Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
Изменения иммунной системы потомства и их механизмы при воздействии различных факторов в пренатальном периоде 12
Особенности развития тимуса и селезнки мышей 27
Особенности развития кожи мышей 40
Биологические эффекты конканавалина А in vitro и in vivo 43
ГЛАВА 2. Материалы и методы 46
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований
3.1. Морфофункциональные изменения органов иммунной системы 58 самок мышей после однократной стимуляции иммунной системы в ранние сроки беременности
3.2. Морфофункциональные изменения органов иммунной системы потомства самок мышей, перенесших однократную стимуляцию иммунной системы в ранние сроки беременности, в разные периоды по-стнатального онтогенеза
3.2.1. Морфологические изменения тимуса потомства самок мышей,подвергшихся однократному воздействию конканавалина А или активированными клетками на 7-ые сутки беременности, в различные периоды постнатального онтогенеза
3.2.2. Субпопуляционный состав тимоцитов потомства самок мышей подвергшихся однократному воздействию конканавалина А или активированными клетками на 7-ые сутки беременности, в различные периоды постнатального онтогенеза 92
3.2.3. Изменения пролиферативной активности ex tempore клеток тимуса потомства самок мышей, подвергшихся однократному воздействию конканавалина А или активированными клетками на 7-ые сутки беременности, в различные периоды постнатального онтогенеза 100
3.2.4. Морфологические изменения селезнки потомства самок мышей, подвергшихся однократному воздействию конканавалина А или активированными клетками на 7-ые сутки беременности, в различные периоды постнатального онтогенеза
3.2.5. Субпопуляционный состав лимфоцитов селезнки потомства самок мышей, подвергшихся однократному воздействию конканавалина А или активированными клетками на 7-ые сутки беременности, в различные периоды постнатального онтогенеза 119
3.2.6. Изменения пролиферативной активности ex tempore клеток селезнки потомства самок мышей, подвергшихся однократному воздей ствию конканавалина А или активированными клетками на 7-ые сутки беременности, в различные периоды постнатального онтогенеза
3.3. Изменения продукции цитокинов in vitro клетками тимуса и селезнки потомства самок мышей, перенесших однократную стимуляцию иммунной системы в ранние сроки беременности, в разные периоды постнатального онтогенеза в ответ на стимуляцию Т- и В-клеточными митогенами
3.3.1. Изменения продукции цитокинов клетками тимуса мышей, стимулированными конканавалином А и липополисахаридом в различные периоды постнатального онтогенеза 130
3.3.2. Изменения продукции цитокинов клетками селезнки мышей, стимулированными конканавалином А и липополисахаридом 140
3.4. Реагирование иммунной системы потомства самок мышей, пере несших однократную стимуляцию иммунной системы в ранние сроки беременности, при развитии различных патологических процессов
3.4.1. Морфофункциональные изменения органов иммунной системы потомства самок мышей, перенесших однократную стимуляцию иммунной системы в ранние сроки беременности, при развитии системного воспалительного ответа 151
3.4.2. Реагирование иммунной системы потомства самок мышей, перенесших однократную стимуляцию иммунной системы в ранние сроки беременности, при развитии опухолевого процесса
3.5. Морфофункциональные изменения кожи и е производных у по томства самок мышей, перенесших однократную стимуляцию иммунной системы в ранние сроках беременности, в разные периоды постна-тального онтогенеза 173
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 192
Заключение 214
Выводы 220
Список литературы 223-
- Особенности развития кожи мышей
- Субпопуляционный состав тимоцитов потомства самок мышей подвергшихся однократному воздействию конканавалина А или активированными клетками на 7-ые сутки беременности, в различные периоды постнатального онтогенеза
- Изменения продукции цитокинов клетками тимуса мышей, стимулированными конканавалином А и липополисахаридом в различные периоды постнатального онтогенеза
- Морфофункциональные изменения кожи и е производных у по томства самок мышей, перенесших однократную стимуляцию иммунной системы в ранние сроках беременности, в разные периоды постна-тального онтогенеза
Введение к работе
Актуальность темы. В последние десятилетия педиатры и иммунологи отмечают увеличение заболеваемости детей, в том числе и первого года жизни, аллергическими, аутоиммунными, инфекционными и онкологическими заболеваниями, что связано с нарушениями функционирования иммунной системы [Barker D. et al., 2002; Fowden A. et al., 2006; Hodyl N. et al., 2011]. По мнению многих специалистов, изменения функционирования иммунной системы детей могут являться следствием нарушения её развития во внутриутробном периоде, обусловленного действием различных факторов на организм матери во время беременности, таких как заболевания, приём лекарственных препаратов, воздействие экологических и производственных факторов, психоэмоциональный стресс и т.д. [Bellinger D. et al.., 2001; McDade T. et al., 2001; Merlot E. et al.., 2007; McGill J. et al., 2009; Palmer A., 2011]. Развитие иммунной системы организма определяется комплексом эндогенных и экзогенных факторов, действующих на организм во внутриутробном периоде развития, а также после рождения особи. Результаты исследований гистологов, эмбриологов и иммунологов подтверждают, что действие различных факторов во втором и третьем триместрах беременности приводит к изменениям функционального состояния иммунной и эндокринной систем матери и оказывает отрицательное влияние на развивающиеся органы иммунной системы плода [Villamor E. et al., 2002; Warner M. et al., 2002; Huizink A. et al., 2004]. Наименее изученным аспектом этой проблемы является влияния различных факторов на развитие иммунной системы зародыша в ранние сроки беременности, а точнее в течение первых четырёх недель. Это наиболее уязвимый период для действия экзогенных факторов, так как ранний период беременности является критическим для развития особи [Landreth K., 2002; Holsapple M. et al., 2003]. В связи с этим, наибольший интерес и научно-практическую значимость представляет исследование следующих трёх проблем: возможность изменения формирования органов иммунной системы плода вследствие действия стрессорных факторов в ранние сроки беременности до появления зачатков этих органов; существование связи между определёнными реакциями иммунной системы матери и изменениями развития органов иммунной системы плода; длительность этих изменений и способность их к регрессированию. Исследования в этой области необходимы для установления причинно-следственных связей между состоянием иммунной системы матери, её реакциями на действие различных факторов во время беременности и развитием иммунной системы ребёнка. Они позволили бы не только существенно расширить представления об эмбриогенезе и гистогенезе органов иммунной системы и кроветворения, но и выявить причины и механизмы развития тех или иных нарушений иммунной системы, создать научно-обоснованную стратегию профилактики и лечения заболеваний у детей, подвергшихся пренатальному воздействию экзогенных и эндогенных факторов.
Цель исследования: изучение постнатального морфогенеза органов иммунной системы и барьерного органа кожи потомства самок, подвергшихся однократной иммуностимуляции в ранние сроки беременности.
Задачи исследования:
-
Изучить морфологические и функциональные изменения тимуса и селезёнки самок мышей после однократного иммуностимулирующего воздействия, оказанного на 7-ые сутки беременности.
-
Изучить динамику морфологических и функциональных показателей постнатального развития тимуса потомства самок мышей, подвергшихся на 7-ые сутки беременности иммуностимулирующему воздействию, в препубертатном, пубертатном и постпубертатном периодах.
-
Изучить динамику морфологических и функциональных показателей постнатального развития селезёнки потомства самок мышей, подвергшихся на 7-ые сутки беременности иммуностимулирующему воздействию, в препубертатном, пубертатном и постпубертатном периодах.
-
Изучить возрастные изменения секреции цитокинов клетками тимуса и селезёнки при воздействии Т- и В-клеточных митогенов in vitro для оценки функциональной активности клеток иммунной системы.
-
Изучить морфологические и гистофизиологические изменения тимуса и селезёнки при развитии системного воспалительного ответа, обусловленного введением сублетальной дозы эндотоксина грамотрицательных бактерий липополисахарида для выявления особенностей функционирования иммунной системы потомства в препубертатном периоде.
-
Изучить течение опухолевого процесса после введения сингенной культуры клеток меланомы в препубертатном периоде и цитотоксическую активность клеток селезёнки для выявления особенностей реагирования иммунной системы потомства в препубертатном, пубертатном и постпубертатном периодах.
-
Изучить динамику морфологических показателей постнатального развития кожи потомства самок мышей, подвергшихся на 7-ые сутки беременности иммуностимулирующему воздействию, в препубертатном, пубертатном и постпубертатном периодах.
Научная новизна:
Впервые показана возможность влияния активации иммунной системы материнского организма в ранние сроки беременности до начала формирования зачатков органов иммунной системы эмбриона на их постнатальный морфогенез и функционирование.
Впервые показаны проявления и длительность морфологических и функциональных изменений тимуса и селезёнки:
Впервые установлено, что изменения постнатального морфогенеза тимуса заключаются в ускорении развития органа в первые недели жизни за счёт более высокой пролиферации и дифференцировки тимоцитов, с последующим снижением дифференцировки тимоцитов в пубертатном периоде и замедлением инволютивных процессов в постпубертатном периоде, обусловленным сохранением более высокой способности к секреции ИЛ-2, сниженной продукцией антипролиферативных цитокинов ИЛ-10 и ТФР-, усиленной пролиферативной активностью тимоцитов и уменьшением численности тучных клеток в периоде полового созревания.
Впервые установлено, что активация иммунной системы материнского организма изменяет содержание не только Т-клеток, но и минорных фракций лимфоцитов (NK-, NKT-, B- и В1-клеток) тимуса.
Впервые установлено, что особенностью постнатального развития селезёнки потомства самок, подвергшихся иммуностимулирующему воздействию в ранние сроки беременности, является замедление её превращения из органа кроветворения в орган иммунной системы, что обусловливает её функциональную незрелость.
Показано участие популяции тучных клеток в замедлении постнатального морфогенеза селезёнки.
Впервые установлено, что стимуляция иммунной системы материнского организма в ранние сроки беременности вызывает отставание функционального развития иммунной системы потомства, что проявляется замедленной реакцией тимуса и селезёнки при развитии системного воспалительного ответа, меньшей его выраженностью, снижением продукции ФНО- при воздействии липополисахарида и контакте с опухолевыми клетками и снижением противоопухолевого иммунитета.
Впервые показано, что активация иммунной системы материнского организма в ранние сроки беременности вызывает нарушения постнатального развития кожи и ее придатков у потомства, проявляющиеся закладкой меньшего количества волосяных фолликулов и сальных желёз в пренатальном периоде и замедлением формирования дермы в постнатальном периоде.
Впервые описано развитие транзиторной очаговой алопеции у потомства самок мышей, перенесших цитокиновый “всплеск” в ранние сроки беременности, и установлена связь между нарушениями развития дермы и очаговой алопецией.
Научно-практическая значимость:
Экстраполяция полученных данных о замедлении развития иммунной системы и снижении её функциональной активности в постнатальном развитии вследствие активации пролиферативных и секреторных процессов в иммунной системе материнского организма в ранние сроки беременности на человека с учётом более длительного пренатального периода его развития представляет значительный интерес для педиатров при планировании вакцинации детей, исследовании причин нарушения формирования поствакцинального иммунитета и определении тактики лечения инфекционных и воспалительных заболеваний.
Отставание развития кожи и уменьшение численности волосяных фолликулов и сальных желёз вследствие иммуностимулирующего воздействия в ранние сроки беременности может учитываться как фактор риска более тяжёлого течения пиодермий, аллергических и воспалительных заболеваний кожи у детей.
Связь между воздействием на иммунную систему материнского организма в первые недели беременности и иммунной системы потомства указывает на необходимость тщательного сбора анамнестических данных педиатрами, а также внесении в амбулаторные карты детей всех данных о перенесённых матерью заболеваниях и действии других повреждающих факторов во время беременности при постановке на поликлинический учёт и госпитализации детей независимо от их возраста.
Полученные данные об изменениях постнатального морфогенеза органов иммунной системы и кожи потомства вследствие однократного иммуностимулирующего воздействия на материнский организм в ранние сроки беременности могут использоваться в преподавании гистологии, цитологии и эмбриологии в медицинских и биологических высших учебных заведениях, а также при проведении научных исследований.
Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре гистологии, эмбриологии ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов».
Положения, выносимые на защиту:
-
Усиление пролиферации и секреции цитокинов лимфоцитами в ранние сроки беременности до начала формирования зачатков тимуса и селезёнки плода вызывает нарушения постнатального развития центральных и периферических органов иммунной системы потомства в препубертатном, пубертатном и постпубертатном периодах.
-
Изменения постнатального морфогенеза тимуса заключаются в ускорении развития органа в первые недели жизни за счёт более высокой пролиферации и дифференцировки тимоцитов, с последующим снижением процессов дифференцировки в пубертатном периоде. В постпубертатном периоде происходит замедление инволютивных процессов вследствие более высокой способности тимоцитов к секреции фактора роста ИЛ-2, сниженной продукции антипролиферативных цитокинов ИЛ-10 и ТФР-, усиленной пролиферативной активности тимоцитов. Изменения постнатального морфогенеза селезёнки заключаются в замедлении её превращения из органа кроветворения в орган иммунной системы.
-
Морфологические и гистофизиологические изменения тимуса и селезёнки при развитии системного воспалительного ответа характеризуются меньшей выраженностью и более медленным развитием. Недостаточное количество клеток врождённого иммунитета, а затем и приобретённого иммунитета, функциональная незрелость селезёнки в препубертатном и пубертатном периодах обусловливает снижение противоопухолевого иммунитета.
-
Усиление пролиферации и секреции цитокинов лимфоцитами на ранних сроках беременности нарушает пренатальный и постнатальный морфогенез кожи мышей и вызывает развитие транзиторной очаговой алопеции в возрасте 17-ти суток.
Апробация работы: Материалы диссертации доложены и обсуждены на XIX, XX, XXI, XXII Международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии (Ялта, Украина, 2011, 2012, 2013, Ялта, Россия, 2014гг.), XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012г.), научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2012г.), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Морфология в теории и практике» (Чебоксары, 2012г.), VI Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2013г.), VII Международном конгрессе по интегративной антропологии» (Винница, Украина, 2013г.), Международной научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2014г.).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 24 работы, из них 12 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на 258 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 63 рисунками и 12 таблицами. Список литературы включает 356 источников, из них 15 отечественных и 341 зарубежный.
Особенности развития кожи мышей
После гаструляции, поверхность эмбриона представлена одним слоем эктодермы, которая будет формировать нервную трубку и кожный эпителий. Ключевым регулятором дивергенции является Wnt-сигналинг, который блокирует способность эктодермы реагировать на факторы роста фибробластов. При отсутствии сигнала факторов роста фибробластов клетки начинают экс-прессировать костные морфогенетические белки и детерминируются в формирование эпидермиса. И наоборот, развитие нервной системы начинается при отсутствии Wnt-сигнала, когда эктодерма принимает и преобразовывает сигналы, активирующие факторы роста фибробластов, которые затем инги-бируют морфогенетические белки [291]. На 9-12 день внутриутробного развития мыши эпидермис состоит из одного слоя мультипотентных эпителиальных клеток. Он покрыт защитным слоем из плотно соединенных плоскоклеточных энтодермо-подобных клеток, известных как перидерма, которая затем становится многослойной и дифференцируется в эпидермис [196].
Мезенхимальные клетки дорсальной дермы являются производными дермотома, их дальнейшую судьбу определяет Wnt-сигналинг [24]. По мере заселения кожи мезенхимальными клетками возникает их взаимодействие с вышележащим эпителием. Оно индуцирует формирование зачатков волосяных луковиц, появляющихся в виде небольших эпидермальных инвагинаций в подлежащую дерму. Ключевые компоненты этих мезенхимальных сигналов включают факторы роста фибробластов, а затем и факторы, ингибирующие костные морфогенетические белки [75, 140, 219, 244]. В присутствии избытка костных морфогенетических белков или при отсутствии их ингибиторов численность фолликулов уменьшается [46, 209]. Наиболее рано в зачатках начинается экспрессия гена sonic hedgehog (Shh), который играет ключевую роль в консолидации дермальных клеток в дермальный сосочек [176, 225, 292]. Формируясь, дермальный сосочек обеспечивает рост зачатка вглубь дермы и образование из него волосяного фолликула. По мнению многих специалистов, ведущую роль в этом процессе играет Wnt-сигналинг. У мышей с высокой экспрессией -катенина в эпидермисе закладывается избыточное количество волосяных фолликулов [97, 183, 184, 317], а подавление экспрессии -катенина или локальная экспрессия ингибитора Wnt нарушает их формирование [19, 129]. На основании этих данных был сделан вывод, что Wnt-сигналинг является ключевым регулятором раннего развития эпидермиса и дермы, обеспечивающим закладку и морфогенез волосяных фолликулов.
По мере роста эмбрионального волосяного фолликула его активно про-лиферирующий матрикс, контактируя с дермальным сосочком, принимает программу экспрессии генов, отличную от клеток корневого влагалища. Внешнее корневое влагалище поддерживает контакты с базальной мембраной, в то время как внутренние слои начинают дифференцироваться, чтобы сформировать внутреннею корневое влагалище, которая будет служить в качестве канала для растущих волос. Примерно на 18,5 день эмбрионального развития у мышей появляются клетки-предшественники сальных желз, и сердцевина будущего волоса в верхней части волосяного фолликула. Созревание продолжается ещ 7-8 дней, происходит окончательное разделение внутреннего корневого влагалища и внутренней корневой оболочки, в которой развивается три концентрических слоя клеток и стержень волоса. Различные этапы развития волосяного фолликула легко отличить по их морфологическим и биохимическим признакам [211]. Внутри каждого зрелого волосяного фолликула имеются семь концентрических колец из терминально дифференцированных клеток, которые являются производными клеточного матрикса и обладают характерной ультраструктурой.
Нормальный цикл волосяных фолликулов у млекопитающих требует сложных комплексных взаимодействий фолликулярного эпителия с мезен-химальными кожными сосочками в течение трх основных этапов: роста (анагена), регрессии (катагена), покоя (телогена). Молекулярные сигналы и факторы, которые инициируют переход анагена в катоген и телоген до сих пор полностью не изучены. У грызунов синхронизация фолликлярного цикла происходит волнообразно сверху вниз начиная со спины [290], и частота этих циклов уменьшается с возрастом. Хотя этот ритм осуществляется фолликулами самостоятельно, различные внешние и внутренние факторы могут повлиять на цикл роста волос. Цикл волосяных фолликулов у грызунов связан со значительными изменениями в количестве, расположении и активации иммунных клеток, включая макрофаги, клетки Лангерганса, Т-клетки и пе-рифолликулярные тучные клетки. Тучные клетки находятся вблизи кожных сосочков и находятся в тесной связи с фолликулярными стволовыми клетками и мезенхимальной тканью, участвующие в регуляции роста волос [163]. Известно, что тучные клетки выступают в качестве эффекторов в цикле роста волос [145, 195, 236]. Количество тучных клеток снижается в начале анагена и увеличивается к его середине. К концу анагена происходит постепенное снижение их численности. При экспериментальной индукции анагена или после введения циклоспорина, тучные клетки проявляют признаки деграну-ляции. При стресорной нагрузке происходит удлинение телогена с задержкой индукции анагена, что связано с дегрануляцией тучных клеток. Стимуляция дегрануляции может индуцировать анаген в фолликулах, находящихся в те-логене, а антагонисты продуктов тучных клеток могут ингибировать развитие анагена. Нейропептид Р увеличивает дегрануляцию тучных клеток и ускоряет регрессию волосяного фолликула в эксперименте при аутоиммунной алопеции [281]. Увеличение числа активированных тучных клеток были зарегистрированы и при мужском облысении [342, 346]. Внутрибрюшинное введение моноклональных антител АСК-2 для истощения тучных клеток кожи у ИЛ-10-дефицитных мышей, которые генетически предрасположены к алопеции, предохраняло волосы от выпадения [319]. Врожднные дефекты волосяных фолликулов редки и обычно вызываются мутациями в генах, кодирующих кератины и другие структурные белки [206, 237, 296]. Приобре-тнные алопеции могут иметь как воспалительную, так и невоспалительную этиологию. Воспалительная алопеция может быть результатом бактериальной и грибковой инфекции, внешних паразитов, аутоиммунных заболеваний, травм или воздействия токсинов (например, ртуть, таллий, йод). Невосполи-тельные заболевания, которые ведут к выпадению волос, включают дефицит питательных веществ, эндокринные нарушения, роды, анемия и прим цито-статических препаратов [206]. Этиология алопеции отражает состояние здоровья и может обеспечить понимание механизмов облысения.
Субпопуляционный состав тимоцитов потомства самок мышей подвергшихся однократному воздействию конканавалина А или активированными клетками на 7-ые сутки беременности, в различные периоды постнатального онтогенеза
На 17-ые сутки постнатального развития у мышей контрольной группы около 30% клеток экспрессировали молекулу CD3, ассоциированную с Т-клеточным рецептором (табл. 7). Среди СD3-позитивных клеток 40% составляли СD4+СD8+ -клетки. Клетки, не экспрессирующие ни СD4, ни СD8, среди СD3+-клеток составляли около 2%. Количество дифференцированных Т-хелперов (СD3+СD4+СD8-) было сопоставимо с количеством дубльпози-тивных СD4+СD8+ клеток. Доля цитотоксических Т-клеток (СD3+СD4-СD8+) составляла одну десятую СD3+ клеток (табл. 7).
Количество NK-клеток в тимусе было невелико и составляло около 1% от общего количества тимоцитов. CD3+NK1.1+GcCD1d+ -NKТ-клеток также было менее 1% (табл. 4).
Среди тимоцитов наименьшей по численности популяций являлись В-клетки (табл. 7). Половину тимических клеток составляли ассоциированные с продукцией аутоантител СD19+СD5+ -В1-клетки (табл. 7). Среди В-клеток, так называемых активированных, несущих на поверхности FcRII (CD23+), клеток было около двух третей, причм В1-клетки в 100% случаев экспрессировали этот рецептор (табл. 7).
– потомства самок мышей, подвергшихся на 7-ые сутки беременности однократному воздействию Кон А
Среди тимоцитов потомства самок мышей, подвергшихся на 7-ые сутки беременности однократному воздействию Кон А, количество СD3-позитивных клеток было статистически значимо выше, чем в контрольной группе (табл. 7). Доля дубльпозитивных клеток была меньше, а дубльнега 93 тивных клеток – больше, чем в контрольной группе. Доли дифференцированных Т-хелперов и Т-цитотоксических лимфоцитов не отличались от значений контрольной группы (табл. 7).
Количество NK-клеток соответствовало значениям контрольной группы, а количество NKT-клеток было почти в два с половиной раза меньше (табл. 7).
Отмечали увеличение доли В-клеток в тимусе (табл. 7). Приблизительно треть популяции В-клеток составляли В1-клетки. Доля В-клеток, экспрес-сирующих FcRII, соответствовала значениям контрольной группы. Содержание в тимусе В1-клеток, экспрессирующих FcRII, было статистически значимо ниже (табл. 7).
– потомства самок мышей, которым на 7-ые сутки беременности вводили активированные клетки селезнки
Количество СD3-позитивных клеток в тимусе потомства самок мышей, которые на 7-ые сутки беременности вводили активированные клетки селе-знки, было больше, чем в контрольной, но меньше, чем в группе сравнения (табл. 7). Количество дубльпозитивных СD4+СD8+ -клеток было статистически значимо меньше, чем в контрольной группе. Доля дубльнегативных СD4-СD8- клеток была больше, чем в контрольной группе, но меньше, чем в группе сравнения. Доля Т-хелперов не отличалась от значений контрольной группы, а доля Т-цитотоксических СD3+СD4-СD8+ -лимфоцитов превышала значения контрольной группы (табл. 7).
Доля NK- и NKT-клеток была статистически значимо ниже, чем в контрольной группе (табл. 4).
Доля В-клеток в тимусе не отличалась от контрольной группы, но была статистически значимо ниже, чем в группе сравнения (табл. 7). Доля В1-клеток превышала значения и контрольной и группы сравнения. В1-клетки составляли абсолютное большинство популяции В-клеток, а половина из них экспрессировала FcRII. В целом экспрессия рецептора FcRII на В-клетках не отличалась от контрольной и группы сравнения (табл. 7). Табл. 7. Изменения субпопуляционного состава лимфоцитов тимуса, его возрастной динамики у потомства самок мышей, подвергшихся однократному иммуностимулирующему воздействию в ранние сроки беременности (М±т).
По сравнению с предыдущим сроком исследования отмечали полуто-ракратное увеличение экспрессии молекулы CD3 тимоцитами (табл. 7). Доля CD4+CD8+ закономерно уменьшена в полтора раза, а дубльнегативных CD4" CD8" не изменена. Выявляли статистически значимое увеличение доли Т-цитотоксических С04СЮ8+-лимфоцитов (табл. 7).
Наблюдали статистически значимое уменьшение процентного содержания NK- и NKT-клеток более чем в два раза по сравнению с предыдущим сроком исследования (табл. 7).
Доля В-клеток увеличена по сравнению с предыдущим сроком исследования (табл. 7). Содержание в тимусе В1-клеток не изменено. Экспрессия рецептора FcyRII на В-клетках увеличена, но эти различия не достигали статистической значимости, в то время как у В1-клеток она снижена (табл. 7).
- потомства самок мышей, подвергшихся на 7-ые сутки беременности од нократному воздействию Кон А
По сравнению с предыдущим сроком исследования содержание в тимусе лимфоцитов, экспрессирующих молекулу CD3, не изменено и было ниже, чем в контрольной группе (табл. 7). Доля CD4+CD8+ оставалась неизменной, а доля дубльнегативных клеток была уменьшена по сравнению с преды 96 дущим сроком исследования, но была больше, чем в контрольной группе. Количество Т-хелперов не изменено и соответствовало значениям контрольной группы. Доля Т-цитотоксических лимфоцитов увеличена, но не достигала значений контрольной группы (табл. 7).
В отличие от контрольной группы наблюдали увеличение доли NK-клеток. Содержание NKT-клеток уменьшено и было ниже значений контрольной группы как и в предыдущем сроке исследования (табл. 7).
Содержание В-клеток уменьшено по сравнению с предыдущим сроком исследования и с контрольной группой. Содержание В1-клеток уменьшено, но статистически значимо не отличалось от значений контрольной группы. Экспрессия рецептора FcRII на В-клетках (СD23) не изменена и не имела отличий от значений контрольной группы, а на В1-клетках была меньше, чем в контрольной группе (табл. 7).
Изменения продукции цитокинов клетками тимуса мышей, стимулированными конканавалином А и липополисахаридом в различные периоды постнатального онтогенеза
У нестимулированных клеток тимуса мышей контрольной группы выявляли высокую спонтанную секрецию ИЛ-2 (рис. 26). В среде, содержащей Кон А, концентрация ИЛ-2 не отличалась от значений спонтанной секреции цитокина (рис. 26). В среде, содержащей ЛПС, концентрация ИЛ-2 была наименьшей (рис. 26).
У нестимулированных клеток тимуса мышей опытной группы спонтанная секреция ИЛ-2 отсутствовала (рис. 26). В среде, содержащей Кон А, концентрация ИЛ-2 почти в десять раз превышала значения контрольной группы. В среде, содержащей ЛПС, концентрация ИЛ-2 была очень низкой и не отличалась от значений контрольной группы (рис. 26).
Продукция ИЛ-10 нестимулированными клетками тимуса мышей контрольной группы была очень низкой (рис. 26). В средах, содержащих Кон А и ЛПС, увеличение продукции ИЛ-10 было незначительным (рис. 26).
Секреция ИЛ-10 нестимулированными клетками тимуса мышей опытной группы была аналогичной, а после воздействия митогенов увеличение продукции ИЛ-10 статистически значимо превышало значения контрольной группы (рис. 26).
Содержание ФНО- в культуральной среде нестимулированных клеток тимуса мышей контрольной группы было незначительным (рис. 26). В среде, содержащей Кон А, концентрация ФНО- не увеличивалась (рис. 26). Стимуляция ЛПС вызывала шестикратное увеличение концентрации цитокина в культуральной среде (рис. 26).
Спонтанная продукция ФНО- клетками тимуса мышей опытной группы статистически значимо превышала значения контрольной группы (рис. 26). Стимуляция Кон А и ЛПС приводила к одинаковому трхкратному увеличению продукции ФНО-, что значительно превышало соответствующие значения контрольной группы (рис. 26).
Спонтанная секреция ТФР- клетками тимуса мышей контрольной группы отсутствовала (рис. 27). Индукция секреции цитокина Кон А вызывала увеличение его концентрации в среде (рис. 27). Стимуляция ЛПС приводила к значительному 17-кратному увеличению продукции цитокина по сравнению со стимуляцией Кон А (рис. 27).
Спонтанная секреция ТФР- клетками тимуса мышей опытной группы была высокой, аналогичной секреции цитокина в контрольной группе при воздействии ЛПС (рис. 27). Стимуляция Кон А или ЛПС вызывала одинаковое снижение продукции ТФР-. Таким образом, концентрация ТФР- в среде, содержащей Кон А, в восемь раз превышала значения контрольной группы, а в среде, содержащей ЛПС, была более, чем в два раза ниже, чем в контрольной группе (рис. 27).
Таким образом, клетки тимуса 17-ти дневных мышей контрольной группы незначительно увеличивали секрецию ростового фактора ИЛ-2 после стимуляции Т- и В- клеточными митогенами, так как спонтанно синтезировали ИЛ-2. Спонтанная секреция противовоспалительных антипролифера-тивных цитокинов ИЛ-10 и ТФР- была крайне низкой. Воздействие Кон А не увеличивало их продукцию, а воздействие ЛПС стимулировало продукцию только ТФР-. Воздействие Кон А аналогично не увеличивало продукцию провоспалительного цитокина ФНО-, в то время как воздействие ЛПС стимулировало секрецию данного цитокина.
Клетки тимуса мышей опытной группы вырабатывали большее количество ИЛ-2 при воздействии Кон А, так как его спонтанная секреция была крайне низкой. Секреция противовоспалительных антипролиферативных ци-токинов ИЛ-10 и ТФР- в целом была выше. Воздействие митогенов приводило к стимуляции продукции ИЛ-10 и ингибированию продукции ТФР-.
В отоличие от предыдущего срока исследования спонтанная секреция ИЛ-2 клетками тимуса мышей контрольной группы отсутствовала (рис. 28). Продукция ИЛ-2 клетками тимуса в среде, содержащей Кон А, возросла по сравнению с предыдущим сроком исследования, а в среде, содержащей ЛПС, отсутствовала (рис. 28, 32).
Спонтанная секреция ИЛ-2 клетками тимуса мышей опытной группы отсутствовала, как и в предыдущем сроке исследования (рис. 28). Стимуляция клеток тимуса Кон А вызывала увеличение продукции ИЛ-2 аналогичное значениям предшествующего срока исследования, но превышавшее значения контрольной группы более, чем в три раза (рис. 28, 32). Увеличения продукции ИЛ-2 под влиянием ЛПС не наблюдали, как и в предыдущем сроке исследования (рис. 28, 32).
Изменений как спонтанной, так и стимулированной Кон А и ЛПС продукции ИЛ-10 клетками тимуса мышей контрольной группы по сравнению с предыдущим сроком исследования не выявлено (рис. 28, 32).
Спонтанная продукция ИЛ-10 клетками тимуса мышей опытной группы не отличалась от значений контрольной группы и предыдущего срока исследования (рис. 28, 32). По сравнению с предыдущим сроком исследования увеличения продукции ИЛ-10 при стимуляции Кон А не наблюдали и его концентрация соответствовала значениям контрольной группы (рис. 28, 32). Отмечали двукратное уменьшение продукции ИЛ-10 при стимуляции ЛПС по сравнению с предыдущим сроком исследования, но концентрация ИЛ-10 в среде, содержащей ЛПС, была больше значений контрольной группы (рис. 28, 32).
Морфофункциональные изменения кожи и е производных у по томства самок мышей, перенесших однократную стимуляцию иммунной системы в ранние сроках беременности, в разные периоды постна-тального онтогенеза
Проведено исследование морфофункционального состояния кожи и е производных потомства мужского пола интактных самок и самок, которым вводили неактивированные клетки селезнки (контрольная группа) и самок, которым на 7-ые сутки беременности вводили Кон А или активированные клетки селезнки (опытная группа), на 17-ые сутки постнатального развития, в возрасте 1,5 и 2,5 месяцев.
На 17-ый день постнатального развития у потомства интактных самок и самок, которым вводили неактивированные клетки селезнки, был полностью сформирован шерстный покров. В гистологических препаратах кожи спины различали три слоя: эпидермис, дерма, гиподерма. Эпидермис был относительно тонок. Мальпигиев слой состоял из 1-2 слов клеток. Кератино-циты имели ядра овальной формы, ориентированные как горизонтально, так вертикально и умеренно базофильную цитоплазму. Встречали единичные делящиеся кератиноциты. Под базальным слоем эпидермиса находилась базальная мембрана, характеризующейся резко положительной ШИК-реакцией (рис. 53а). Дерма была представлена волокнами с оксифильной окраской и межклеточным матриксом, характеризующимся слабо положительной ШИК-реакцией. Границы между сетчатым и сосочковым слоями были плохо различимы (рис. 53а).
В дерме находили большое количество волосяных фолликулов. Волосяные фолликулы были окружены дермальными корневыми влагалищами, отличающихся от окружающих структур выраженной ШИК-положительной реакцией. Большинство волосяных фолликулов содержало пуховые волосы. Также в дерме встречали большое количество сальных желз. Приблизительно треть волосяных фолликулов имела связь с выводными протоками сальных желз (табл. 12).
В дерме выявляли большое количество клеток: фибробластов и фиброцитов с ШИК-положительной цитоплазмой, макрофагов, лимфоцитов, тучных клеток, единичных нейтрофилов (рис. 53а). Тучные клетки располагались в различных слоях дермы и гиподермы. Популяция тучных клеток была представлена в основном тмными клетками, с высоким содержанием секреторного материала (рис. 54а). Около половины тучных клеток выделяло секреторный материал, однако, выраженность дегрануляционных процессов была небольшой (табл. 13). Клетки с низким содержанием секреторного материала локализовались преимущественно субэпидермально. Гиподерма была слабо развита. Отмечалось неравномерное кровенаполнение сосудов. – потомства самок, которым на 7-ые сутки беременности вводили Кон А или активированные клетки селезнки, с 17-ых суток постнатального развития до 1,5 месяцев
На 17 день постнатального развития у потомства самок, которым на 7-ые сутки беременности вводили Кон А или активированные клетки селезн-ки, наблюдали появление очага выпадения волос на спине. Выявляли рас-шатанность стержней волос не только вокруг очага алопеции, но и на всм волосяном покрове спины. Строение волосяных луковиц указывало на нахождение большинства волос в стадии телогена.
При гистологическом исследовании участка кожи спины, находящегося рядом с очагом выпадения волос и сохранившем шерстный покров, выявляли следующие отличия. Мальпигиев слой был утолщн и состоял из двух-трх слов кератиноцитов с более оксифильной цитоплазмой (табл. 12). Наблюдали очаговое снижение интенсивности ШИК-реакции в базальной мембране, размытость базальной мембраны. Толщина дермы практически не отличалась от значений контрольной группы (табл. 12). Отмечали уменьшение количества аморфоного вещества межклеточного матрикса по всей толщине дермы, благодаря чему она имела рыхлое сетчатое строение (рис. 53б).
Количество волосяных фолликулов в мм2 среза дермы было статистически значимо меньше, чем в контрольной группе (табл. 12). Основная часть волосяных фолликулов содержала терминальные волосы, количество пуховых волос было уменьшено. Некоторые волосяные фолликулы были деформированы, имели кистообразный вид и содержали неправильно ориентированные, изогнутые волосы с неравномерным распределением пигмента в стержне волоса (рис. 53б). У многих волосяных фолликулов дермальное корневое влагалище характеризовалось слабо положительной ШИК-реакцией. Аналогично отмечали уменьшение количества сальных желз. Связь сальных желз с волосяными фолликулами не была нарушена.
Общее количество клеток в дерме было меньше (табл. 12, рис. 53б). Также была меньшей численность выявляемых тучных клеток (табл. 13). Среди них большинство отличалось высокой насыщенностью секреторным материалом, но количество клеток с низким содержанием секреторных гранул увеличено. Они располагались в основном субэпидермально. В целом, интенсивность выделения секреторных гранул за пределы клеток была ниже, чем в контрольной группе. Изменялась и локализация тучных клеток в дерме и гиподерме. Многие тучные клетки располагались вдоль волосяных фолликулов (рис. 54б). Изменений сосудистого русла не наблюдалось.
При макроскопическом исследовании участка кожи с утраченным шерстным покровом отмечали сохранение единичных терминальных волос и отсутствие пуховых волос. Кожа имела бледно-розовую окраску. При гистологическом исследовании кожа имела те же особенности строения эпидермиса и дермы, что и в пограничной зоне (табл. 12). Количество волосяных фолликулов и сальных желз в мм2 также было меньше, чем в контрольной группе. Волосяные фолликулы содержали в основном терминальные волосы. Чаще встречались деформированные волосяные фолликулы, содержащие изло-манные волосы с нарушенной структурой и дезорганизованным расположе 176 нием пигментных включений (рис. 53в). Общее количество клеток в дерме было меньше, чем в контрольной группе. Главным отличием клеточной популяции дермы было очень высокое содержание нейтрофилов, которое не наблюдали ни в пограничной зоне, ни в контрольной группе (рис. 53в). Количество тучных клеток не отличалось от значений в контрольной группе. Их насыщенность секреторным материалом была выше, чем в пограничной зоне, а интенсивность дегрануляции ниже (табл. 13). Сохранялась связь тучных клеток с волосяными фолликулами.
