Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 9
1.Бактерия Aeromonas hydrophila и ее свойства .9
2.Иммунная система человека и инфекционные процессы .23
3. Роль различных звеньев иммунитета в развитии иммунного ответа на инфицирование бактериальным агентом 27
4.Гранулематозное воспаление как морфологический субстрат инфекционных заболеваний .30
5.Патоморфология инфекционного процесса, вызванного A. hydrophila 34
Материалы и методы .38
1. Общая характеристика материала 38
2. Методы исследования .38
2.1. Микробиологические методы .38
2.1.1. Выделение культуры бактерий A.hydrophila из медицинской пиявки .39
2.1.2. Идентификация бактерий 39
2.1.3.Исследование степени полиморфизма бактерий в популяции при подготовке инфицирующей суспензии 40
2.1.4. Определение ДНК-азной активности бактерий .41
2.1.5. Исследование чувствительности исследуемых штаммов к препаратам противомикробного действия .41
2.1.6. Исследование вирулентных свойств бактерий методом биопробы .42
2.1.7. Заражение животных для морфологических исследований .42
2. 2. Молекулярно-генетические методы .43
2.2.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК 43
2.2.2. Электрофорез ДНК 43
2.2.3. Полимеразная цепная реакция .44
2.3. Иммунологические методы 44
2.3.1. Определение продукции термолабильного токсина у A.hydrophila 342-2 .44
2.4. Культуральные методы .45
2.4.1.Исследование вирулентных свойств бактерий A. hydrophila в отношении культуры энтероцитов человека Caco-2 .45
2.4.1.1. Культивирование клеток культуры Caco-2 45
2.4.1.2.Исследования повреждающего действия бактериальной суспензии 45
2.5. Гистологические методы .46
2.6.Гистохимические методы 46
2.7.Бактериоскопические методы 46
2.8.Морфометрические методы .46
2.9.Гематологические методы .46
2.10. Статистические методы .46
3. Обоснование выбора модели исследования и условий эксперимента 47
3.1. Выбор штамма возбудителя .47
3.2. Выбор условий культивирования возбудителя 47
3.3. Выбор способа инфицирования животных 48
3.4. Выбор инфицирующей дозы .49
3.5. Выбор режима исследования .49
3.6. Выбор экспериментальных животных 49
Результаты собственных исследований .51
1. Выделение, идентификация и сравнительная оценка вирулентных свойств различных штаммов A. hydrophila 51
1.1. Выделение и идентификация бактерий .51
1.2. Исследование степени полиморфизма бактерий в популяции при подготовке инфицирующей суспензии 53
1.3. Оценка вирулентных свойств различных штаммов A. hydrophila .55
1.3.1.Оценка вирулентных свойств бактерии A. hydrophila методом постановки биопробы на белых беспородных мышах .55
1.3.2.Исследование ферментативной активности ДНК-азы различных штаммов A.hydrophila 56
1.3.3. Исследование чувствительности исследуемых штаммов к препаратам противомикробного действия 57
1.3.4. Исследование генома бактерий A. hydrophila методом электрофореза в агарозном геле и визуализация плазмидной ДНК 59
1.3.5. Определение продукции факторов вирулентности у бактерии A.hydrophila 342-2.. 59
1.3.6. Исследование повреждающего действие бактерий A. hydrophila 342-2 на культуру энтероцитов кишечника человека Сасо-2 .59
2. Морфологические изменения органов белых беспородных мышей, вызванные подкожным введением бактерии A. hydrophila 342-2 .60
2.1. Результаты микробиологических исследований .62
2.2. Результаты морфологических исследований 63
2.2.1.Морфологические изменения внутренних органов белых беспородных мышей при подкожном инфицировании A. hydrophila 342-2 .63
2.2.2. Морфологические изменения органов иммунной системы белых беспородных мышей при подкожном инфицировании A.hydrophila 342-2 67
3. Морфологические изменения внутренних органов и иммунной системы мышей линий Balb/C и C57Bl/6 при подкожном инфицировании A. hydrophila 342-2 74
3.1.Результаты микробиологических исследований 74
3.2. Динамика лейкоцитарной реакции у мышей линий Balb/C и C57/Bl6 76
3.3. Результаты морфологических исследований .77
3.3.1.Исследование морфологических изменений внутренних органов мышей Balb/C и C57/Bl6 при подкожном инфицировании A. hydrophila 342-2 77
3.3.2. Морфофункциональные изменения органов иммунной системы мышей Balb/C и C57/Bl6 при подкожном инфицировании A. hydrophila 342-2 87
3.3.2.1. Морфологическая и морфометрическая характеристика тимуса мышей контрольных и экспериментальных групп линий Balb/C и C57/Bl6 при подкожном инфицировании A.hydrophila 87
3.3.2.2.Морфологическая и морфометрическая характеристика селезенки мышей контрольных и экспериментальных групп линий Balb/C и C57/Bl6 при подкожном инфицировании A.hydrophila 342-2 100
3.3.2.3.Морфологическая характеристика регионарных лимфатических узлов мышей контрольных и экспериментальных групп линий Balb/C и C5Bl/6 при подкожном инфицировании A.hydrophila 342-2 109
Обсуждение полученных результатов .119
Выводы .133
Список цитируемой литературы
- Роль различных звеньев иммунитета в развитии иммунного ответа на инфицирование бактериальным агентом
- Исследование чувствительности исследуемых штаммов к препаратам противомикробного действия
- Исследование степени полиморфизма бактерий в популяции при подготовке инфицирующей суспензии
- Морфологическая и морфометрическая характеристика тимуса мышей контрольных и экспериментальных групп линий Balb/C и C57/Bl6 при подкожном инфицировании A.hydrophila
Роль различных звеньев иммунитета в развитии иммунного ответа на инфицирование бактериальным агентом
Морфология бактерий и степень проявления их вирулентности изменяется в различных условиях культивирования [Jennings J. et al., 1967], в том числе, в зависимости от температуры культивирования [Ralph HW et al., 1990; Imbert M.et al., 2003; Kirov SM, et al., 1993]. Исследование белкового состава мембраны A.hydrophila 7966 при культивировании на одной и той же синтетической среде, но в различном температурном режиме от 30 до 5С позволило обнаружить феномен адаптивной продукции и сверхэкспрессии некоторых белков (МВ 7.5-11 KДa), которые отнесли к белкам холодового шока [Imbert M. et al 2003].Тем не менее, продукция цитотоксина, гемолизина и лецитиназы сохранялась при культивировании в широком диапазоне температур: от 15 до 37С. 83% штаммов из окружающей среды продуцировали клеточный цитотоксин, и другие факторы вирулентности даже при 4 С [Haque Q,. et al., 1996]. А. hydrophila растет в широком диапазоне температур (5-65С), большинство авторов полагает, что бактерия погибает при нагреве до 70С и прекращает рост и затем погибает при температуре ниже 5С. Однако данные, касающиеся устойчивости бактерии к изменению температуры, составу и кислотности среды, противоречивы. Показано, что постепенное снижение температуры и длительное хранение A.hydrophuila при температуре 5С, особенно на бедной питательной среде, приводит к переходу бактерии в некультивируемое, VBNC – состояние (“viable-but-nonculturable” – «жизнеспособные, но некультивируемые») [Oliver, J. D. 1993, Kaprelyants A.S. et al., 1993, Wai S.N. et al 2000], то есть такое состояние, при котором сохраняется ее жизнеспособность, но она не может быть культивируема на стандартных для данного возбудителя средах.. Этот переход происходит постепенно: при культивировании A. hydrophila ATCC 7966 в течение 50-55 дней в фильтрованной стерилизованной морской воде, бактерии переходили в промежуточное состояние с изменением формы клеток, однако вслед за повышением температуры от 5 до 23C биологическая активность клеток A. hydrophila восстанавливалась, включая патогенные свойства. [Maalej S., et al., 2004]. Мутации в различных генах приводят к изменениям вирулентных свойств и способности этого возбудителя к обратимому переходу в VNBC [Vivas J. et al., 2004], что позволяет предположить различную способность к переходу в VNBC для штаммов A.hydrophila, различных по вирулентности. При переходе в некультивируемое состояние в результате действия низких температур (4С в течение 45 дней) [Maalej S., 2004] или голодания бактерия способна восстанавливаться на жидкой и твердой питательных средах, содержащих каталазу или пируват натрия [Wai S.N.et al., 2000]. Возможность существования A. hydrophila в VNBC-состоянии в организме человека не исследована.
Считается, что наиболее активный рост наблюдается при 22-28С и значении pH 5.5-5.8 [Aguilar A. et al., 1997], а культуры, изолированные из фекалий, крови и тканей больных людей культивировали при 35-37С [Vally H. et al., 2004, Epple H. J. et al., 2004; Wai S.N. et al., 2000]. Повышение и понижение значений рН также снижает скорость роста в питательной среде вплоть до прекращения его при рН 6 [Doherty A. et al 1996, Gill C.O.et al., 1997, Pin C. et al., 2004]. В ряде работ в качестве оптимальной считается диапазон рН 7,2-8 [Imbert M., 2003, Guimaraes M. S. Et al., 2002].
Данные, касающиеся вирулентных свойств A. hydrophila получены, в основном , in vitro, в том числе, на культурах различных тканей. Большое количество литературы посвящено влиянию присутствия отдельных веществ органической или неорганической природы на жизнедеятельность бактерий и токсинопродукцию. Показано, что важным для жизнедеятельности этих бактерий элементом является железо[Ebanks R.O. et al.,200; Lin S.H. et al., 1996]. При повышении концентрации Fe2+ в среде количество микробных тел в культуре A. hydrophila AWWX1 снижалось [Kersters I. et al., 1996]. Присутствие Zn2+ повышает вирулентность штамма АЕ-036, при этом изменяется также активность и стабильность металло-b-лактамазы [Filici A. et al., 1997]. Присутствие Mg2+ в среде влияет на степень адгезии бактерий in vitro и повышает экспрессию гена mgtE, кодирующего транспортные системы, в частности транспорт ионов [Merino S. et al.,2001]. Достоверно показана зависимость вирулентности штамма от наличия и концентрации кислорода в среде и атмосфере культивирования. Увеличение концентрации O2 повышает продукцию токсинов [Tsai G. et al., 1996, 1997; McMahon M.A. et al., 2000]. При высоких концентрациях СО2 (50-100%) протеолитическая и гемолитическая активности бактерий отсутствовали. На свойства A.hydrophila также влияют сера, серосодержащие препараты [Filici A. et al., 1997], осмотическое давление [Aguilar A. et al., 1997], а также сочетание этих факторов. При содержании в среде NaCl в концентрации 200mM или более культура обладает более высокой чувствительностью к влиянию кислотности среды (рН 4.0). Инкубация в среде, содержащей NaCl в течение 5 минут снижала устойчивость бактерий к действию низких рН (выживаемость 0.06% против 40% в контроле). Аналогичным действием обладали остальные одновалентные анионы и катионы [Parvis A. et al., 1996]. Однако, эти данные не могут дать понимания патогенеза инфекционного процесса, происходящего in vivo и не могут заменить экспериментальных исследований с использованием в качестве биомоделей животных, чувствительных к данному возбудителю. В качестве такой модели могут выступать лабораторные мыши.
В настоящее время помимо классических микробиологических методов идентификации, разработана ПЦР-диагностика A. spp., позволяющая быстро идентифицировать бактерию до вида [Abdullah A.I. et al., 2003, Figueras M.J. et al., 2000]. Разработан ряд праймеров, позволяющих определять гены 16S-рибосомальной РНК и другие гены A.hydrophila, [Peng X., 2001, Abdullah A.I., 2003], в результате чего стало возможным качественное определение бактерии в природных и клинических образцах даже в относительно небольшой ее концентрации. Однако, с точки зрения феномена VNBS-состояния, возможности «гипердиагностики» и относительной дороговизны ПЦР - диагностики, в России клинические исследования проводятся по традиционным правилам микробиологии и большая часть лабораторных микробиологических исследований касается только «привычных» возбудителей кишечных инфекций типа возбудителя дизентерии или сальмонелл, относя остальные случаи в группу «диарей неизвестной этиологии» и лечится назначением антибиотиков широкого спектра действия.. В связи с этим, истинная доля участия A.hydrophila в развитии инфекционных процессов в России неизвестна.
Лечение заболеваний, вызванных A.hydrophila затруднено тем, что клинические проявления сходны с таковыми при стрептококковом или стафилококковом поражении мягких тканей, в связи с чем больным назначается стандартная противомикробная терапия, применяемая при раневых поражениях этими патогенами. Однако, в отличие от стафилококка и стрептококка эта бактерия устойчива по отношению к большинству антибиотиков, причем степень устойчивости бактерий варьирует для разных штаммов. При изучении чувствительности А. hydrophila к антибиотикам, используемым в терапии инфекционных заболеваний различных штаммов, выделенных от больных людей и из проб речной воды, было показано, что они одинаково устойчивы к пенициллину, карбенициллину, ампициллину и цетилпиридинхлориду, цефазолину [Vally H. et al., 2004], но обладают различной чувствительностью к налидиксовой кислоте, цефепаму и многим b-лактамовым антибиотикам [Benassi F.O. et al., 2001; Goni-Urriza M. et al., 2000]. Штаммы, выделенные из морепродуктов в Южной Индии, обладали чувствительностью к хлорамфениколу и были устойчивы к действию бацитрацина [Thayumanavan T., 2003]. Большинство диких штаммов обладают множественной антибиотикоустойчивостью. Например, штамм А. hydrophilaАН11 обладает устойчивостью в отношении стрептомицина, тетрациклина и эритромицина [Son R et al., 1997]. Показано, что некоторые штаммы A. hydrophila продуцируют металло-b-лактамазу, расщепляющую лактамовую группу антибиотиков b-лактамового ряда, при этом существует зависимость активности и стабильности фермента металло-b-лактамазы штамма A. hydrophila AE036 от присутствия ионов Zn2+. [Valladares M. et al., 1997]. Высокую эффективность по отношению к A. hydrophila in vivo и in vitro обнаружило совместное применение цефотаксима и миноциклина [Ko W.C. et al., 2001]. Большинство штаммов чувствительны к триметоприм - сульфометаксозолину и флуорхинолонам [Gilbert D.N. et al., 2000], действию котримоксазола, эффективно также назначение цефотаксима, цефтриаксона или ципрофлоксацина [Vally H. et al., 2004]. При поражении кожи, вызванном A. hydrophila в настоящее время для лиц, не имеющих нарушений иммунитета и при отсутствии сепсиса принято хирургическое иссечение, дренаж и удаление пораженной ткани с последующим лечением флуорхинолонами и триметоприм-сульфаметоксазолом [Gilbert D.N. et al., 2000].
Исследование чувствительности исследуемых штаммов к препаратам противомикробного действия
В проведенном исследовании использовались следующие животные и бактерии: I.. Штаммы Aeromonas hydrophila 341, Aeromonas hydrophila 342-1, Aeromonas hydrophila 342-2, выделенные из прудовой воды и больных рыб, любезно предоставленные д.б.н. Л.Н. Юхименко, (ВНИИ прудового рыбного хозяйства РАСХН г. Рыбное, Московской обл), и штаммы Aeromonas hydrophila ТX-1, Aeromonas hydrophila ТХ-2, Aeromonas hydrophila ТХ-3, выделенные в ходе работы из кишечника «диких» медицинских пиявок Hirudo medicinalis и двух групп «искусственной» молоди, выращенных на биофабрике, любезно предоставленных Директором биофабрики Каменевым О.Ю. (г. Санкт- Петербург). II. Мыши беспородные белые и линейные мыши, половозрелые самцы Balb/C и C57Bl/6 с генетически детерминированым преимущественно Th-2 и Th-1 типом иммунного ответа, вес 18-20 г в количестве 145 нелинейных мышей и 40 животных каждой линии (питомник «Андреевка», ГУ НЦ биомедицинских технологий РАМН). Животные содержались в открытой системе, клетки Т-4 (по 4-10 животных в каждой исходно), при температуре 18-20С, естественном освещении, влажность не контролировалась. Кормление регистрировалось в соответствии с Приказом МЗ СССР №1179 от 10.10 1983 со свободным доступом к воде. Протокол экспериментов в разделах выбора, содержания животных, моделирования патологических процессов и эвтаназии был составлен в соответствии с принципами биоэтики, соответствует этическим нормам, изложенным в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и Приказе МЗ РФ №267 от 19.06.2003, «Об утверждении правил лабораторной практики». III.При исследовании патогенного воздействия бактерий на живые клетки in vitro была использована клеточная культура энтероцитов человека Caco-2, полученная из лаборатории молекулярной биологии и биохимии Института молекулярной медицины Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова
Все микробиологические исследования проводились на базе НИИ пушного звероводства и кролиководства им. В.А. Афанасьева РАСХН. Стерилизация посуды, уничтожение бактерий и автоклавирование расходных материалов проводилось в соответствии с Положением о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, утвержденном постановлением Правительства РФ №554 от 24.07.00.
Пиявку, максимально растянув в длину, закрепляли булавками. С передней и задней присоски, с брюшной поверхности кожных покровов петлей переносили отделяемый секрет на чашки Петри с МПА.
Наружная поверхность кожных покровов обрабатывалась 70% спиртом, прижигалась раскаленным над спиртовкой скальпелем. По длине тела делался надрез, микробиологической петлей проводился посев содержимого кишечника. Через 18 часов инкубации при 36 С наблюдался рост изолированных колоний выделенной культуры. Для культивирования бактерий использовались агар бактериологический питательный (Махачкала, Россия), среда Эндо, агар с гидролизатом рыбной муки (ГРМ), мясо-пептонный агар (МПА), кровь донорская человеческая, глюкоза (чда), NaCl (ч), среда Лурия-Бертани (LB) (пептон 10 г, дрожжевой экстракт 5 г, NaCl 5 г, рН 7,5), для приготовления плотной среды к жидкой питательной среде LB добавляли 1,5 % агара. Использовались также Трис-буферный раствор рН 7,4; фосфатный буферный раствор рН 7,4; приготовленные в соответствии со стандартом. Бактерии суспендировались в стерильном физиологическом растворе или жидкой питательной среде и после морфологической и биохимической идентификации использовались для экспериментальных целей, хранение проводили на косяках МПА.
Идентификация культур, предположительно относящихся к роду Aeromonas, проводилась на основании морфологических, культуральных и биохимических свойств.
Морфологическое исследование проводилось в живом состоянии и окрашенном виде. В живом состоянии культура исследовалась методом раздавленной капли при увеличении х 900. Окраска мазка культуры по Граму проводилась по стандартной методике с использованием набора красителей “Sigma”.Биохимическая идентификация включала в себя исследование биохимических и культуральных свойств бактерий с использованием следующих сред: среда для определения уреазы, среда для определения триптофандезаминазы и индола, среда для определения лизинкарбоксилазы, среда Фогес-Проскауэра, среда для выявления сероводорода, среды для определения ферментации лактозы, сахарозы, сорбита, маннита, арабинозы, среда Хью-Лейфсона, цитратный агар Симонса, среда с малонатом Na, среда с ацетатом Na, трехсахарный агар Олькеницкого с мочевиной, среда Кларка, среда с фенилаланином, тест-реактивы для реакции с метиловым красным, реактив Ковача, реактив на триптофан-дезаминазу, на ацетоин, на цитохромоксидазу, на -лактамазу. Для интерпретации результатов использовали определитель бактерий Берджи [Хоулт Дж. с соавт, 1997].Проводили также пробу на оксидазу, способность к гидролизу эскулина и гемолизу эритроцитов барана, определялась подвижность в столбике полужидкого агара.
В ходе эксперимента для идентификации бактерий, выделенных из органов и крови инфицированных животных использовали диагностическую систему ПБДЭ (Пластина биохимическая, дифференцирующая энтеробактерии) (НПО Диагностические системы, Россия) в соответствии с инструкцией к тест-системе и дополнительных тестов, позволяющих определить принадлежность бактерий к изучаемому виду. Принадлежность выделенных из медицинской пиявки штаммов возбудителя к виду A.hydrophila подтверждена в аккредитованном Испытательном лабораторном центре противочумной станции МСЧ №1164 Федерального управления медико-биологических и экстремальных проблем при МЗ РФ (Приложение 2).
Для оценки степени полиморфизма бактерий в популяции проводилась окраска бактерий из 5 отдельных колоний или жидкой суспензии на 5 предметных стеклах по Граму, подсчет визуально коккоидных колоний в поле зрения и оценка их процентного содержания в суспензии. С целью снижения гетерогенности популяции при подготовке инфицирующей суспензии бактерии пересевали с косяка МПА, на котором проводилось хранение культуры, либо непосредственно из кишечника медицинской пиявки на твердую питательную среду МПА до моноколоний, затем из отдельной колонии производился посев в жидкую среду Лурия –Бертани. Через 18 часов инкубирования при постоянном перемешивании при 36С 0,1 мл суспензии вносили в свежую среду Лурия-Бертани, в которой повторно культивировали в течение 18 часов при 36С. По достижении морфологической однородности (содержание коккоидных форм менее 5%) бактерии осаждали центрифугированием при 7 000 об/мин и ресуспендировали в стерильном апирогенном физиологическом растворе. Количество микробных тел определяли визуально по стандарту мутности и по оптической плотности (109 КОЕ соответствует ОД 0.36 при 540 нм). Инфицирующую дозу (ИД) контролировали высевом суспензии бактерий на плотную питательную среду (LB).
Исследование степени полиморфизма бактерий в популяции при подготовке инфицирующей суспензии
Были проведены морфологические исследования тимуса, селезенки и регионарного лимфатического узла у белых беспородных мышей контрольной и экспериментальной групп на 3, 7, 14, 21 и 28 сут. В гистологических срезах тимус мышей контрольной группы имел нормальное строение. Корковый слой преобладал над мозговым. В мозговом слое определялись единичные в п.з (Ув. 200) тимические тельца 1-2 фаз развития по классификации Зайратьянца О.В. [1992] из 3-5 плотно расположенных эпителиальных клеток (рис.8А) и единичные в препарате кистоподобные тельца
При морфологическом исследовании на 3-и сут после инфицирования A.hydrophila 342-2 в тимусе мышей экспериментальной группы выявлялась акцидентальная инволюция I-II стадии. В субкапсулярной зоне наблюдалось увеличение числа лимфобластов, образующих 3-5 слоев клеток. Отмечалось увеличение числа телец Гассаля 1-2 фаз, часть их была образована 8-10 плотно расположенными эпителиальными клетками, выявлялись также тимические тельца 3-4 фаз развития в виде кистоподобных полостей, в том числе с начальными явлениями кальцификации.
На 7-14-е сут после инфицирования в нарастали признаки акцидентальной инволюции II-III стадии: корковый слой был очагово опустошен, граница между корковым и мозговым слоем нечеткая, в субкапсулярной зоне отмечалось увеличение числа бластных форм лимфоцитов по сравнению как с контролем, так и с предыдущим сроком исследования (рис.8 Б,В). В мозговом слое увеличивалось количество телец Гассаля 1-2 и 3-4 фаз развития. Отдельные кистоподобные тимические тельца располагались в корковом слое (рис.8 Г.). На 21-28-е сут отмечалась нормализация строения функциональных зон тимуса. Уменьшалась выраженность признаков акцидентальной инволюции, тимические тельца 1-2 фаз развития, состояли из 5-10 клеток. Встречались отдельные кистоподобные полости. Таким образом, подкожное инфицирование белых беспородных мышей A.hydrophila 342-2 приводит к развитию акцидентальной инволюции тимуса II- III стадии с последующей нормализацией функциональных зон к 28-м суткам. В селезенке белых беспородных мышей контрольной группы патологических изменений выявлено не было. Преобладала белая пульпа, часть лимфоидных фолликулов имела небольшие светлые центры. ПАЛМ были хорошо выражены (рис.9 А).
В селезенке мышей экспериментальной группы на 3-и сут после инфицирования A. hydrophila342-2 была отмечена гиперплазия ПАЛМ. Лимфоидные фолликулы имели хорошо выраженные светлые центры и широкую маргинальную зону (рис.9 Б).
На 7-14 сут выявлялись признаки гиперплазии В-зон: в лимфоидных фолликулах светлые центры были расширены, представлены лимфобластами, отмечалось также расширение маргинальной зоны.
.На 21-28-е сут была отмечена тенденция к нормализации гистологической картины, сужение маргинальных зон и уменьшение размеров лимфоидных фолликулов, часть из которых сохраняла светлые центры. Выраженность ПАЛМ не отличалась от контроля (рис.9 В).
Таким образом, подкожное инфицирование белых беспородных мышей A.hydrophila 342-2 приводит к гиперплазии Т- и В-зон селезенки с нормализацией гистологической картины к 28-м сут. В регионарном лимфатическом узле мышей контрольной группы патологических изменений не выявлено. Паракортикальная зона состояла из 3-5 слоев лимфоцитов. Краевые, мозговые и промежуточные синусы с узким просветом содержали небольшое количество макрофагов и лимфоцитов. Лимфоидные фолликулы имели умеренно широкую маргинальную зону, часть фолликулов имела светлые центры (рис.10А), в которых встречались единичные митозы.
В регионарном лимфатическом узле мышей экспериментальной группы на 3-и сут после инфицирования отмечалась реактивная гиперплазия по смешанному типу. Т-зона была плотно заселена лимфоцитами. Светлые центры лимфоидных фолликулов были представлены, в основном, бластными формами, среди которых встречались клетки с явлениями кариорексиса. (рис.10Б,В). На 7-14-е сут отмечались умеренная гиперплазия коры, расширение паракортикальной зоны. В строме мозгового слоя преобладали гистиоциты, среди которых выявлялись диффузно рассеянные и очаговые скопления нейтрофилов. Синусная реакция на 3-7-е сут проявлялась в расширении краевых, промежуточных и мозговых синусов, в которых было большое количество макрофагов и лимфоцитов (рис.11). Выраженность синусных реакций снижалась на 14-е сут, количество клеточных элементов в краевых и мозговом синусах уменьшалось. На 21-28-е сут после инфицирования в регионарном лимфатическом узле выраженность признаков регионарного лимфаденита снижалась. Отмечалась умеренно выраженная гиперплазия коркового слоя, размеры лимфоидных фолликулов уменьшались В строме мозгового слоя преобладали гистиоциты, среди которых выявлялись диффузно рассеянные и очаговые скопления нейтрофилов. Краевые и мозговой синусы расширены, в них содержалось большое количество клеточных элементов с преобладанием макрофагов.
Таким образом, подкожное инфицирование белых беспородных мышей A.hydrophila (ИД 4,2х 108 КОЕ) приводит к развитию картины реактивного лимфаденита в регионарном по отношению к месту введения инфекционного агента лимфатическом узле, признаки которого максимально проявляются на 3-7-е сут, стихая до умеренно выраженных реакций к 14-м суткам с нормализацией Т- и В- зон и сохранением слабовыраженной синусной реакции на 21-28-е сут.
Морфологическая и морфометрическая характеристика тимуса мышей контрольных и экспериментальных групп линий Balb/C и C57/Bl6 при подкожном инфицировании A.hydrophila
Временные закономерности, а именно, проявление реактивных изменений в органах иммунной системы и воспалительно-дистрофических в печени на 3-и сут после инфицирования, их максимальная выраженность на 7-е сут, и обратное развитие на 14-28-е сут, согласуются с периодами в развитии гуморального иммунного ответа в организме теплокровных по Адельману Д. [2000]. Длительность течения процесса, превышающая обычные сроки элиминации слабых и умеренных патогенов в организме (3-7 сут) [Морозова В.Т., 2003], позволяют предположить, что у A.hydrophila выработался определенный протективный механизм, противодействующий неспецифической иммунной защите хозяина. Эти данные согласуются с результатами исследований других авторов, показавших, что A.hydrophila инактивирует лизоцим, интерферон и комплемент [Бойко А.В., 1998], участвующие в неспецифической иммунной защите.
В соответствии с этой периодизацией, развитие первой стадии гуморального иммунитета длится 3-4 суток после антигенной атаки, вторая стадия длится до 10-14 суток после антигенной стимуляции. Длительность третьей стадии может составлять несколько недель и зависит как от вида антигена, так и от состояния и преобладающего типа иммунитета в организме. Длительность третьего периода объясняет сохранение воспалительных изменений в исследованных нами органах на 28 сут при общей тенденции к нормализации их гистологической структуры. Тем не менее, обнаруженная длительность течения процесса, превышающая обычные сроки элиминации слабых и умеренных патогенов в организме, позволяет предположить, что у A.hydrophila существует определенный механизм защиты от иммунологически обусловленной элиминации возбудителя из организма теплокровного хозяина. Эти данные согласуются с результатами исследований других авторов, показавших что различные штаммы A.hydrophila инактивируют лизоцим, интерферон и комплемент [Бойко А.В., 1998], а также вызывают апоптоз иммунокомпетентных клеток [Shao J. et al., 2004]. Различия в морфологических изменениях органов иммунной системы (тимус, селезенка, регионарный лимфатический узел) связанные с генетически детерминированным типом иммунной системы, согласуются с результатами авторов, исследовавших чувствительность мышей разных линий к ряду возбудителей. [Литвинов В.И. с соавт.,1999; Каркищенко Н.Н., 2004; Железникова Г.Ф., 2005]. Проведенное исследование демонстрирует большую чувствительность мышей линии C57Bl/6 в отношении A.hydrophila по сравнению с мышами Balb/C и белыми беспородными мышами.
На основании полученных в работе экспериментальных данных можно предположить, что инфицирование организма человека A. hydrophila, прежде относимой к группе условно патогенных может приводить к развитию инфекционно-воспалительного процесса, его хронизации и развитию вторичных иммунодефицитных состояний.
В теоретическом аспекте, большой вклад в развитие повреждения органов, обнаруженного в проведенном исследовании, вероятно, принадлежит апоптозу. Обнаруженные нарушения в структуре монослоя клеточной культуры Сасо-2 при инкубации с суспензией A.hydrophila 342-2 и ее супернатанта подтверждают эту точку зрения. По литературным данным, в исследованиях in vitro [Shao et al., 2004] A. hydrophila оказывает повреждающее действие на лимфоциты Carassius auratus при совместном их инкубировании в течение 12 часов, при этом морфологические изменения в лимфоцитах соответствуют апоптозу, вызываемому A. hydrophila и его токсинами у различных клеток, описанному и в других работах [Buckley , 1999; Abrami et al., 1998; Sears et al., 1996]. Показано также, что ряд патогенных бактерий, такие как Salmonella typhimurium, Streptococcus agalactiae, Yersinia enterocolitica, Bordetella pertussis, Shigella flexneri, Listeria monocytogenes and Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus взаимодействуют с иммунной системой хозяина, в том числе, вызывая апоптоз лимфоцитов, макрофагов, моноцитов и нейтрофилов [Fettucciari et al., 2000; Monack et al., 1996, 1997; Ruckdeschel et al., 1997; Zychlinsky et al., 1992; Bocchino et al., 1997; Moss et al., 1999]. Известны также патогены, в первую очередь облигатные внутриклеточные паразиты, такие как хламидии, риккетсии, эрлихии, для которых подавление апоптоза с целью поддержания жизни клетки-хозяина, является механизмом, обеспечивающим выживание и персистирование их в многоклеточном организме [Joshi S.G.at al, 2000; Бухарин О.В. с соавт., 2005]. Механизмы антиапоптотического действия достаточно хорошо изучены для указанных возбудителей, в отличие от A.hydrophila, который лишь с недавнего времени привлек внимание исследователей и требует дальнейшего изучения.
Возможность развития инфекционного процесса повышается при нарушениях иммунной системы различного генеза, что при заражении A.hydrophila показано в работах различных авторов как для млекопитающих и человека [Dumontet S. et al.; 2003 Lin S.N.et al., 1996; Merino S.et al., 1997], так и для рыб [Stevenson R.M.W.,1988]. Генетически детерминированные различия в развитии иммунного ответа также определяют вероятность развития инфекционного заболевания и глубину поражения, вызванного возбудителем во внутренних органах. Известно, что цитокины продуцируемые Th-1-лимфоцитами предохраняют клетки от апоптоза, в то время как цитокины, продуцируемые Th-2-лимфоцитами увеличивают апоптоз. Переключение Тh-1 на Th-2-тип иммунного ответа и изменение продукции соответствующего спектра цитокинов выявляются у больных системной красной волчанкой и при ВИЧ-инфекции [Cheng J et al., 1994].
Различия морфологических изменений в печени мышей разных линий при инфицировании A.hydrophila могут быть также связаны с особенностями самого возбудителя, который может, помимо апоптотических изменений, вызывать нарушение бактерицидной функции макрофагов, и способен противостоять разрушающему действию макрофагальной кислородзависимой системы. Инактивация кислородзависимой бактерицидной системы может осуществляться за счет нескольких механизмов, при этом возможно их сочетание. Так, например. M. tuberculosis способна инактивировать окислительные радикалы и к тому же обладает повышенной резистентностью к их действию [Железникова Г.Ф., 2005]. Аналогичный механизм может быть реализован и A.hydrophila с последующим формированием гранулемы в печени мышей линии C57Bl/6.
В связи с тем, что A.hydrophila является факультативным анаэробом, возможно также уменьшение содержания кислорода в микроокружении за счет выделения метаболитов [Бузолева Л.С. с соавт., 2005], при этом микрогипоксия снижает функциональную активность гепатоцитов и создает благоприятные условия для развития воспаления. Одной из причин более выраженного гранулематозного воспаления у мышей С57Bl/6 может быть более низкий уровень продукции ими перекиси водорода макрофагами. При инфицировании такими возбудителями, как Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Serratia marcesces и Candida у больных с наследственно обусловленной сниженной продукцией гидроперекиси, приводящей к развитию синдрома Чедиака-Шигаса, отмечаются лейкоцитоз крови, поражение лимфатических узлов – увеличение, нагнаивание, неказеозные гранулемы с гигантскими клетками в различных органах, в том числе печени, селезенке и лимфатических узлах. В периоды персистирования инфекции отмечаются лихорадка и лейкоцитоз, в тяжелых случаях развиваются абсцессы печени, остеомиелит и грибковые инфекции [Holmes B. et al., 1966, Дик Дж.,1982]. Поражение печени при бактериальных инфекциях явление широко распространенное и достаточно хорошо изученное, поскольку печень выполняет барьерную и детоксицирующую функцию. Показано, что эндотоксин Грамотрицательных бактерий интенсивно инактивируется в ретикуло-эндотелиальной системе печени. При бактериальных инфекциях на печень обычно действует ряд факторов: интоксикация, гипоксия, лихорадка, метаболические нарушения. Под действием эндотоксина Грам-отрицательных бактерий отмечается снижение тканевого дыхания [Aguilar A.,1997].
Морфологические изменения при бактериальных инфекциях, как правило, имеют единые признаки, определяемые как «неспецифический токсический гепатит». В части случаев при морфологическом исследовании обнаруживается картина жирового гепатоза или внутрипеченочного холестаза, зернистая, баллонная и жировая дистрофия гепатоцитов, фокальные некрозы. В портальных трактах и внутри долек при инфекционном поражении отмечается клеточная инфильтрация мононуклеарами и нейтрофилами [Руденская И.Н., 1980]. Однако все эти изменения встречаются при поражении организма патогенными возбудителями. До последнего времени предполагалось, что A.hydrophila, как условно-патогенный возбудитель, не вызывает глубоких поражений внутренних органов, однако полученные в работе результаты позволяют утверждать, что при наличии генетической предрасположенности макроорганизма даже авирулентный с обычной точки зрения штамм способен вызывать ряд глубоких поражений, которые соответствуют картине инфекционного гепатита. Более того, отсутствие у слабовирулентного штамма выраженной полисахаридной капсулы может быть провоцирующим моментом в формировании гранулем в печени. По литературным данным при экспериментальном заражении мышей Cryptococcus neoformans именно штаммы со слабо выраженной капсулой вызывали развитие гранулематозного воспаления [Mims C.A., 1987]. По мнению большинства авторов, морфологические изменения в органах при инфицировании условно-патогенным возбудителем, в основном, вызваны действием бактериальных токсинов при редком обнаружении самих возбудителей. В случае наших исследований также не удалось выделить возбудителя из печени, при явно выраженной картине дистрофических изменений гепатоцитов, мезенхимально-воспалительной реакции и гранулематозного воспаления.
Вместе с тем, результаты проведенных исследований не во всем соответствуют привычной клинической картине инфекционного процесса, вызванной условно-патогенными возбудителями. Считается, что для такого процесса характерен ряд признаков: отсутствие выраженной органотропности возбудителя, невыраженная или слабо выраженная клиническая специфичность, полиморфизм проявлений, малая выраженность или отсутствие постинфекционного иммунитета. [Носов С.Д., 1982]. Несоответствие полученных нами результатов этим признакам может быть объяснено тем, что само подобное деление микроорганизмов на патогенные, условно-патогенные и непатогенные в настоящий момент устарело. Необходима разработка новых теоретических подходов, на основании которых можно будет создать новую стратегию профилактики и лечения инфекций, вызванных возбудителями с изменяющейся вирулентностью, таких как Aeromonas hydrophila.
