Введение к работе
Актуальность проблемы. Хеморецепция - это несомненно наиболее древнее чувство. На заре эволюции именно хеморецепция дала первым живым существам возможность искать пищу и избегать опасности. Впоследствии из этого древнего чувства родились обоняние и вкус. В настоящее время общепризнано, что сигнальная система химической рецепции у большинства животных является ведущей не только для поиска пищи и полового партнера, но и для определения опасности и социальньж сигналов, а также участвует в регуляции индивидуального развития. Таким образом, понимание механизмов, лежащих в основе восприятия и распознавания химических сигналов является принципиально важным.
Для человека, на первый взгляд, хеморецепция не - так важна, особенно хеморецепция дистантная - обоняние. Большинство из нас больше полагается на зрение и слух, и мы часто не сознаем важность обоняния и вкуса до тех пор, пока их не лишимся. Предполагается, что в нашем организме около тысячи генов кодируют обонятельные рецепторы, и это составляет около одного процента от общего числа генов в нашем геноме. Такое поразительное число рецепторов свидетельствует о принципиальной важности хеморецепции.
Различают контактную, или вкусовую хеморецепцию и дистантную, или
обонятельную (ольфакторную). У беспозвоночных специализированные вкусовые
клетки расположены почти везде на поверхности тела, например на щупальцах (у
улиток и у осьминогов) или на ногах (у членистоногих). Чаще всего они расположены
вокруг рта, где пища проверяется на пригодность или токсичность. Обычно вкусовые
рецепторные клетки расположены группами, причем каждая клетка имеет длинный
дистальный отросток, выходящий через пору или ямку на поверхность тела. У круглых
червей (нематод) так устроен орган химической чувствительности— амфида (Ward,
1977). Часто пара подобньж чувствительных органов имеется и на хвостовом конце
тела у червей. Дистальные отростки чувствительных клеток представляют собой
видоизмененные реснички. Различные вещества проникают через поверхностную пору
и стимулируют кончики ресничек. Хеморецепторы насекомых устроены подобным, но
более специализированным образом. Для них характерно заключение рецепторов в
структуру, называемую сенсиллой (Hansen, 1978; Kaissling and Thorson, 1979). Это
образование из - измененной кутикулы, которое имеет форму стерженька, ямки,
пластинки или волоска. К настоящему времени самой изученной структурой являются
волоски. Тела рецепторных клеток лежат у основания іт-ттіді и н" .TT"f"r',TTh"H'*
| гас НАЦИОНАЛЬНАЯ
„ I БИБЛИОТЕКА
отростки входят в волосок и тянутся до его кончика. Эти отростки можно считать дендритами, хотя в действительности это реснички (как у нематод), которые содержат набор микротрубочек (9+2). На кончике находится отверстие поры, покрытое капелькой вязкой жидкости. Молекулы стимулирующего вещества диффундируют в эту жидкость через пору и соприкасаются с дендритами (Alter et al., 1977). Считается, что на дендритах расположены рецепторные белки, которые вызывают изменение проводимости мембраны/Именно в этом месте происходит сенсорное преобразование химического сигнала в электрический импульс.
Интенсивнее всего физиология вкусовых рецепторов изучалась на модели мясной мухи Phormia regina группой Детье (Dethier, 1976) в Массачусетском университете. Так, было установлено, что каждая из четырех клеток во вкусовом волоске мухи избирательно чувствительна к определенному типу молекул. Это вкусовые клетки для воды, для сахара, два вида «солевых» клеток, чувствительных к катионам или к анионам, а также еще один тип клеток, являющихся механорецепторами. Избирательная чувствительность клетки к данному химическому соединению характеризуется тем, что она реагирует на него с самым низким порогом и самой сильной активностью по сравнению с ее реакцией на другие соединения. Обычно клетка обладает также некоторой реактивностью и к другим веществам. Кроме того, между реакциями на два вещества возможно тормозное действие. Оно может осуществлятся или на рецепторных участках мембраны, или между ресничками, или между телами клеток в волоске (Dethier, 1976). Такие свойства проявляются в ответах на чистые стимулы, такие как сахар или соль. При стимуляции естественными пищевыми веществами клетки в одном волоске вступают в более сложные комбинации реактивности. Соответственно, разные пищевые вещества дают разные комбинации ответов. Как пишет Детье: «каждое (естественное) вещество...имеет сложный химический состав, и каждая рецепторная клетка волоска обладает характерным спектром активности, а не одной единственной специфичностью. Если центральная нервная система способна анализировать эти комбинации, то это значит, что они содержат достаточно информации, чтобы характеризовать одно вещество как отличное от другого» (Dethier, 1976).
У низших позвоночных, как и у многих беспозвоночных, вкусовые рецепторы не вегда сосредоточены только во рту. Например, у некоторых придонных рыб от грудных плавников отходят пальцеобразные выросты, направленные вниз и несущие на своих кончиках хемочувствительные рецепторы.
Для высших позвоночных характерно расположение рецепторов на языке, в заднем отделе рта и в глотке. Вкусовые рецепторные клетки объединены во вкусовые почки, которые в свою очередь собраны в сосочки (Murray, 1973). Сосочки бывают нескольких типов и по-разному распределены на поверхности языка. Примечательно, что хеморецепторные клетки живут всего около 10 дней. Таким образом, и во вкусовых почках, и в обонятельньж рецепторах идет непрерывное обновление сенсорньж клеток (Graziadei and Monti-Graziadei, 1978). Как при такой непрерывной замене сенсорньж элементов сохраняется специфичность хемосенсорной единицы, остается неясным.
Когда на рецепторы попадает натуральная пища, то вкусовые ощущения представляют собой сложные смеси вкусовых качеств. При тестировании вкуса чистыми химическими веществами, ощущения могут быть разбиты на четыре качества: сладкое, соленое, кислое и горькое. Наличие этих качеств было впервые установлено в начале прошлого века, и с тех пор это представление господствует в понимании вкусовых механизмов. Соленый вкус создается в самом чистом виде хлористым натрием. Считается, что катионы оказывают на рецепторные мембраны возбуждающее действие, а анионы. - тормозное. Кислый вкус - создается кислотами. Он может объясняться действием иона водорода в случае неорганических кислот, но может также определяться действием аниона органических кислот. Сладкий вкус, как полагают, зависит от стереохимической конфигурации глюкозы и близких к ней органических молекул. Для горького вкуса характерно, что он вызывается ядовитыми (токсичными) веществами, например, хинином. Механизм их действия неизвестен; возможно, он локализован на поверхностной мембране или же внутри клетки (Bartoshuk, 1978; Beidler, 1980). Тот факт, что соответствующие вкусовые ощущения вызываются преимущественно (по не исключительно) с разньж участков языка, казалось бы, говорит о том, что каждый такой участок может быть основой «меченой линии», несущей в мозг информацию о своей специфической модальности. Однако записи от одиночных волокон в барабанной струне, полученные в 1941 г. Пфаффменом (Pfafflnan) показали, что это не так. Одиночное волокно может лучше всего отвечать на один стимул, но оно обычно в той или иной степени реагирует и на другие типы стимуляции. Это говорит о том, что данное волокно синаптически связано во вкусовой почке с несколькими рецепторными клетками разной специфичности. (Pfaffinan et al., 1976). Пфаффман предположил, что в такой системе сенсорное качество определяется не просто активацией известной группы волокон, но и характером импульсации других активных групп. Эта теория вкусовых качеств получила название теории «распределения активности между волокнами» (across-fibcr pattern).
В настоящее время представление о восприятии вкуса объединяет в себе обе теории: и «меченой линии», и «распределения активности между волокнами». Четыре основньж вкусовьж качества по-прежнему служат простейшей схемой для объяснения большинства физиологических и психических данньж. В пределах этой схемы представляется, что и специфические рецепторные клетки, и вкусовые почки, и волокна барабанной струны обладают каждый своим собственным стимулом, но на каждом из этих уровней может существовать в разной степени реактивность к стимулам других типов (Shepherd, 1992).
Что касается дистантной хеморецепции, то источником, запахов, является практически, все. Растения, хищники, добыча, другие особи того же вида - все это испускает запахи, которые животному необходимо распознавать и классифицировать. Разумеется, в процессе эволюции оказалось возможным создать более изощренные слуховые и зрительные системы. Иногда эти новые формы коммуникации превосходят исходные химические системы, но у большинства организмов основная роль по-прежнему принадлежит дистантной хеморецепции (Wilson, 1975).
Рецепторы для дистантньж, стимулирующих молекул называют обонятельными (ольфакторными), а соответствующую сенсорную модальность - обонянием. Можно сказать, что обонятельными рецепторами обладают, все организмы. У водных животных стимулирующие молекулы передаются через воду, а у наземных передающей средой служит воздух. Среди беспозвоночных обоняние достигает наивысшего развития у общественньж, насекомьж. Это проявляется чисто анатомически. На передающей стороне они обладают более чем десятком различных эндокринных желез (Wilson, 1975). Принимаются исходящие сигналы рецепторами, большинство из которьж обычно сосредоточено в антеннах (усиках) — парных ветвистых, придатках на голове насекомого (см. например, Синицына и др., 2003). Общее число рецепторов в обоих усиках колеблется у разньж насекомьж от 40 000 до 200 000. Как и во вкусовьж рецепторах насекомого, обонятельные сенсорные клетки собраны в сенсиллы, или волоски, по строению очень похожие на вкусовые волоски. Однако волосок может содержать, одну или несклько клеток, и каждая клетка обладает несколькими периферическими ресничками (дендритами). Обонятельные волоски отличаются также своими системами поверхностных пор. В некоторьж случаях пор очень много (до 15 000 на волосок). Каждая пора является наружным отверстием углубления в кутикуле волоска. На дне углубления начинаются трубочки, пронизывающие кутикулярную стенку и сообщающиеся с пространством внутри оболочки и дендритами рецепторньж клеток. Считается, что пахучие молекулы
адсорбируются на наружной кутикуле и через нее диффундируют к поре, а оттуда внутрь через систему трубочек к рецепторным дендритам (Kaissling, 1974; Boeckh, 1980). При тестировании разными запахами данный обонятельный рецептор насекомого отвечает на определенное их число, составляющее его спектр реактивности. При анализе реакций на широкий круг обонятельных стимулов выделяют группы рецепторов со сходными спектрами. По мнению Бекха (Boeckh) их можно классифицировать как «специализированные к феромонам» - это клетки с узкой настройкой на молекулу данного феромона; «специализированные па запахи пищи» -это клетки, обладающие сходными спектрами реактивности к разным спиртам, эфирам и другим соединениям, создающим запахи, пищевых продуктов. Считается, что конкретное пищевое вещество опознается при стимуляции рецепторов разных типов в разных сочетаниях. И третий тип рецепторов - «обобщающие». Клетки этого типа реагируют на широкий круг веществ. Из обонятельных стимулирующих молекул лучше всего изучены феромоны, а среди феромонов - половые аттрактанты. Вычислено, что достаточно одной молекулы, чтобы вызвать заметный ответ рецепторной клетки, а 200 молекул достаточно, чтобы вызвать поведенческую реакцию самца (Kaissling and Thorson, 1979). Такая ситуация характерна также для слухового и зрительного восприятия, в то время как вкусовая рецепция требует гораздо больших концентраций стимулятора.
Все животные имеют характерные, периферические обонятельные органы, для улавливания, запахов. Это обычно носовая полость с сенсорным эпителием у позвоночных, и камеры или сенсиллы у беспозвоночных. Молекулы запахов растворяются в слизи (мукусе) и транспортируются специальными белками к расположенным на ресничках обонятельных рецепторных нейронов рецепторам. Роль мукуса и этих белков остается пока совершенно неясной, поскольку обонятельные рецепторные нейроны могут реагировать на запахи и в отсутствие мукуса (Firestein et al., 1990). Общепринято, что один рецепторный нейрон экспрессирует только один рецепторный ген (Lancet, 1986; Shepherd, 1990,1992; Shepherd and Firestein, 1991; Chess et al., 1994). Однако, прямого экспериментального доказательства этому до сих пор не получено.
У позвоночных обоняние осуществляется рецепторами, заложенными глубоко в носовой полости. У низших позвоночных, таких как рыбы или лягушки, носовая полость обычно имеет форму сравнительно простого мешочка, и струя воды или воздуха проходит непосредственно над рецепторным слоем. У млекопитающих, а особенно у животных с тонким обонянием, таких, как опоссум, кролик или собака,
носовые полости имеют сложную форму (Haberly, 1979). У этих животных воздух сначала нагревается и увлажняется, и лишь затем достигает обонятельных рецепторов. Обонятельные рецепторные клетки расположены тонким слоем. Зрелая клетка имеет длинный тонкий, дендрит, который оканчивается небольшим утолщением на поверхности (см. например Williams, 1973). От этого утолщения отходят несколько ресничек, которые могут быть длиной до 200 мкм, а диаметром 0.1-0.2 мкм. Реснички содержат стандартный набор микротрубочек (9 пар+2), то есть такой же, как реснички в других тканях и покрыты слизью, выделяемой опорными клетками и боуменовыми железами.
Пахучие вещества сначала" поглощаются слизью, и лишь затем проникают к ресничкам и концевому утолщению дендрита, где связываются с рецепторными молекулами в мембране. Распознавание молекулы запаха начинается с взаимодействия запаха и рецептора аналогичных взаимодействию антиген - антитело в имунной системе или нейромедиатор - рецептор в нервной системе (Lancet 1986; Shepherd, 1987). Это приводит к деполяризации- рецепторного нейрона и генерации потенциалов действия (обзор литературы см. в Anholt, 1993; Minor, Kaissling, 2003). Электрический импульс по аксону приходит в обонятельные клубочки (гломерулы) - специфические структуры, которые, как считается, являются неотъемлемой структурной и функциональной частью обонятельной системы (Leise, 1990). Клетки обонятельного рецептора очень малы, и только в последнее время стало возможным непосредственное отведение потенциала от тела единичной клетки. Как и вкусовые рецепторные клетки, так и обонятельные рецепторные клетки не являются статичной популяцией нейронов. Они дифференцируются из базальных клеток-предшественников, и этот процесс продолжается в течение всей жизни. Просуществовав около 60 дней, клетки дегенерируют и подвергаются фагоцитозу.
У млекопитающих в дополнение к главной обонятельной системе имеется и дополнительная обонятельная система, которая начинается вомеронасальным органом. Его функции остаются совершенно неизвестными. Ранее считалось, что он детектирует феромоны (обзор литературы см. в Beauchamp et al., 1976). Однако в дальнейшем выяснилось, что нейроны основной обонятельной системы чувствительны к феромонам, а нейроны вомеронасального органа чувствительны к веществам, не относящимся к феромонам (Domes et al., 1996).
Бросающиеся в глаза общие черты в организации обонятельных систем насекомых и позвоночньж были давно замечены биологами. В дальнейшем, когда в орбиту исследований стали вовлекаться другие группы животных, например нематоды,
моллюски и ракообразные, оказалось, что некоторые черты обонятельньж систем присутствуют всегда, вне зависимости от систематического положения и сложности организации животного. Что представляют собой подобные черты, и что за этим скрывается? Что это - основные элементы, без которьж невозможно обоняние, или тому, что они постоянно присутствуют даже у далеких друг от друга типов животных, есть иное объяснение?
В современной физиологии, в основном, господствует так называемый «модельный» подход, при котором эволюционным и сравнительным данным уделяется относительно мало внимания. При этом считается как бы само собой разумеющимся, что наличие сходства в строении, развитии, или физиологии вероятнее всего отражает основные закономерности биологии. Сравнительно-физиологический подход, в свою очередь, рассматривает возможные пути появления этих закономерностей. Изучаемый механизм или структура могли, например, развиться однажды У дальнего предка тех животных, которьж мы сравниваем и быть, таким образом, унаследованным от общего источника (гомология), или они могли развиться у них независимо из разньж (конвергенция) или из одного и того же источника (параллелизм). Наиболее четко этот подход проявляется в анализе механизмов обоняния. В последние годы все большую популярность у сравнительных физиологов приобретает идея, что сходство в организации обонятельньж систем у далеких друг от друга животных является, как раз, результатом конвергенции, а значит, это сходство отражает базовые механизмы, лежащие в основе получения и обработки химической информации (например, Hildebrandt, Shepperd, 1997; Ache, Restrepo, 2000).
Наиболее изученными в сравнительно-физиологическом плане типами животных были представители нематод, насекомьж, моллюсков и позвоночных (см. таблицу 1). И у всех у них обонятельные системы - имеют некие черты разительного сходства, которые, при этом, не встречаются в других сенсорньж системах. Так, обонятельные сенсорные нейроны - это всегда биполярные клетки, дендрит которьж оканчивается в жидкости. Этот дендрит имеет реснички и/или микроворсинки, на которьж, как предполагается, локализованы обонятельные рецепторы. Большинство обонятельньж рецепторов взаимодействуют с G- белками и активируют внутриклеточный сигнальный каскад. На противоположном конце клетки находится, аксон, который проходит непосредственно в мозг и там образует синапсы с различными типами клеток внутри специфических образований, называемых гломерулами или клубочками.
Тип Класс
нематоды сенерненты
членистоногие ракообразные
насекомые
Caenorhabditiselegans
Homarusamericanus
Panulirusargus
Apismellifera
Drosophilamelanogaster
Heliothisvirescens
Manducasexta
Periplanetaamericana
Schistocercaamericana
моллюски гастроподы
Achatinafulica
Helixaspersa
Limaxmarginatus
Limaxmaximus
позвоночные костистые рыбы
Brachydaniorerio
Carassiusauratus;
Ictaluruspunctatus
Oncorhynchusmykiss
амфибии
Ambystomatigrinum
Necturusmaculosus.
Ranaspp.
Xenopuslaevis
млекопитающие
Mesocricetusauratus
Musmusculusdomesticus
Rattusnorvegicus
Caviaporcellus
Susscrofa
Bos taunts
Ovisaries
Homosapiens
Таблица 1. Модельные виды, наиболее часто используемые в изучении обоняния.
У позвоночных обонятельные сенсорные нейроны находятся в псевдоупорядоченном эпителии внутри носовой полости, а их аксоны проходят в обонятельную луковицу (ростральная часть головного мозга), где входят в гломерулы. У насекомых обонятельные нейроны объединены в группы внутри кугикуляризованных сенсилл, которые расположены, по большей части, вдоль антенн. Молекулы запахов достигают обонятельных нейронов через поры в кутикуле; аксоны этих нейронов идут в антенную долю мозга. У лангустов обонятельные нейроны расположены группами внутри специализированных, сенсилл, находящихся на антеннулах, а их аксоны оканчиваются в обонятельной доле дейтоцеребрума. У улиток обонятельные нейроны объединены в субэпителиальные группы, а их дендриты иннервируют обонятельный эпителий на кончиках щупалец. Аксоны же идут в
щупальцевые ганглии. У нематоды Caenorhabditis elegans обонятельные нейроны локализованы в парньж амфидах - специализированньж органах обоняния, осязания и вкуса, расположенньж около ротового отверстия. Любопытно, что из 12 нейронов в каждом амфиде 3 реагируют исключительно на воздушные химические стимулы и, следовательно, являются чисто обонятельными, а еще два реагируют кроме того и на другие стимулы (Baigmann и др., 1993; Mori, Ohshima, 1997).
Аксоны обонятельных рецепторньж нейронов всегда проецируются в обонятельные гломерулы - плотные клубочки нейропиля. У позвоночных они находятся, в обонятельной луковице мозга, у насекомых - в антеннальной доле, у ракообразньж -в обонятельной доле, у моллюсков - в щупальцевом ганглии. Клубочки - это чаще всего сферические структуры, состоящие из претерминальньж аксонов и терминальных окончаний обонятельных рецепторньж нейронов и дистальньж дендритных пучков митральных и перигломерулярньж клеток. Диаметр гломерул 50-200 мкм у млекопитающих и 20-50 мкм у амфибий и рыб (Pinching and Powell, 1971). Число гломерул у разньж видов варьирует: 5000 (собака), 2000 (кролик), 1500 (крыса), 1000 (мышь) (Allison, 1952; Meisami, 1991). Число обонятельных рецепторньж нейронов значительно больше, и в одну гломерулу у кролика, например, сходится около 25000 нейронов. С выходящей стороны у кролика имеется около 50000 митральных и 25000 тафтньж клеток (Allison, 1952).
Различные данные свидетельствуют о том, что гломерулы являются функциональными и анатомическими единицами процессинга обонятельной информации (Leveteau and MacLeod, 1966; Воронков, Гусельникова, 1967,1968; Sharp et al., 1975,1977; Lancet et al., 1981; Stewart et al., 1979; Марголис, 1983; Воронков, 1987, 1988; Потапов, 1987; Минор и Ревищин, 1997). Удалось даже обнаружить корреляцию между конкретным запахом и идентифицированными гломерулами (Teicher et al., 1980; Rodeisen and Blass, 1981; Greer, et al, 1982; Coopersmith and.Leon, 1984; Cinelli and Kauer, _ 1994). Микроинъекции пероксидазы хрена в гломерулы выявили, что иннервирующие их обонятельные рецепторные нейроны мозаично разбросаны в эпителии (Jastreboffet al., 1984; Pedersen et al., 1986; Astic and Saucier, 1986). Обобщая, можно сказать, что каждая гломерула представляет собой центр сложной цепи, которая структурно определяется обонятельными рецепторными нейронами, проецирующимися в нее, и митральными клетками, ее иннервирующими. Функционально она определяется совокупностью обонятельных рецепторов, т.е. спектром запахов, которые возбуждают эти нейроны и, соответственно данную гломерулу (Hildebrand and Shepherd, 1997). Однако, несмотря на то, что число гломерул в абсолютном большинстве обонятельных систем намного
меньше, чем число обонятельньж нейронов и явно меньше, чем число различаемьж животными запахов; господствующим является мнение, что число гломерул соответствует числу обонятельньж рецепторов и что все нейроны, экспрессируюпще один тип рецептора, сходятся в одну гломерулу (Lancet, 1986; Ressler et al., 1994; Vassar etal.,1994).
Гломерулы обонятельной луковицы позвоночных состоят из отростков рецепторных нейронов, интернейронов (перигломерульные клетки) и нескольких типов проекционных нейронов. У беспозвоночных гломерулы часто структурно' и функционально похожи на таковые позвоночных (Hamstram, 1928; Boeckh et al., 1990; Boeckh and Tolbert,. 1993; Hildebrand, 1995). Их число несколько меньше и сильно варьирует: 50-300 (ракообразные), 9-1000 (насекомые) (Blaustein et al., 1988; Rospars, 1988; Boeckh et al., 1990). Обонятельные нейроны варьируют в числе от 2000 до 350000 (Blaustein et al., 1988; Rospais, 1988). Гломерулы иннервируются относительно небольшим числом главньж нейронов (principal neurons, аналог митральных клеток): 250-300 (Boeckh et al, 1984; Hombeig et al, 1988, 1989). Таким образом,.можно предположить более комплексный процессинг сенсорной информации в обонятельной системе беспозвоночных.
Примечательно, что у ряда насекомьж (например Manduca sexta) гломерулы устроены точно таким же образом, как у позвоночных, и состоят из отростков рецепторньж нейронов, интернейронов и проекционных нейронов антеннальной доли (Hildebrand, Shepherd, 1997; Strausfeld, Hildebrand, 1999). Сходство в строении гломерул у позвоночных и насекомьж отмечалось многими авторами, однако необходимо иметь в виду, что практически все имеющиеся данные получены на нескольких объектах - это крыса (R. norvegicus), мышь (М, musculus domesticus), бабочка-бражник (Manduca) и дрозофила (Drosoph На).
Каждая гломерула реагирует на конкретный набор запахов, точнее каждый конкретный запах в конкретной концентрации активирует один и тот же набор гломерул у каждой особи одного и того же вида. Это было показано на крысах, мышах, рыбахданио, пчелах и бражниках (Friedrich, Korsching, 1997; Vickeis et al., 1998; Galizia et al., 1999; Rubin, Katz, 1999; Wachowiak, Cohen, 2001). В дополнение к этому, проекции обонятельньж рецепторньж нейронов в гломерулы постоянны у особей одного и того же вида. И у крыс, и у дрозофил аксоны рецепторньж нейронов, экспрессирующих один и тот же рецептор или набор рецепторов проецируются в одни и те же гломерулы (Ressler et al., 1994; Mombaerts et al., 1996). Таким образом, хотя роль гломерул в кодировании хемосенсорной информации и остается неясной,
очевидно, что она сходна у всех изученных видов. Даже построение гломерул в онтогенезе происходит очень похожим образом и у млекопитающих, и у насекомьж (Graziadei, Monti Graziadei, 1986; Valverde et al., 1992; Ноздрачев и др., 1995; Oland, Tolbert, 1998).
У ракообразньж гломерулы построены сходным образом, хотя имеют несколько важньж отличий. Так, у десятиногих раков аксоны обонятельньж рецепторньк нейронов взаимодействуют с интернейронами и проекционными нейронами внутри уникальных для этой группы конических гломерул (Schmidt et al., 1992; Helluy et al., 1995). У лангустов гломерулы состоят из трех разных частей, которые иннервируются различными интернейронами (Schmidt et al., 1992; Schmidt, Ache,. 1997). Похожее деление гломерул на «отделы» было недавно описано и у млекопитающих (например, Kasowski et al., 1999). Является ли это свойство еще одной общей обязательной чертой обонятельньж гломерул? Ответ на этот вопрос может быть получен только в результате дальнейших сравнительно-физиологических исследований.
В дополнение к морфологическому сходству, многие физиологические характеристики гломерул являются общими для всех изученных видов: например, пресинаптическое торможение сенсорного сигнала при входе в гломерулы описано и у черепах (Terapene Carolina), и у лангустов (P. argus), хотя механизмы этого торможения и отличаются (Wachowiak, Cohen, 1999).
Необходимо отметить, что обонятельные гломерулы встречаются не у всех видов. У наиболее примитивных хордовьж - ланцетника и асцидий они не обнаружены (Bone, 1960). Среди моллюсков гломерулы могут присутствовать, а могут отсутствовать. У головоногих они не обнаружены (Young, 1965, 1971). У гастропод гломерулы присутствуют (Зайцева, 1994), но аксоны многих рецепторньж нейронов проходят, минуя их, непосредственно в тентакулярные или даже церебральные ганглии (Chase, Toloczko, 1993). Функциональное значение этой экстрагломерулярной обонятельной системы остается совершенно неясным. Следует отметить, что и у ряда позвоночных описаны аксоны обонятельньж нейронов, которые минуют обонятельную луковицу (Eisthen, 1997).
Строение гломерул у насекомьж чрезвычайно разнообразно. Они могут совсем отсутствовать, например, у плавунцов Dytiscus marginalis, поденок, стрекоз и некоторьж других (Strausfeld, 1998; Strausfeld, Hildebrand, 1999). У ракообразньж гломерулы также могут отсутствовать.
Обонятельные нейроны амфидов С. elegans не образуют гломерул. Можно полагать, что нейронные сети у нематод принципиально отличаются от таковьж у других типов
животных. Каждый обонятельный нейрон образует синапсы и с интернейронами, и с другими хемосенсорными нейронами, включая иногда парный ему контралатеральный нейрон (White et al., 1986).
Таким образом, гломерулы, хотя и являются важной частью системы дистантной хеморецепции, не являются абсолютно необходимыми. Да и само определение «гломерулы» является проблематичным. Первоначально этот термин употребил Рамон-и-Кахаль (Cajal, 1890) при описании обонятельной луковицы. В дальнейшем его стали употреблять для описания различных клубочков отростков (Pinching, Powell, 1971) или даже любьж синаптических образований, отделенньж глиальной мембраной или иными клеточными структурами (Shepherd, 1974). Однако под такое определение попадает большинство участков центральной, нервной системы, и позвоночных, и беспозвоночных. Очевидно, что обонятельные гломерулы отличаются от остальных похожих структур, как очевидно и то, что они важны для восприятия запахов. Однакр остается неясным, в чем же состоят эти отличия, и что в строении гломерул является необходимым для цроцессинга обонятельной информации.
Обонятельные гломерулы отсутствуют у примитивных насекомых и ракообразньж, поэтому маловероятно, что они появились у общего предка членистоногих, моллюсков и позвоночных. Более того, предполагается, что гломерулы появлялись независимо и у разньж представителей членистоногих (Strausfeld et al., 1995; 1998). Таким образом, гомология обонятельных гломерул в разньж типах вряд ли возможна. В настоящее время практически все исследователи предполагают конвергентное развитие этих структур как функциональную адаптацию для цроцессинга обонятельной информации. Если так, то изучение их строения чрезвычайно важно для понимания принципов кодирования обонятельной информации. Вероятно, гломерулы служат в обонятельной системе для топографического кодирования, по аналогии с тем, как это происходит в зрительной или слуховой системах. Действительно, с тех пор, как Адриан (Adrian, 1950) и Кларк (Clark, 1951, 1957) обнаружили топографическую организацию ответов на запахи в обонятельной луковице, гломерулы стали рассматриваться как функционально значимые зоны синаптического процессинга первичной афферентной информации, которая в них пространственно картируется. Позже было показано, что у позвоночных проекции рецепторньж нейронов топографически организованы (обзор литературы см. в Schoenfeld et al., 1994), а у улиток пространственно организованы ответы на запахи (Никитин, Балабан, 1999; Nikitin, Balaban, 2000).
Механизмы, используемые в этой системе, остаются неизвестными, мы лишь можем предположить, что гломерулы необходимы для усиления обонятельного сигнала
и для осуществления латерального торможения, служащего для точной настройки на конкретный сигнал. Как бы то ни было, очевидно, что эти структуры необходимы для усиления соотношения сигнал-шум при работе самой чувствительной из сенсорных систем.
Таким образом, становится ясным, что для понимания принципов функционирования хеморецепции необходим междисциплинарный подход, который бы базировался на данных анатомии, физиологии и молекулярной биологии. И особенно важным здесь является то, что такие принципы должны быть основаны на изучении как позвоночных, так и беспозвоночных животных, поскольку, как мы видим, в процессе эволюции у разных типов животных выработались схожие механизмы детекции химических стимулов (Hanstram, 1928; Deithier, 1990; Shepperd, 1992; Smith and Getz, 1994; Hildebrand, 1995; Hildebrand and Shepherd, 1997; Eisthen, 2002).
Основные вопросы, связанные с организацией и функционированием обонятельной системы все еще остаются неясными. Так, неизвестно, насколько одинаково строение обонятельной системы у разных животных? Какие структуры всегда необходимы для распознавания запахов, а какие являются «частным случаем» адаптации конкретной группы животных к конкретным условиям обитания? Как кодируется запах на уровне обонятельных нейронов и как на уровне гломерул? Как участвуют в распознавании запахов вышележащие отделы ЦНС? Ответы на эти и другие вопросы о том, как работает обонятельная система, имеют и теоретическое, и чисто практическое значение.
Имеются неопровержимые доказательства того, что обоняние прямо влияет на настроение, память, половое поведение, эмоцик, эндокринную и иммунную системы. Больные анисомией (лишенные обоняния) страдают от депрессий, и их существование очень серьезно осложнено. В настоящее время мало что может им помочь, поскольку, несмотря на успехи в этой области, базовые механизмы, определяющие строение, развитие и функционирование хемосенсорных систем, все еще остаются неясными.
Одним из возможных путей их изучения является сравнительный анализ сенсорных систем позвоночных и беспозвоночных животных. Нервная система беспозвоночных долгое время изучалась в основном зоологами, пьпающимися познать план строения нервной системы как таковой, и построить эволюционное древо. С другой стороны, нервную систему позвоночных изучали, во многом, потому, что человек - это тоже позвоночное и образует с остальными позвоночными небольшую компактную группу. Это было важно, прежде всего, с медицинской точки зрения, поскольку давало возможность изучать как бы «человеческую» нервную систему, но методами, которые
не могли бы быть использованы для изучения действительно нервной системы человека
Базовое сходство между нервной системой позвоночных и беспозвоночных животньж было подмечено очень давно. Сент Иллер был первым (1822), кто предложил перевернуть рака на спину и увидеть единство плана его строения с позвоночными. С тех пор было накоплено огромное, количество данньж, подтверждающих единство организации нервньж систем позвоночных и беспозвоночных. Между тем, физиология все еще изучает эти две группы животньж отдельно. Позвоночных используют, как «модель» человека, например, когда изучают высшие функции мозга и поведение. Беспозвоночных используют, когда нужны их просто устроенные нервные системы с узнаваемыми клетками, или уникальные гигантские нейроны, или их феноменальная толерантность в эксперименте, когда отдельные части центральной или даже периферической нервной системы с эффекторами извлекаются из тела животного и живут часами, а то и днями, в чашке Петри, сохраняя свои физиологические реакции. Это дает возможность изучать изолированные нервно-мышечные или сенсорные системы.
До сих пор не проводилось сравнительного анализа хемосенсорньж. систем позвоночных и беспозвоночных животньж. Физиологи, занимающиеся хеморецепцией, традиционно изучают или тех, или других. Между тем, именно сравнительное изучение таких систем способно дать ответы на вопросы об основньж закономерностях их строения, развития и функционирования.
Одним из наиболее любопытных хемосенсорньж органов беспозвоночных животньж важным, на наш взгляд, для сравнительного анализа является осфрадий моллюсков. Давно известно, что это орган дистантной хеморецепции (Соколов и др., 1980; Соколов, Зайцева, 1982; Croll, 1983; Haszprunar, 1985; Зайцева и др., 1987, 2000; Зайцева, 1991,1992; Emery, 1992). Расположение и схожие черты строения этого органа у разньж, далеких в систематическом отношении видов позволяют с уверенностью утверждать, что этот орган является гомологичным.
Осфрадий состоит из сенсорного эпителия и ганглия, связанного с ЦНС одним или несколькими осфрадиальными > нервами. Наиболее изученным является осфрадий пресноводных пульмонат (Lacase-Duthiers, 1872; Benjamin, 1971; Benjamin and Peat, 1971; Камардин и Цирулис, 1980). Известно, что он содержит первичные рецепторные нейроны, вставочные нейроны, нейросекреторные клетки и клетки, проецирующиеся в ЦНС, и реагирует на содержание углекислого газа, кислорода и органические вещества, растворенные в воде (Камардин, 1976; Kamardin et al., 1999). Ранее было высказано
предположение об интегративной функции осфрадия в обработке хемосенсорной информации (Benjamin, 1971). Поэтому нам представлялось важным провести сравнительное изучение этого органа наряду с обонятельной луковицей позвоночных..
Другой хемосенсорный орган, присущий практически всем трохофорным животным, а также встречающийся и у представителей других групп - аборальный (апикальный) орган. Это клеточное образование, характерное для личиночной стадии, которое формируется с началом плавания и редуцируется после метаморфоза. Апикальный орган имеется у представителей даже таких таксонов, которые считаются, неродственными, и не связан с тем, является ли личинка свободноплавающей планктотрофной или развивается внутри яйцевой капсулы до достижения ювенильной стадии (Schaefer and Ruthensteiner, 2001). У всех личинок, имеющих апикальный орган, он всегда расположен на аборальном полюсе личинки и включает султанчик чувствительных ресничек и лежащий в его основании комплекс сенсорньж нейронов (Беклемишев, 1964; Иванова-Казас, 1977; Nielsen, 2001, и другие), часть из которьж (от одной до четырех сенсорньж и обычно две несенсорньж клетки) является серотонинергическими (Hay-Schmidt А. 1995; Kempf et al., 1997; Marois and Carew, 1997; Dickinson et al., 1999; Page and Parries, 2000, и другие). Кроме того, комплекс апикальных нейронов включает в себя нейроны, экспрессирующие пептид FMRFaMHfl (Kempf et al., 1992; Dickinson et al. 1999). В некоторых случаях серотонин и FMRFaMHfl могут быть колокализованы в одной клетке (Voronezhskaya et al., 2002), а у Lymnae stagnalis в двух апикальных нейронах, являющихся рудиментами апикального органа (Voronezhskaya et al., 1999; Kuang and Goldberg, 2001; Koss et al., 2003) колокализованы как минимум три трансмиттера: серотонин, дофамин и FMRFaMiw (Voronezhskaya and Elekes, 1993; Voronezhskaya etaL, 1999; Voronezhskaya and Elckes, 2003).
Структурная организация апикального органа позволяет предположить, что он воспринимает и передает многообразные химические сигналы, получаемые из окружающей среды, а также осуществляет первичную обработку полученной информации (см. например Kempf et al., 1997; Marois and Carew, 1997; Koss et al., 2003). Тем не менее десятилетия сравнительньж и экспериментальньж исследований не привели к формированию аргументированного взгляда на функцию апикального органа. Считается, что он участвует в индукции оседания и/или метаморфоза личинки (Conklin, 1897; Chia and Rice, 1978; Hadficld ct al., 2000). На связь этого хемосенсорного органа с метаморфозом указывают многочисленные данные. Так, у личинки моллюска Haliotis на ресничках апикального султанчика обнаружены рецепторы к фактору внешней среды - релизеру метаморфоза (Baxter and Morse, 1992). Личинка моллюска
Phestilla после разрушения нейронов в основании апикального органа теряла способность отвечать на такие релизеры, хотя способность проходить метаморфоз при этом сохранялась (Hadfield et al., 2000). Однако существуют факты, которые не вписываются в представление о том, что апикальный орган нужен исключительно в период прохождения метаморфоза. Так, известно, что этот хемосенсорный орган дифференцируется как одна из наиболее ранних нейронньж структур и полностью формируется раньше центральных ганглиев, то есть задолго (у разньж видов от нескольких дней, до нескольких недель) до готовности личинки к метаморфозу (Беклемишев, 1964; Иванова-Казас, 1977; Marois and Carew, 1997 и другие), причем у некоторьж видов он редуцируется еще до прохождения метаморфоза (Page, 2002; Wanninger and Haszprunar, 2003). Хотя было показано, что среди сенсорных нейронов апикального органа всегда присутствуют серотонинергические (Page and Parries, 2000; см ссылки выше), однако вызвать серотонином метаморфоз удалось только у одного из нескольких протестированных видов (Leise et al., 2001).
Зародыши, пресноводных улиток большого прудовика, Lymnaea. stagnalis, и аквариумной катушки, Helisoma trivolvis (Mollusca Pulmonata Basommatophora) представляют уникальную модель для изучения возможной функции раннего хемосенсорного органа, в индивидуальном развитии. Их зародыши развиваются, проходя те же главные стадии, что и морские гастроподы, личинки которьж, как правило, выходят из яйцевых оболочек намного раньше. Спиральное дробление яйца прудовика и катушки приводит к образованию «зародыша», плавающего в перивителлиновой жидкости благодаря биениям ресничек. Эта личиночная стадия соответствует трохофоре. Трохофора развивается в велигера, который через несколько дней начинает прикрепляться ногой к внутренней поверхности яйца, что соответствует оседанию свободноживущей личинки. Несколько позже велигер проходит метаморфоз, становясь ювенильной улиткой, ползающей при помощи ресничек подошвы по внутренней поверхности яйцевой капсулы (Мещеряков, 1975; Goldberg and Kater, 1989; Voronezhskayaetal., 1999).
Развитие Lymnaea и Helisoma проходит практически одинаково. Это относится и к их хемосенсорному органу, который у обоих видов включает два нейрона. Каждый нейрон биполярен, его апикальный отросток заканчивается пучком ресничек, а базальный многократно ветвится недалеко от тела клетки, создавая область тонких отростков с варикозными расширениями. При достаточно сходной морфологии, нейроны апикального органа прудовика и катушки проявляют различный химизм. У прудовика они содержат преимущественно дофамин (экспрессируя также некий пептид
семейства FMRFaMiwa и серотонин) (Croll and Voronezhskaya, 1996; Voronezhskaya et al., 1999; Voronezhskaya and Elekes, 2003), а у катушки исключительно серотонин (Goldbeig and Kater, 1989; Diefenbach et al., 1991,1995,1998; Voronezhskaya and Elekes, 1993; Koss et al., 2003). На стадиях трохофоры-среднего велигера, только эти два нейрона являются моноаминергическими (Diefenbach et al. 1998; Voronezhskaya et al. 1999). Таким образом, зародыши прудовика и катушки являются уникальной моделью для изучения роли различньж моноаминов, выделяемых нейронами раннего хемосенорного органа на эмбриональное развитие и поведение.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось сравнительное изучение хемосенсорных систем модельных беспозвоночных и низших позвоночных животных на разньж стадиях онтогенеза для определения основньж закономерностей, лежащих в основе их строения, функционирования и развития.
Для достижения поставленной цели были подробно изучены строение и физиология следующих хемосенсорньж органов: обонятельная луковица головастика лягушки XenopuslaevisиocфpaщшпpecнoвoJщoйyлmкиLymnaeastagnalis. Основное внимание при этом уделялось базовым характеристикам сенсорньж систем и, где возможно, идентифицированным нейронам, определяющим физиологические особенности органов и регулируемое ими поведение.
Кроме того, было изучено возникновение и развитие нервньж структур у наиболее примитивного представителя хордовьж - асцидии Molgula citrina, у типичного представителя полухордовьж Balanoglossus, представителей вторичноротьж — форонид, типичных представителей типа Annelida - полихеты Phyllodoce maculata, а также у нескольких представителей различньж класов типа Mollusca. Особенное внимание уделялось закладке и развитию сенсорньж органов и их возможной роли в регуляции развития и поведения личинок.
Научная новизна работы
Впервые показано, что строение обонятельной луковицы Хепорш значительно отличается от того, что считалось ранее общим для всех позвоночных животных. Было обнаружено, что в нормально функционирующей обонятельной луковице осуществляется иннервация обонятельными сенсорными нейронами не одной, а нескольких обонятельных гломерул, а также доказано отсутствие глиальной и клеточной стенки гломерул.
Для изучения физиологических характеристик клеток обонятельной луковицы впервые была разработана методика культивирования срезов с сохранением как луковицы и сенсорного эпителия (мукозы), так и вышележащих отделов головного мозга, что позволило ставить электрофизиологические эксперименты параллельно с измерением уровня Са2+ в нейронах, сохраняющих эфферентные и афферентные связи. Изучена роль норадреналина в механизме торможения митральных клеток и показано, что оно осуществляется путем блокирования пресинаптических Са2+-токов, опосредуемых а2-адренорецепторами.
Была подробно изучена нервная система важных в филогенетическом плане личинок наиболее примитивного хордового животного асцидии,. полухордового животного Balanoglossus proterogonius, различных видов иглокожих и форониды Phoronopsis harmeri. Было показано, что у них полностью отсутствуют обонятельные гломерулы, что имеет важное значение для понимания появления этих структур в филогенезе.
Впервые были обнаружены периферические нейросекреторные клетки и GABA-ергические первичные сенсорные нейроны в хемосенсорыом органе большого прудовика. Показана возбуждающая роль GABA в этом органе и описано взаимодействие нейротрансмиттеров, необходимое для первичной обработки хемосенсорной информации на уровне периферических сенсорных входов. Описан новый механизм участия периферического хемосенсорного органа в управлении поведением - прямое тоническое тормозное действие.
Впервые было гистохимически и биохимически показано присутствие системы синтеза окиси азота (NO-синтазной активности) в нервной системе беспозвоночных животных и предположено участие N0 в хеморецепции.
Впервые описан неизвестный ранее провизорный сенсорный орган, расположенный па каудальном конце тела у личинки полихеты Phyllodoce maculata.
Обнаружено, что у трохофорных животных первые нервные элементы, дифференцирующиеся в процессе нейрогенеза и маркирующие контуры будущей ЦНС, являются периферическими хемосенсорными нейронами. Впервые показана роль ранних хемосенсорных нейронов в индивидуальном развитии пресноводных моллюсков. Обнаружено, что продуцируемый нейронами апикального органа трансмиттерный моноамин тормозит эмбриональное развитие, и такое торможение функционально значимо при развитии в среде, неблагоприятной для метаморфоза и вылупления.
Научно-теоретическое и практическое значение работы
Данные о клеточном строении и связи нервньж элементов значительно изменили существующее представление о строении обонятельной луковицы у низших позвоночньж. Описанные механизмы нейронного и трансмиттерного взаимодействия в хемосенсорньж системах модельных беспозвоночных и низших позвоночньж расширяют существующие представления о роли сенсорньж нейронов в поведении. Данные о возникновении и онтогенетическом развитии хемосенсорньж систем у личинок трохофорньж, полухордовьж и хордовьж животньж раскрывают неизвестную ранее функцию ранних периферических нейронов в индивидуальном развитии. Совокупность представленных данньж является важной для понимания механизмов развития и функционирования сенсорньж. систем, а разработанная методика культивирования срезов может найти применение при изучении патологий обоняния.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Строение обонятельной луковицы низших позвоночньж (на примере головастика шпорцевой лягушки Xenopus laevis) принципиально отличается от того, что ранее считалось общепринятым для позвоночньж. Так, отдельные обонятельные рецепторные нейроны проецируются не в одну обонятельную гломерулу каждый, а в несколько, причем сложным перекрестным образом. Сами гломерулы не имеют клеточной стенки, и их пространственная организация определяется исключительно взаимодействием аксонов обонятельных рецепторньж нейронов и дендритов митральных клеток.
-
Возможно культивирование срезов обонятельной луковицы с сохранением как периферических входов, так и центральных проекций составляющих ее нейронов, с сохранением клеточной специализации и основньж физиологических характеристик нейронов в такой культуре.
-
В нервной системе личинок важных в филогенетическом плане животньж: наиболее примитивного хордового животного асцидии, иглокожих, полухордового животного Balanoglossus и вторичноротого животного Phoronopsis не обнаружены обонятельные гломерулы, что имеет большое зпачепие для понимания появления этих структур в филогенезе.
-
Аналогично позвоночным, система синтеза окиси азота (NO-синтазная. активность) присутствует в нервной системе продвинутых беспозвоночных, локализована в определенных участках нервной системы и участвует в хеморецепции.
-
В хемосенсорном органе прудовика Lymnaea stagnalis гамма-аминомасляная кислота служит возбуждающим нейротрансмиттером. Не только интенсивность, но и
полярность реакции на нейротрансмитгеры модулируется, в частности, серотонином. Таким образом, интегративная функция медиаторов проявляется не только в координации моторных программ, как считалось ранее, но также и в модуляции сенсорньж входов и процессинге поступающей информации, осуществляемыми уже на уровне периферической сенсорной структуры. Кроме приема информации и передачи ее в центральные отделы, периферический хемосенсорный орган оказывает, непосредственное тоническое влияние на реализацию поведенческой программы.
6. У трохофорньж животных периферические хемосенсорные нейроны являются первыми нервными элементами, которые дифференцируются - в онтогенезе. Их активность оказывает непосредственное влияние на развитие. Продуцируемый нейронами апикального органа трансмиттерный моноамин тормозит эмбриональное развитие, и такое торможение функционально значимо при развитии в среде, неблагоприятной для вылупления.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы были доложены на I-V Международных Конференциях «Простые Нервные Системы» (Regional Meetings of the International Society for Invertebrate Neurobiology) (Казань, 1985, 1988; Минск, 1991; Пущино, 1994, 2000; Москва, 1997; Калининград 2003); VI и VIII Симпозиумах Международного Общества Нейробиологии Беспозвоночных (ISIN) (Symposium on Invertebrate Neurobiology, Tihany, Hungary, 1987, 1996); на Симпозиуме «Проблемы филогении и систематики иглокожих» (Таллин, 1987); на II Всесоюзном Совещании по Проблемам Эволюции (Москва, 1988); на Международном Симпозиуме «Интегративная деятельность нейронов: молекулярные основы», посвященном 90-летию со дня рождения П.КЛнохина (Москва, 1988); на X Всесоюзном Совещании по Эволюционной Физиологии, посвященном памяти академика Л.А.Орбели" (Ленинград, 1990); на IV международном симпозиуме по нейробиологии моллюсков (IVth International Symposium on Molluscan Neurobiology, SIMON, Amsterdam, the Nederlands, 1994); на 24м и 30м съезде Нейробиологического Общества (24th and 30th Annual Meetings of the Society for Neurosciences, Miami Beach, USA, 1994, San Diego, USA, 2001); на 26й, 28й и 29й Геттингенских нейрообиологических конференциях (26th, 28th and 29th GoettingenNeurobiology Conferences, Goetingen, Germany, 1998,2001,2003); на XV Конгрессе Европейского Общества Хеморецепции (XVI Congress of European Chemoreception Organisation, ECRO, Erlangen, Germany, 2002).
Публикации
По теме диссертации опубликовано и принято в печать 53 статьи в реферируемых журналах, из них 23 в отечественньж и 30 в международньж журналах, а.также 36 тезисов докладов на всесоюзных, всероссийских и международньж конференциях..
1. Объекты исследования
Основными объектами исследования служили головастики африканской шпорцевой лягушки Xenopus lexis (Amphibia: Anura), получаемые методом стимуляции нереста инъекцией гонадотропина на факультете нейрофизиологии университета г. Геттинген (Германия), и взрослые особи, и эмбрионы пресноводных улиток из лабораторной культуры Института биологии развития РАН: большой прудовик Lymnaea stagnalis и аквариумная, катушка Helisoma trivolvis (Mollusca: Pulmonata). Кроме того, в сравнительном плане изучались репрезентативные представители важнейших таксономических групп беспозвоночных животных: плоские черви (Plathelmintes), круглые черви (Nematoda), многощетинковый червь Phyllodoce metadata (Polychaeta: Phyllodocidae), примитивный многощитковый моллюск хитон Icshnochiton hakodadensis (Mollusca: Polyplacophora), примитивное вторичноротое форонида Phoronopsis harmeri (Phoronida), личинки нескольких видов иглокожих (Echinodermata), включая морских звезд, морских ежей, голотурий и офиур, а также торнария - личинка полухордового кишечнодышащего Balanoglossus proterogonius (Hemichordata) и личинка наиболее примитивного хордового - асцидии - Molgula citrina (Chordata).
2. Электрофизиологические эксперименты
1) Головастик X laevis..
Головастиков на стадиях развития 50-56 (по Neiuwkoop, 1956) анестезировали, погружая в смесь воды со льдом, и вырезали блок ткани, содержащий головной мозг и обе обонятельные камеры. Блок приклеивали на столик вибратома (Leica), помещали в физиологический раствор для ксенопуса (Geiling and Schild 1996) (в миллимолях: 101 NaCl, I КС1, 2 MgCl2, 5 Glucose, 5 Na-Piruvate, 10 HEPES, pH 7.8) и срезали верхнюю четверть мозга (при работе с нейронами обонятельной, луковицы) или верхнюю половину обонятельных камер (при работе с обонятельными рецепторными нейронами). Затем препарат помещати в физиологический раствор в чашку Петри (диаметр 40 мм) с отверстием в дне (20x10 мм), заклеенном покровным стеклом, и
фиксировали рамкой. Нейроны обонятельной луковицы или мукозы изучали методом patch-clamp в конфигурации whole cell. Для регистрации физиологической активности и инъекции красителей использовали установку, смонтированную на прямом микроскопе Axioscope 100 (Zeiss). Для регистрации динамики кальция в нейронах использовали установку, смонтированную на инвертированном лазерном конфокальном микроскопе LSM-510 (Zeiss).
Срезы (свежие или культивированные) помещали в камеру на столик прямого или инвертированного микроскопа, на котором были смонтированы микроманипуляторы и предусилитель микроэлектродного усилителя (ЕРС7, List, Germany). Микропипетки с диаметром кончика 1-2 мкм и сопротивлением 6-8 МІЇ вытягивали из боросиликатного стекла при помощи двухступенчатого пулера (Narishige, Japan) и полировали нагреванием. Толчки тока и напряжения генерировались микроконтроллером, направлялись в D/A преобразователь и затем в усилитель. Ток и напряжение отцифровывались в режиме on-line и записывались в компьютер. Управление экспериментом и обработка данных осуществлялись на PC в операционной системе LINUX (SuSE).
2) Прудовике, staznalis.
Улиток анестезировали, погружая в смесь воды со льдом, и вырезали осфрадий вместе с небольшим участком стенки тела, окружающей его сенсорный канал. Затем стенку тела прикалывали микроиголками на дно чашки Петри (диаметр 40 мм), покрытое силиконом, содержащей физиологический раствор для прудовика (Benjamin, Winlow, 1981) (вмиллимолях: 50 NaCl, 1.7 KCl, 4 СаСЬг, 1.5 MgCl2, 10 Tris, pH 7.8). Отверстие канала прижимали ко дну так, чтобы можно было апплицировать химические вещества непосредственно на поверхность осфрадиального ганглия, а не на сенсорный эпителий.
Для экстраклеточной регистрации конец осфрадиального нерва засасывали в пластиковую микропипетку и подводили вплотную к нему кончик серебряного хлорированного электрода. Электрическую активность в осфрадиальном нерве записывали, используя стандартное оборудование (Micromed, Hungary). Сигнал конвертировали при помощи A/D преобразователя, записывали в IBM совместимый компьютер и подвергали рамочному дискриминационному анализу (windows discrimination analysis) при помощи специально написанной программы (NIBR). Два стандартных участка записи по 30 сек - один непосредственно перед аппликацией вещества, а другой через 30 сек после аппликации - обсчитывались по следующему алгоритму: каждая запись разбивалась на 9 равных и всегда одинаковых амплитудных
| 4
1.6
iiuii. rr-Нт і
U.liiUitKniliLilllljibthl.
ІІфІТТГ'Чіупчі'Чії^іщліі'і Ts-HT Юсек
''г'' ',',1'f |l
Рис 1. Запись активности в осфрадиальном нерве после аппликации 5-НТ (10 мкл, 100 мкМ) с наложенной на нее рамкой для амплитудного дискриминационного анализа.
зон по отношению к уровню шума (рис. 1). Подсчитывались спайки, оканчивающиеся в каждой амплитудной зоне. Спайки, оканчивающиеся в зонах 1,2,8,9 объединялись как «большие», 3 и 7 — «средние», а 4 и 6 - «маленькие». Зона. 5 считалась, «шумом» и не учитывалась. После. 5-НТ-апшшкации; подсчитывалось аосолютное изменение суммарного числа спаиков и спайков каждой из трех групп, а затем вычислялось изменение в процентах относительно числа спайков непосредственно перед аппликацией. Для каждого вещества подсчитывалось среднее значение. Для определения, достоверности результатов использовали критерий Стьюдента (f-test). «Отсутствием эффекта» считали изменение числа спайков менее чем на 10%, «слабым эффектом» - на 10-20% и «сильным эффектом - более чем на 20%.
Для внутриклеточной регистрации активности нейронов осфрадия его прикалывали ко дну чашки Петри, обрабатывали протеазой (Protease Е, 0.3%, 10 мин.), заливали в кашпо низкотемпературной агарозы (low gelling Agarose, Sigma) и заполняли чашку физиологическим раствором. Использовали острые стеклянные микроэлектроды, заполненные З М КС1 или 10% раствором Люцифера желтого (Lycifer yellow, Sigma), с сопротивлением 35-45 Mfl. После усилителя (Micromed) сигнал конвертировался АЦП и записывался в компьютер.
Аппликацию химических веществ проводили из автоматической микропипетки локально - 10 мкл раствора за 2 секунды на поверхность ганглия. При одиночньж аппликациях промывка, после каждой составляла 20 мин. При последовательной аппликации нескольких веществ их подавали через 2 мин без промежуточной промывки. Каждый препарат использовали только для одной серии аппликаций.
Для инъекции в клетку Люцифера из микроэлектрода подавали гиперполяризационный ток (2-3 нА, 3-5 час). После инъекции препарат помещали в свежий физиологический раствор на 3-5 часов при 10 С, затем фиксировали в 4% растворе параформальдегида на 0.1 М Na-Na фосфатном буфере (ФБ, рН 7.4), просветляли в ФБ с глицерином (1:1) и изучали под эпифлуоресцентным микроскопом Jenaval (Zeiss Jena).
3. Культивирование срезов мозга
Головастиков X. laevis обеззараживали в растворе КМп04 (7.5 мкМ), анестезировали на льду, ополаскивали в 70% этаноле и стерилизованном растворе Рингера. Затем вырезали блок ткани, резали на вибратоме (Leica VT1000) и срезы (250 мкм) переносили на стерильное покровное стекло 12x24 мм в каплю (30 мкл) куриной плазмы.(0.2 мг% гепарина, Cocalico Biologicals, USA). Затем на стекло добавляли 30 мкл тромбина (Merck, Germany), активность которого была понижена до 167 Ед/мл разбавлением, и перемешивали. Стекла помещали, в культивационные пробирки (Nunc, Danmark), в 750 мкл забуференной HEPES культивационной среды (FM-65-L), содержащей: 5% лошадиной сыворотки и 5 мг% гентамицина (Sigma). Пробирки помещали на наклонный вращающийся диск (1 об/мин) и культивировали при 20-22 С, меняя кулыуральную среду каждые 4-6 дней.
4. Ретроградное и антероградное окрашивание
Для одиночного окрашивания использовали биоцигин (Molecular Probes, USA). Для двойного окрашивания использовали биоцигин в комбинации с пероксидазой хрена (horseradish peroxidase, Sigma) или декстраном (3 кДа, коныогирован. с Texas Red, Molecular Probes).
Для антероградного окрашивания обонятельных гломерул ксенопуса головной мозг с обонятельными нервами отпрепаровывали в физиологическом растворе. На покрытое силиконом дно чашки Петри, заполненной физиологическим раствором, помещали кашпо минерального масла. В центр капли прикалывали округлый кусочек фильтровальной бумаги, смоченной физиологическим раствором. Мозг прикалывали рядом с каплей и концы нервов прикрепляли к фильтровальной бумаге, так что они были изолированы маслом. Затем, на фильтровальную бумагу наносили 4-5 мкл 1% раствора биоцитина или декстрана в дистиллированной воде. Через 1-2 часа мозг помещали в свежий физиологический раствор на 2 часа, затем фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере.
Для ретроградного окрашивания митральных клеток головной мозг отпрепаровывали в физиологическом растворе, осушали, быстро помещали при помощи микроиголок маленький кристаллик биоцитина или декстрана в мозг на уровне передней комиссуры в область прохождения латерального обонятельного тракта, закрывали это место минеральным маслом и помещали мозг в проток
физиологического - раствора. Через 3-5 часов мозг фиксировали в 4% параформальдегиде.
После 5-Ю часов фиксации мозг отмывали в фосфатном буфере и серийно резали или на замораживающем микротоме (Criocut, Leica), срезы 20 мкм, или на вибратоме (VT1000, Leica), срезы 50 мкм. Для выявления биоцитина срезы инкубировали в растворе авидина, коньюгированного с А1еха-488 (5 мкг/мл в ФБ) в течение 4-5 часов, затем просветляли в ФБ с глицерином (1:1) и заключали в ФБ-глицерин (1:2).
4. Иммунохимическое маркирование
Для иммунохимического маркирования медиатор-специфичных нервных элементов использовались антитела против следующих нейромедиаторов:
Серотонин (5-НТ): поликлональные антитела, выработанные в кролике, DiaSorin, USA;
Нейропептид БМЕБаМамвд поликлональные антитела, выработанные в кролике, DiaSorin, USA;
Бамма-аминомаслянная кислота (GABA): поликлональные антитела, выработанные в мыши, Sigma, USA;
Блютамат: поликлональные антитела, выработанные в кролике, любезно предоставлены профессором Оттерсеном (Университет Осло, Норвегия);
Лейцин и метионин-энкефалин: поликлональные антитела, выработанные в кролике, lncstar, USA.
Для маркировки синаптических контактов использовали антитела против синаптофизина, поликлональные, выработаны в кролике, любезно предоставлены доктором Яном (Институт Макса Планка, Беттинген, Бермания).
Для. маркировки клеточных ресничек и цитоскелета нейрональных элементов использовались антитела против ацетилированного а-тубулина: моноклональные, произведены в мыши, Sigma, USA
Радиальную шию в обонятельной луковице головастика выявляли антителами против виментина, mouse clonVim ЗВ4, DAKO, Danmark.
Для выявления инъецированной пероксидазы хрена использовали антитела против пероксидазы хрена, моноклональные, выработаны в мыши, Sigma, USA.
Первичные антитела выявляли при. помощи вторичных антител против иммуноглобулинов кролика или мыши, меченных одним из следующих флуоресцентных маркеров: флуоресцеинизотиоцианат (БІТС), родамин, Texas Red,
Alexa-488, Alexa-546 (все Molecular Probes, USA). Для лазерной конфокальной микроскопии использовали только маркеры Alexa-488 и Alexa-546.
Для точного определения тел нейронов при иммунохимической реакции и окрашивании использовали флуоресцентные маркеры ДНК: йодистый пропидий и DAPI (Molecular Probes), которые добавляли в буфер для последней перед заключением промывки в концентрации соответственно 5 и 3 мкг/мл.
Препараты изучали и фотографировали при помощи микроскопа проходящего света. Jenaval, эпифлуоресцентного микроскопа Axiovert 1000, или лазерного конфокального микроскопа LSM510 (все Zeiss, Germany),
5. Подсчет числа клеток Число нейронов различного типа и гломерул в обонятельной луковице головастика подсчитывали на серийных срезах мозга, сделанных на замораживающем микротоме. Для каждого типа клеток было выбрано пять полных серий, в которьж окрашивалось наибольшее число клеток. Подсчитывали число клеток или гломерул на каждом срезе и суммировали. Поправку на двойной подсчет вводили, деля результат mi(l+d/t), где d средний диаметр клеток или гломерул, a t толщина срезов (Weibel, 1979).
6. Электронная микроскопия Использовали стандартные методы трансмиссионной (ТЭМ) и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Для ТЭМ животных анестезировали и ткани фиксировали в 2.5% глутаральдегиде в 0.05 - 0.1 М какодилатном буфере (рН 7.4), изотоничном- внутренней среде животного 1.5-4 часа при 4С, отмывали в какодилатном буфере, постфиксировали 1 час при комнатной температуре в 2% растворе четырехокиси осмия в какодилатном буфере, проводили через: спирты и заливали в Аралдит, Эпон, или Спурр. Полутонкие срезы' толщиной 1-2 мкм окрашивали толуидиновым синим и изучали под световым микроскопом. Ультратонкие срезы 40-60 нм получали на ультратоме LKB-III (LKB, Sweden), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца вручную или в приборе для окрашивания Ultrastainer Carlsberg System (Sweden) и изучали в электронных микроскопах Jeol JEM 100В, JEM 100СХ, или JEM 1200ЕХ. Дтя СЭМ животных фиксировали аналогично, поверхность хемосенсорного эпителия обрабатывали 6 часов в растворе гиалуронидазы (Sigma, 50-100 единиц на мл) в фосфатном буфере, обезвоживали в серии спиртов, высушивали в критической точке С02 (Balseres Union Critical Point Dryer, Sweden),
монтировали на столик и напыляли 14 нм золота, используя Bio-Rad Polaron Coating System. Препараты изучали в сканирующих микроскопах Jeol JEM 100СХ и JSM-T330.
7. Повенденческие эксперименты Для поведенческих экспериментов использовали больших прудовиков L. stagnalis. Для изучения влияния осфрадия на поведение животньж их разделяли в каждой из шести экспериментальных серий на четыре группы по 20 особей: а) группа с удаленным осфрадием; б) группа с перерезанным, осфрадиальным нервом; в) интактные; г) ложно-оперированные. Для операций улиток анестезировали инъекцией раствора MgC2 (50 мМ, 1 мл) и удаляли осфрадий или перерезали осфрадиальный нерв под бинокуляром через маленький разрез стенки мантии. Улиток группы г) аналогично анестезировали и делали разрез, но осфрадий не удаляли. Всех улиток содержали в одинаковых условиях 50 дней после операции. Число отложенньж яиц подсчитывали каждый день. Данные для. каждой группы объединяли и: подсчитывали среднее значение и стандартное отклонение. Достоверность результатов определяли по критерию Уилкоксона (Wilcoxon matched pairs test).
8. Идентификация системы синтеза окиси азота (NO) Для гистохимического выявления НАДФдиафоразной активности животньж анестезировали погружением или инъекцией 0.2 М раствора MgC2 и фиксировали в 4% параформальдегиде на ФБ 5-6 мин при 4С. Затем отмывали в ФБ, инкубировали в 20% растворе сахарозы в 0.1 М трис-НС1 буфере (ТБ), замораживали в жидком азоте и резали на криостате (Frigocut Е, Reichert-Jung) серийные срезы 30 мкм. Срезы приклеивали на покрытые хром-алюм-желатиной предметные стекла, сушили на воздухе, промывали в ТБ и инкубировали в растворе, содержащем 1 мМ натриевой соли NADPH (Sigma), 0.5 мМ Nitro Blue Tetrazolium (NBT, Sigma) и 0.2% TritonX-100 в 0.05-0.5 M ТБ в течение 1 часа в темноте при комнатной температуре. Затем промывали в ТБ, обезвоживали в серии спиртов, просветляли в ксилоле и заключали в Энтеллан. Контроля включали замену NADPH на NADP, NADH, или NAD, а также исключение из реакции NADPH innrNBT.
Для биохимического выявления NO-синтазной активности использовали три разных источника ткани прудовика: осфрадий, буккальные ганглии и остальные ганглии ЦНС. Указанные ткани вырезали из 75 анестезированных прудовиков и собирали в гемолимфу прудовика при 0С. Ткань гомогенизировали при 0С в 20 мМ HEPES, 0.5
мМ EDTA, 1 мМ dithiothrcitol (DTT), рН 12. Гомогенат центрифугировали при 35000 g 10 минут, осадок растворяли в свежем буфере и проводили ферментативную реакцию при постоянном аэрировании при комнатной температуре с 2 мМ NADPH, 0.9 мМ СаСЬ, 0.4 мМ L-aiginine и 25 U/m calmodulin (Sigma). Контроль включал 0.1 мМ Nffl-nitro-L-aiginine (N02Arg, Sigma) в качестве ингибитора. По 200 мкл инкубационного раствора отбирали, центрифугировали при 10000 g 10 минут и смешивали 150 мкл супернатанта с 150 мкл o-phtaldialdehyde reagent solution (Sigma) перед тем, как провести HPLC анализ синтезированного цитруллина. (Heckeer et aL, 1990).
