью ретроградного транспорта флуоресцентного красителя (примулина) 119
Ш.2. Функциональная организация ядер шва (данные микростимуляции) 130
Ш.2.1. Двигательные представительства лицевой и
соматической мускулатуры у белой мыши 130
Ш.2.2. Изучение рафафациальных влияний у белой мыши 139
Ш.2.2.1. Гетерогенность влияний различных ядер шва на ядро лицевого нерва у белой мыши 139
Ш.2.2.2. Изучение латентных периодов двигательных ответов мышц у белой мыши 142
Глава IV. Обсуждение результатов Морфофункциональная организация тектофациальной системы у белой мыши 165
IV. 1. Уровни тектофациальной системы у белой мыши 165
IV.2. Роль ядер шва в регуляции активности лицевой
мускулатуры у белой мыши 178
Выводы 189
Список литературы 190
- Морфофункциональная организация верхнего двухолмия
- Морфофункциональная организация ядра лицевого нерва у млекопитающих
- Методика импрегнации серебром дегенерирующих нервных волокон
- Афферентные связи мезенцефалического ядра тройничного нерва и ядер шва у белой мыши, выявленные с помощью ретроградного транспорта флуоресцентного красителя (примулина)
Введение к работе
Известно, что филогенетическое развитие лицевых мышц, а также их эмбриональная закладка отличаются от развития соматической мускулатуры [Гамбарян 1989, Проничев 2000, Ромер 1992, Шеперд 1987]. И как следствие вышесказанного, лицевая мускулатура весьма своеобразна, поэтому и заслуживает пристального внимания исследователей. Именно наличие лицевой мускулатуры связывают с усложнением поведения животных. Так лицевая мускулатура принимает участие в выполнении многих рефлекторных актов, тонко координированных движениях, связанных с ориентацией в пространстве и сложными формами социального поведения [Li 1991,Luppino 1993, Manger 1995, 1997].
В связи с этим, изучение центральных механизмов управления
фациальными мышцами является одним из актуальных направлений в
нейробиологии, поскольку вместе с развитием и усложнением
морфофункциональной организации лицевой мускулатуры
совершенствуются и центральные системы управления лицевыми мышцами, а также формируются новые.
Полученные ранее данные в области нейроморфологии и электрофизиологии позволили выделить две системы управления лицевыми мышцами, сформированные уже у примитивных млекопитающих, например, таких как белые мыши: кортико- и тектофациальной систем по аналогии с пирамидной и экстрапирамидной системами управления соматической мускулатурой [Проничев 1989, 1990, 1994, 2000]. Однако, в связи с отличием в филогенезе лицевых мышц от соматических эволюция кортико- и тектофациальной систем проходила по иной схеме, чем эволюция пирамидной и экстрапирамидной систем [Проничев 2000]. И в данном случае нельзя рассматривать кортико- и тектофациальную системы, как
коллатеральные ответвления пирамидной и экстрапирамидной систем. Это самостоятельные центральные системы контроля движений лицевых мышц.
К настоящему времени относительно подробно исследована кортикальная регуляция активности лицевых мышц у различных животных, в том числе у белой мыши [Проничев 1990, 2000]. Однако, судя по всему, кортикальный уровень регуляции лицевых мышц вряд ли вмешивается в обыденные моменты жизнедеятельности грызунов и проявляется только в случаях особой необходимости: коммуникативная деятельность, мотивационное поведение [Бернштейн 1947, 1990, Проничев 1989, 1990,
1994, 2000]. Поэтому, на данной ступеньке эволюции ведущей является
тектофациальная система, а кортикофациальная - выступает надстройкой над
тектофациальной. В связи с этим, возникает вопрос: а как же устроена текто
фациальная система у белой мыши?
На сегодняшний день проведены морфофизиологические исследования таких стволовых структур головного мозга, как верхнего двухолмия (ВД) и ядра лицевого нерва (ЯЛН), принимающих непосредственное участие в управлении фациальными мышцами [Проничев 1989, 1994, 2000]. Однако известно, что любая моторная система подразделяется на несколько иерархически соподчиненных уровней: высший моторный центр, задающий программу действия; сегментарный уровень, с которого осуществляется непосредственная регуляция сокращений мышц; а также промежуточное звено между высшим центром и сегментарным уровнем - надсегментарный уровень, который обеспечивает регуляцию сегментарных структур и таким образом опосредует протекание комплексных поведенческих реакций [Бернштейн 1947, 1990, Адрианов
1995, Андреева 2000]. Исходя из вышеизложенного, нами высказывается
предположение, что данному принципу подчиняется и тектофациальная
система.
Однако, несмотря на детальное изучение функциональных характеристик высшего звена текто-фациальной системы у белой мыши -верхнего двухолмия, а также сегментарного уровня - ядра лицевого нерва, до сих пор отсутствует полная картина знаний о надсегментарном уровне текто-фациальной системы, и как следствие этого - нет объективной, целостной картины о морфофункциональной организации данной системы.
Ранее полученные результаты электрофизиологических исследований указали на существование надсегментарного уровня тектофациальной системы. Так характер распределения латентных периодов двигательных ответов лицевых мышц при микростимуляции верхнего двухолмия был отличен от характера латентных периодов ядра лицевого нерва (латентные периоды верхней губы и вибрисс для правого холма варьировали от 10 до 26 мс; для левого - от 10 до 18 мс) [Проничев 1989, 1994, 2000]. В то время как латентные периоды двигательных ответов лицевых мышц на микростимуляцию ядра лицевого нерва составили от 3 до 10,5 мс [Проничев 1990, 2000], что говорит о наличии олигосинаптических тектофациальных влияниях [Проничев 1989, 1994, 2000]. Кроме того, при микростимуляции верхнего двухолмия двигательные ответы мышц, в основном, носили контралатеральный характер, а при микростимуляции ядра лицевого нерва -ипсилатеральный [Проничев 1989, 1990, 1994, 2000], что указывает на то, что олигосинаптические тектофациальные влияния осуществляются через ряд промежуточных премоторных структур, где происходит корректировка программы действий. Какие структуры ЦНС входят в это премоторное звено тектофациальной системы и какова их роль в тектофациальных влияниях -вопрос до сих пор был открытым. В связи с этим, в данной работе нами было предпринято комплексное морфофункциональное исследование промежуточных образований тектофациальной системы у белой мыши. Среди промежуточных структур надсегментарного уровня тектофациальной системы у белой мыши особое внимание было направлено на изучение
морфофункциональной организации ядер шва, поскольку известно, что основная функция ядер шва - регуляция смены сна и бодрствования. Однако нами высказывается предположение, что данные образования ЦНС принимают участие в двигательном контроле, в том числе и в регуляции деятельности лицевой мускулатуры. Таким образом, полное отсутствие знаний о промежуточных структурах тектофациальной системы, и соответственно фрагментарная изученность тектофациальных влияний у белой мыши как единого целого, свойственного любой системе, а также осознание, что данные знания могут послужить ключом к лучшему пониманию стратегии функционирования мозга, в том числе стволового уровня управления лицевой мускулатурой позволило нам сформулировать основную цель данной работы:
Изучить морфофункциональную организацию текто-фациальной системы у белой мыши.
В качестве конкретных задач исследования выбраны следующие:
1. С помощью методов антероградной дегенерации нервных волокон с
последующей их импрегнацией серебром и ретроградного транспорта
флуорохрома примулин выявить эфферентные связи верхнего двухолмия с
другими стволовыми образованиями мозга, имеющими прямые входы в ядро
лицевого нерва.
С помощью метода микростимуляции выявить пространственную организацию двигательных представительств лицевых мышц в ядрах шва и роль этих образований в двигательном контроле фациальных мышц.
На основании полученных данных составить общую схему основных путей текто-фациальных влияний у белой мыши и вынести на обсуждение вопрос о существовании текто-фациальной системы.
Научная новизна.
1. Проведенное исследование позволило выявить
морфофункциональную организацию текто-фациальной системы у белой
мыши. В ходе морфологических исследований выявлены премоторные структуры текто-фациальных влияний: красное ядро, ядра Кахаля и Даркшевича, центральная серая субстанция среднего мозга и моста, моторное и мезенцефалическое ядра тройничного нерва, а также ядра шва. Разнообразие нисходящих путей текто-фациальной системы обеспечивает согласованную работу лицевых мышц, что необходимо для целостного поведенческого акта.
2. Впервые выявлены моносинаптические связи верхнего двухолмия с
ядром лицевого нерва у белых мышей.
3. Впервые проведено картирование ядер шва мыши методом
микростимуляции и показана роль этих образований в управлении лицевой
мускулатурой. Полученные данные позволяют рассматривать ядра шва не
только как релейную структуру, но и как модулирующее образование,
участвующее в регуляции активности лицевой мускулатуры.
4. На основании полученных результатов нами была составлена общая
схема основных структур и путей текто-фациальной системы.
Теоретическое и практическое значение.
Проведенное комплексное исследование текто-фациальной системы у белой мыши позволяет выявить роль каждого звена в данной системе. Полученные данные могут быть использованы в лабораториях, где исследуется центральная организация движений, в том числе и исследование лицевой мускулатуры. Результаты работы могут быть учтены при составлении курсов лекций по анатомии и физиологии ЦНС, физиологии движений, эволюционной морфологии и физиологии.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Контроль за активностью лицевых мышц на уровне ствола мозга осуществляется текто-фациальной системой. Влияние верхнего двухолмия на ядро лицевого нерва у белой мыши носит как моно-, так и олигосинаптический характер.
2. Премоторными структурами текто-фациальной системы у белой
мыши выступают красное ядро, ядра Кахаля и Даркшевича,
мезенцефалическое и моторное ядра тройничного нерва, центральная серая
субстанция среднего мозга и моста, ядра шва, что обеспечивает
согласованность движений лицевых мышц.
3. Основным премоторным звеном в текто-фациальной системе
являются ядра шва, которые выполняют не только релейную, но и
модулирующую функцию.
Апробация работы.
Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на
конференции молодых ученых России с международным участием
«Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», посвященной
240-летию ММА им. И.М.Сеченова, М., 1998 г.; XVII съезде Всероссийского
Физиологического общества им. И.П. Павлова, Ростов-на-Дону, 1998 г.; 4-ой
Российской университетско-академической научно-практической
конференции, г. Ижевск, 1999 г.; IV съезде Российских морфологов с
международным участием, г. Ижевск, 1999 г.; Всероссийской научной
конференции с международным участием, посвященной 150-летию со дня
рождения академика И.П. Павлова, Санкт-Петербург, 1999 г.; 5-ой
Российской университетско-академической научно-практической
конференции, г. Ижевск, 2001 г.; конференции молодых ученых «Актуальные медико-биологические проблемы в современных условиях», г. Ижевск, 2001 г.; XVIII съезде физиологического общества им. И.П. Павлова, г. Казань, 2001 г.; XII Международном совещании и V школы по эволюционной физиологии, посвященные памяти академика Л.А. Орбели и 45-летию Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова, Санкт-Петербург, 2001 г.; конференции молодых ученых «Актуальные медико-биологические проблемы в современных условиях», г. Ижевск, 2002 г.; XIX съезде Всероссийского физиологического общества им. И.П. Павлова,
Екатеринбург, 2004 г.; XIII Международном совещании и VI школе по
эволюционной физиологии, посвященных памяти академика Л.А. Орбели и
50-летию Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.
Сеченова РАН, Санкт-Петербург, 2006 г.
По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы.
Работа изложена на 227 страницах, включает 42 рисунка, 2 таблицы. Список
литературы состоит из 308 работ отечественных и зарубежных авторов.
Морфофункциональная организация верхнего двухолмия
Верхнее двухолмие (ВД) - филогенетически древний нейронный комплекс среднего мозга млекопитающих. Хотя он считается прекрасно развитым зрительным центром, функциональная его роль до сих пор полностью не ясна. В связи с этим изучение данного образования вызывает несомненный интерес у нейробиологов.
Благодаря использованию современных морфологических и физиологических методов в последнее время удалось получить новые сведения о ВД, что привело к пересмотру некоторых представлений о его функциях и роли. Так представление о редукции тектума в филогенетическом ряду позвоночных по мере кортиколизации мозга сменилось представлением о ВД, как своеобразной релейной структуре на пути в кору больших полушарий, на уровне которого происходит переключение зрительной информации [Масс, Супин 1985; Шумихина 1981; Шульговский 1997, Курепина 1981, Хьюбел 1990].
Но помимо этого ВД причастно к формированию двигательных команд. Так электростимуляция различных тектальных зон сопровождается простыми и сложными двигательными реакциями у животных [Проничев 1989, 1994, 2000; Vidal 1988; Miyashita 1995]. ВД - это центр контроля за ориентацией в пространстве. Его нейроны опосредуют динамические характеристики саккад, предсказывают зрительный результат предстоящих саккадических движений глаз, причем контроль за горизонтальными движениями обеспечивается текто-ретикуло-спинальным путем, а за вертикальными - через ВД - поле Фореля -спинной мозг [Sparks 1999, 2000; Moschovakis 1996; Wurtz 1994; Waitzman 1991; Walker Mark 1995; Binns 1999, Tadashi Isa 2002]. Одностороннее обширное удаление ВД у животного сопровождается значительным нарушением способности ориентировать голову и глаза к зрительным, слуховым и тактильным стимулам [Шумихина 1981]. Разрушение ВД с одной стороны сразу же вызывает ипсилатеральные постуральные нарушения в поведении животных, исчезающие через 2-7 дней, и сохраняющееся невнимание на протяжении всего времени к сенсорным контралатеральным стимулам [Krauthamer 1992]. Кроме того, после разрушения ВД возникает дефицит сенсорного управления [Fendt 1994]. ВД параллельно с сенсомоторной трансформацией играет роль в перемещении пристального взгляда и в тактильно-зависимом поведении без вовлечения зрения [Wiener 1987]. При стимуляции глубоких слоев ВД у таких животных как кошки, крысы, мыши и золотистого хомячка, наблюдаются двигательные ответы головы, глаз, волосков на ушной раковине, вибрисс, а также движения передних, задних конечностей и хвоста, что указывает на роль ВД в управлении лицевой и соматической мускулатурой [Проничев 1989, 1994, 2000; Vidal 1988; Miyashita 1994, 1995].
Однако в настоящее время до сих пор уделяется незначительное внимание изучению роли ВД в формировании двигательных команд, в частности, роли ВД в регуляции активности лицевых мышц.
В связи с этим, рассмотрим некоторые морфологические и физиологические аспекты организации ВД млекопитающих, известные на сегодняшний день.
Морфологически ВД представляет собой сложную слоистую структуру, разделенную на нейронные комплексы: поверхностный (ПНК), образованный тремя верхними слоями ВД, и глубокий (ГНК), объединяющий остальные четыре слоя тектума [Масс, Супин 1985; Шумихина 1981; Оленев 1995; Шульговский 1997; Курепина 1981; Андреева 2000].
До сих пор, в основном, максимум внимания обращено на изучение ГШК ВД, который является областью преимущественной локализации афферентных и эфферентных связей зрительной системы (сетчатка (retina), зрительная кора 17, 18, 18а (cortex opticus), подкорковые образования: парабигеминальное ядро (Nuc. parabigeminalis), ядро зрительного тракта (Nuc. tractus opticus), заднее претектальное ядро (Nuc. dorsalis pretectalis), ядро задней комиссуры претектальной области (Nuc. commissural dorsalis pretectalis area), вентральное ядро наружного коленчатого тела (Nuc. ventralis corpus geniculatum laterale)) [Масс, Супин 1985; Оленев 1995; Шульговский 1997; Шумихина 1981; Hasting 1992; Hervey 1990; Maioli 1992; Андреева 2000].
Однако для нас наибольший интерес представляют глубокие слои ВД, так как именно эти слои получают информацию от различных структур головного мозга, не связанных со зрительной функцией, и дают начало эфферентным связям, участвующим в управлении движениями.
Исследования НК ВД млекопитающих по методике Гольджи выявили отличия нейронов ПНК и ГНК. Так для ГШК характерны короткоаксонные нейроны (горизонтальные, вертикальные, звездчатые), располагающиеся группами. Нейроны же ГНК разделили на три категории: 1/ крупные (35-60 мкм) мультиполярные клетки, имеющие много соматических и дендритических ветвлений и находящиеся только в латеральной 2/3 части ВД; 2/ средние (20-30 мкм) нейроны, в состав которых входят мультиполярные и вертикальные клетки, занимающие 2/3 медиальной части ВД; 3/ мелкие (8-15 мкм) мультиполярные и вертикальные клетки, которые встречаются во всех глубоких слоях ВД, а также горизонтальные нейроны, расположенные только в средних слоях ВД [Масс, Супин 1985; Шумихина 1981].
Морфофункциональная организация ядра лицевого нерва у млекопитающих
Как известно, ядро лицевого нерва (ЯЛН) является моторным центром управления мимической (лицевой) мускулатурой, в связи с чем, изучение данной структуры остается одним из актуальных направлений в нейробиологии и по сей день.
Несомненный интерес представляет детальное ознакомление с общей характеристикой ЯЛН у представителей различных таксономических групп млекопитающих.
В основе организации ЯЛН лежит миотопический принцип. В работах Фанарджяна В.В. и его коллег приводится обобщенная схема миотопических представительств различных мышечных групп в ЯЛН у разных видов млекопитающих (рис.1) [Фанарджян 1992].
Приведенные на рис.1 данные получены при использовании разных методических приемов исследования, что_не позволяет дать более полного сравнительного анализа. Однако имеются все основания предполагать о наличии единого плана структурно-функциональной организации ЯЛН у различных групп млекопитающих, несмотря на существование видовых особенностей.
Рассмотрим ряд работ, посвященных изучению топографии лицевых мышц в ЯЛН у разных видов млекопитающих.
С помощью инъекций пероксидазы хрена (ПХ) изучали миотопическую организацию ЯЛН у обезьян. Данные показали, что латеральная часть ЯЛН иннервирует нижнюю часть лица, дорсальная зона ядра - верхнюю часть лица, а медиальная область ЯЛН иннервирует платизму и заднеушную мускулатуру [Jenny 1987].
На поперечных срезах даны очертания клеточных групп ядра лицевого нерва, иннервирующих различные мышцы лица (в скобках). А-кролик: 1-медиальная (ушная задняя, стременная), 2-срединная (щечно-губная нижняя), 3- задняя (височная, скуло-орбитальная), 4-латеральная (щечно-губная верхняя); ретроградная дегенерация (по: Van Gehuchten, 1906). Б-кошка: 1-вентромедиальная (шейная), 2- медиальная (ушная задняя), 3- промежуточная (височная), 4- дорсальная (скуло-орбитальная), 5-латеральная (губная верхняя), вентролатеральная (губная нижняя); ретроградный аксонный транспорт пероксидазы хрена (по: Kume et al., 1978). В-опоссум: медиальная доля: 1-шейная, 2-ушная задняя, 3-ушная ростральная; латеральная доля: 4-краевая нижнечелюстная, 5-скуловая, 6-щечная); ретроградный аксонный транспорт пероксидазы хрена (по: Dom, 1982). Г-крыса: 1-медиальная (ушная передняя и задняя), 2-дорсальная пограничная (лобная, скуловая, ушная передняя), 3-промежуточная (подбородочная, платизма, носогубная), 4-дорсолатеральная (носогубная), 5- латеральная (носогубная); метод Ниссля, ретроградный аксонный транспорт пероксидазы хрена (по: Watson, Sakai, Armstrong, 1982). Д-кошка: 1-вентромедиальная (двубрюшная), 2-дорсомедиальная (ушная задняя, щечно-губная верхняя, шейная), 3- промежуточная (ушная передняя), 4-дорсальная (височная, скуло-орбитальная), 5- латеральная (нижнегубная), 6-вентролатеральная (верхнегубная); ретроградная дегенерация (по: Papez, 1927). Е-собака: 1- вентромедиальная (шейная), 2-медиомедиальная (ушная задняя), 3-дорсомедиальная (стременная, глубокая), 4- промежуточная (височная, скуло-орбитальная), 5- латеральная (щечно-губная верхняя и нижняя); ретроградная дегенерация (по: Vraa-Jensen, 1942). Ж-кошка: 1-вентромедиальная (шейная), 2-дорсомедиальная (ушная задняя), 3- промежуточная (височная, скуло-орбитальная), 4- латеральная (щечно-губная верхняя и нижняя); ретроградная дегенерация (по: Courville, 1966). 3-мышь: 1- вентромедиальная (ушная каудальная, платизма задняя), 2- дорсомедиальная (ушная ростральная, платизма), 3- вентральная промежуточная (подбородочная), 4- дорсальная промежуточная (лобная, круговая глаза, платизма ростральная, носогубная вентральная и каудальная), 5- дорсолатеральная (лобная, круговая глаза, носогубная дорсальная), 6- латеральная (носогубная); ретроградная дегенерация и ретроградный аксонный транспорт пероксидазы хрена (по: Komiyama, Shibata, Suzuki, 1984). И-поссум: 1-медиальная (ушная задняя), 2- дорсальная промежуточная (ушная передняя, височная, скуло-орбитальная), 3- средняя промежуточная (скуло-орбитальная), 4- вентральная промежуточная (подбородочная), 5- латеральная (носогубная); метод Ниссля, ретроградный аксонный транспорт пероксидазы хрена (по: Provis, 1977).
На макаках внутримышечное введение конъюгата токсина В и,ПХ давало дискретную метку в ипсилатеральном ЯЛН. Результаты данного исследования показали, что мотонейроны ЯЛН собраны в подгруппы, которые иннервируют отдельные лицевые мышцы. Кроме того, мотонейроны данного ядра представлены продольными колонками, начинающимися на разных уровнях в ростро-каудальном направлении [Welt Carol 1990].
С помощью антидромной стимуляции и регистрации вне- и внутриклеточных потенциалов на кошках получены данные, свидетельствующие, что в медиальной области ЯЛН представлена заднеушная ветвь лицевого нерва, в дорсальной части интермедиатной области данного ядра - височно-скуло-орбитальная, а в вентральной части промежуточной области и частично в латеральной области ЯЛН - щечно-губная ветвь [Kitai 1972].
В других исследованиях было показано, что нейроны латеральной части ядра иннервируют вибриссы у кошки, а клетки по периферии ЯЛН - мышцы стремечка среднего уха [Оленев 1995].
Миотопическую организацию ЯЛН изучали и на кролике с использованием ретроградного транспорта ПХ, в результате чего данное ядро цитоархитектонически разделили на 5 субъядер, в каждом из которых представлена определенная группа мышц. Так нейроны вентромедиалыюго субъядра представляют шейную ветвь ЯЛН, медиального субъядра - передне- и заднеушные ветви ЯЛН, а мотонейроны дорсального субъядра ЯЛН иннервируют окологлазничную и скулоглазничную области, а также переднеушную часть. Мотонейроны, иннервирующие околоротовую область, в основном, расположены в латеральном и интермедиатном субъядрах ЯЛН [Satoda 1988].
Методика импрегнации серебром дегенерирующих нервных волокон
Для доступа к структурам текто-фациальной системы у животных производили операцию трепанации черепа в области мозжечка и каудальной части затылочной кости. Череп животного жестко фиксировали зубным цементом в ростральной области к кронштейнам стереотаксического аппарата, а туловище подвешивали в эластичном гамачке.
Методика импрегнации серебром дегенерирующих волокон.
Методика импрегнации серебром дегенерирующих волокон применялась нами с целью изучения эфферентных связей глубоких слоев В Д. Для этого 13 белым мышам механическим путем разрушали один из холмов ВД. Область разрушения тектума показана на рис.3. В период постоперационного переживания, длившегося 7-9 дней, происходила антероградная дегенерация волокон, после чего животному вводилась летальная доза тиопентала натрия, и животное подвергалось внутрисердечной перфузии физиологическим раствором (изотоническим раствором хлорида натрия) и 10% нейтральным формалином. Затем, в течение 14 дней мозг фиксировался в 10% нейтральном формалине. Срезы изготавливали на замораживающем микротоме толщиной 30-40 мкм. Дегенерирующие волокна окрашивали по методу Игера [Буреш 1991]. В качестве инкубирующих растворов использовали 2,5% водный раствор уранилнитрата и аммиачное серебро. Готовые препараты изучали под световым микроскопом марки "Jenaval". На светло коричневом фоне дегенерирующие волокна были представлены темно коричневыми деформированными тяжами (рис.4).
С целью более детального изучения структурной организации текто-фациальной системы 26 животным производили в ряд подкорковых образований электрофоретические инъекции флуорохрома, в качестве которого применяли 10% раствор примулина "Serva". Введение флуоресцентного трайсера осуществлялось через микроэлектрод (МЭ) с диаметром кончика 10-20 мкм. Для нахождения ориентиров локализации ядер использовали атлас мозга мыши (рис.5) [Sidman 1977]. Ионофорез осуществлялся 10 минут при частоте тока 4 импульса в секунду, длительности 200 мсек., силе тока 10-30 мкА, на аноде. После окончания инъекции примулина МЭ оставался в ядре в течение 5 минут. Таким образом обеспечивался хороший выход флуорохрома из МЭ и улучшался захват примулина нейронами (рис.6). Через 1-2 суток производили интракардиально перфузию 0,9% физиологическим раствором, замещаемым 4-6% параформальдегидом на фосфатном буфере с добавлением 5% раствора сахарозы, который в свою очередь замещался на 10% раствор сахарозы на фосфатном буфере (рН=7,2), охлажденный до +4с. Мозг извлекался и фиксировался в охлажденном фиксаторе ночь. Срезы изготавливали на замораживающем микротоме толщиной 50-60 мкм и монтировались на предметные стекла. Затем препараты высушивали на холоде, обрабатывали в спиртах (70, 96, 100) по 1 минуте в каждом, просветляли в толуоле 3 минуты и заливали 25% полистеролом. Ретроградно меченые примулином нейроны исследовали под люминесцентным микроскопом "Люмам И-1" при длине возбуждающего света 300-420 нм и использованием возбуждающего светофильтра ФС1-2 и запирающего светофильтра СЗС24-4. В ретроградно меченых флуорохромом клетках на фоне диффузно зеленого свечения цитоплазмы наблюдались золотистые гранулы примулина (рис.7).
На 39 животных с помощью метода МС, осуществляемого на электрофизиологической установке (рис.8), изучали функциональную организацию промежуточных структур (ядер шва) текто-фациальной системы. Для МС использовали стеклянные МЭ, заполненные 1,5 М цитратом натрия, с диаметром кончика 5-Ю мкм и сопротивлением 1,0-1,5 МОм. МЭ вводили в различные области ЯШ. Для нахождения координат данных ядер использовали атлас мозга мыши (рис.9) [Sidman 1977]. МЭ погружали трансдурально с помощью механического манипулятора с шагом 0,1 мм в ростральные, центральные и каудальные области ЯШ. Для МС применяли серии прямоугольных импульсов (7 импульсов в пачке) длительностью 0,4 мсек., частотой 300 импульсов в секунду, интенсивностью до 15 мкА из-за плотной упаковки ядерных нейронов в соответствии с рекомендациями Asanuma с соавторами [Asanuma 1976]. Ток измеряли при каждой подаче стимуляции по падению напряжения на калибровочном сопротивлении (1 кОм). Индифферентный электрод размещался подкожно в области спины животного. Характер и локализацию двигательных ответов (ДО) лицевой и соматической мускулатуры определяли посредством прямого визуального контроля. Для удобства одновременного наблюдения за несколькими движениями, а также за движениями вентральной стороны животного использовали зеркало. Бесконтактную регистрацию ДО лицевых и соматических мышц производили с помощью фотодиода, воспринимающего световой поток от точечного источника, расположенного так, чтобы тень падала на светочувствительную поверхность элемента. Смещение тени, падающей на рабочую поверхность фотодиода, изменяло количество достигающего ее света, что вызывало сдвиг величины электрического потенциала, генерируемого фотодиодом [Ленков 1983].
Афферентные связи мезенцефалического ядра тройничного нерва и ядер шва у белой мыши, выявленные с помощью ретроградного транспорта флуоресцентного красителя (примулина)
Исследования афферентных связей ядер шва и мезенцефалического ядра тройничного нерва осуществлялись с помощью прослеживания ретроградного транспорта примулина, зона инъекции которого не превышала 150-200 мкм (рис.14).
У 13 животных при введении примулина в мезенцефалическое ядро тройничного нерва наблюдалось ретроградное мечение нейронов в контралатеральном мезенцефалическом тройничном ядре (Nuc. tr. mesencephalici п. trigemini), билатерально в нижнем и верхнем двухолмии (Colliculus posterior et anterior) (рис.15). Также маркированные клетки были обнаружены в красном ядре (Nuc. ruber), ядрах Кахаля и Даркшевича (Nuc. Cajal et Darkschewitsch) билатерально (рис.15). Но большая концентрация аккумулировавших примулин нейронов всех вышеназванных структур выявлялась на ипсилатеральной стороне. Меченые примулином нейроны обнаруживались и в более ростральных отделах головного мозга, а именно в моторной и соматосенсорной коре (Motor et somatosensory cortex) ипсилатерально (рис.15). В отдельных случаях светящиеся гранулы примулина найдены в нейронах контралатерального верхнего двухолмия, а также билатерально в нейронах моторного ядра тройничного нерва (Nuc. motorius п. trigemini), сенсорного ядра тройничного нерва (Nuc. sensorius principalis п. trigemini), латерального таламуса (Nuc. lateralis thalami pars posterior), межножкового ядра (Nuc. interpeduncularis) и межтройничного ядра (Nuc. intertrigeminalis) (рис.16).
13 животным примулин вводился в ядра шва (ЯШ). В 6 случаях электрофоретические инъекции примулина были произведены локально в скрытое ядро шва, а в 7 - в большое ядро шва. В месте введения МЭ концентрация примулина максимальна, тогда как его диффузия в соседние участки, в частности в другие ядра шва и близлежащую ретикулярную формацию практически отсутствовала. Как показал анализ проекций стволовых структур к ЯШ, значительное количество билатерально распределенных меченых нейронов обнаружено в мезенцефалическом ядре тройничного нерва (Nuc. tr. mesencephalici п. trigemini), красном ядре (Nuc. ruber) и вестибулярных ядрах (Nuc. vestibularis superior, lateralis et medialis) (рис.17).
Также в большом количестве меченые примулином клетки обнаруживались в центральной серой субстанции моста (Substantia grisea centralis pontis), а также в верхнем и нижнем двухолмии (Colliculus anterior et posterior) билатерально (рис.17), причем в ВД маркированные клетки были разбросаны только в глубоких слоях и занимали большую область в одном из холмов. Немногочисленные нейроны были обнаружены в дорсолатеральной области моторной коры (Motor cortex) (рис.17).
Анализ результатов локального введения примулина выявил, что скрытое и большое ядра шва имеют в большей степени одни и те же афферентные связи. Однако имеются и некоторые отличия. Так при введении примулина в скрытое ядро шва нами обнаружены меченые клетки только в вестибулярном медиальном ядре, в то время как при введении флуорохрома в большое ядро шва маркированные примулином нейроны, в основном, встречались в верхнем вестибулярном ядре, а также в медиальном и латеральном вестибулярных ядрах частично.
Кроме того, инъекции примулина в большое ядро шва позволили проследить ретроградный транспорт флуорохрома и выявить маркированные клетки в моторном тройничном ядре (Nuc. motorius п. trigemini) билатерально, чего не наблюдалось при введении трайсера в скрытое ядро шва. В отдельных случаях, в связи с тем, что метка не была локальной, меченые нейроны обнаруживались и в ряде других структур мозга. Так, если метка затрагивала центральные и каудальные отделы дорсального ядра шва, то меченые примулином клетки встречались во всех других ядрах шва (Nuc. raphe magnus, pallidus et obscurus), а также не только в центральной серой субстанции моста, как во всех случаях, но и в центральной серой субстанции среднего мозга (Substantia grisea centralis mesencephali). Отдельные нейроны найдены в ретикулярной системе (zona inserta).
Если же метка затрагивала бледное ядро шва, а также незначительную часть соседней ретикулярной формации, то меченые нейроны выявлялись в ретикулярном ядре покрышки моста (Nuc. reticularis tegmenti pontis), в ядрах Кахаля и Даркшевича (Nuc. Cajal et Darkschewitsch), в парабигеминальном ядре (Nuc. parabigeminalis), в черной субстанции (Substantia nigra, pars reticulata; Substantia nigra, pars compacta), в дорсальном ядре шва (Nuc. raphe dorsalis).
