Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Представления о сердечно-сосудистом центре продолговатого мозга . 14
1.2. Значение NO, CO и H2S в регуляции гемодинамики . 18
1.2.1. Свойства и физиологическая роль оксида азота в организме 18
1.2.2. Механизмы медиаторного действия оксида азота в ЦНС . 23
1.2.3. Распределение NO-нейронов в центральной нервной системе . 25
1.2.4. Оксид азота и кровеносные сосуды . 27
1.2.5. Свойства монооксида углерода и его физиологическая роль в организме 31
1.2.6. Монооксид углерода в нервной системе 34
1.2.7. Сосудорасширяющее действие монооксида углерода 37
1.2.8. Сероводород и его роль в организме . 38
1.2.9. Сероводород и нервная система 40
1.2.10. Сероводород и сосуды . 41
1.3. Роль газообразных посредников в нарушении центральных механизмов регуляции гемодинамики при артериальной гипертензии 44
1.3.1. Газотрансмиттеры в центральной нервной системе и артериальная гипертензия 44
1.3.2. Газотрансмиттеры в стенке сосудов при артериальной гипертензии . 47
Глава 2. Материалы и методы исследования 51
2.1. Характеристика исследованного материала 51
2.2. Гистологические методы исследования 56
2.3. Гистохимические методы исследования 57
2.4. Иммуногистохимические методы исследования 60
2.5. Электронномикроскопические методы исследования . 63
2.6. Воспроизводство модели реноваскулярной гипертензии . 64
2.7. Технические приемы, использованные в работе 66
2.8. Биомикроскопия 70
2.9. Морфометрические исследования 72
2.10. Количественная оценка результатов гисто - и иммуногистохимической реакции с помощью «пиксельного метода» 73
2.11. Статистические методы исследования 78
Глава 3. Газотрансмиттеры в ядрах продолговатого мозга и моста 79
3.1. NO-продуцирующие (NADPH-d- и nNOS-позитивные) нейроны 79
3.2. СО-продуцирующие (НО-2-иммунопозитивные) нейроны 94
3.3. H2S-продуцирующие (СВS-иммунопозитивные) нейроны 99
Глава 4. Топохимия классических медиаторных систем в струкутрных образованиях продолговатого мозга и моста. 106
4.1. Холинергические нейроны 106
4.2. Норадреналинергические нейроны 115
4.3. Серотонинергические нейроны 118
Глава 5. Газообразные посредники в стенке артерий головного мозга 126
5.1. Оксид азота в стенке артерий головного мозга 126
5.2. Гемоксигеназа-2 (НО-2) в стенке мозговых сосудов 133
5.3. Иммунолокализация цистатионин –синтазы (СВS) и цистатионин – лиазы (CSE) в стенке церебральных артерий 134
5.4. Нейрогенные факторы в регуляции кровотока 138
5.4.1. Оксид азота в афферентной иннервации сосудов головного мозга139
5.4.2. Газообразные посредники в эфферентной иннервации сосудов 144
Глава 6. Газообразные посредники нервно-сосудистых образований мозга при артериальной гипертензии 151
6.1. Преобразования газотрансмиттерных нейронов в ядрах продолговатого мозга и моста при артериальной гипертензии 151
6.1.1. NO-продуцирующие нейроны 151
6.1.2. НО-2-позитивные нейроны 165
6.1.3. CBS-позитивные нейроны 170
6.2. Морфофункциональные изменения артерий мозга при артериальной гипертензии 176
6.2.1. Биомикроскопия сосудистого русла мягкой оболочки мозга крыс при развитии реноваскулярной гипертензии 176
6.2.2. Ультраструктура внутренней оболочки артерий мягкой мозговой оболочки человека при артериальной гипертензии. 178
6.3. Преобразования газообразных посредников в стенке пиальных и внутримозговых артерий при развитии РВГ у крыс 185
6.3.1. NO-продуцирующие ферменты в стенке мозговых артерий 186
6.3.2. НО-2-позитивные структуры в стенке мозговых артерий 192
6.3.3. CSE-позитивные структуры в стенке мозговых артерий 196
6.4. Афферентная иннервация пиальных и внутримозговых сосудов при артериальной гипертензии 199
6.5. Эфферентная иннервация мягкой оболочки головного мозга человека при артериальной гипертензии 204
Заключение 210
Список сокращений 239
Список цитируемой литературы 241
- Монооксид углерода в нервной системе
- Технические приемы, использованные в работе
- Норадреналинергические нейроны
- Оксид азота в афферентной иннервации сосудов головного мозга
Введение к работе
Актуальность исследования. Открытие нового класса биологически активных веществ, так называемых газообразных посредников, к которым в настоящее время относят оксид азота (NO), монооксид углерода (CO), и сероводород (H2S), заметно изменило представление о химических свойствах и механизме действия нейротрансмиттеров. Газообразные посредники осуществляют, как межклеточную, так и внутриклеточную регуляцию разнообразных физиологических процессов (Samhan-Ariasetal., 2009; Olson, Donald, 2009). Для всех газов установлены не только субстраты синтеза, но и специфические ферменты, участвующие в продукции этих веществ, что позволило показать их наличие во многих структурных образованиях организма (Wang, 2004; Gadalla, Snayder, 2010).
Однако о нейрогенной функции этих веществ данных совсем немного. Особенно мало таких сведений в отношении CO и H2S, функциональные свойства и механизмы действия которых в нервной системе, до сих пор вызывают противоречивые оценки (Boehning, Snyder, 2003; Ishikawa et al., 2005; Jones et al., 2010). Современные представления о роли газотрансмиттеров в центральных механизмах регуляции гемодинамики базируются преимущественно на результатах физиологических, биохимических и фармакологических исследований (Wang, 2004; Ishigami et al., 2009; Jones et al., 2010). Между тем для изучения топохимии и количественного распределения нейронов в многочисленных, зачастую небольших по объему и плотно расположенных ядрах головного мозга, приведенные выше методы мало подходят. Новые данные, которые могли бы детализировать существующие представления по этой проблеме, связаны с внедрением в практику научных исследований гистохимических и иммуногистохимических методов изучения газотрансмиттеров. Они лишены недостатков, свойственных указанным выше методам, а при количественной обработке, позволяют достаточно точно определить не только долю энзимпозитивных нейронов в каждом ядре, но и интенсивность реакции, а, следовательно, и относительное содержание вещества в ядре или во всех ядрах исследуемой области мозга (Kuo et al., 1997; Старцева и др., 2012).
Считается, что в центральной нервной системе газотрансмиттеры играют решающую роль, по крайней мере, в двух важнейших процессах: во-первых, в межнейронных коммуникациях в качестве сигнальных трансдукторов, что позволяет им принимать непосредственное участие в организации работы любого нервного центра; во-вторых, в регуляции церебрального кровообращения, где этим газам, возможно, принадлежит ведущая роль не только в функционировании сосудов мозга, но и в центральных механизмах управления гемодинамикой (Черток и др., 2008–2013; Linden et al., 2008; Olson, 2008; Mustafa et al., 2009).
В центральных механизмах регуляции кровообращения особенно важное значение придается бульбарному отделу сердечно-сосудистого центра, морфологическим воплощением которого является относительно небольшой участок ромбовидного мозга, лежащий каудальнее нижнего четверохолмия (Хаютин, 1982; Лебедев, 1986; Anderson, 1989). Собрано огромное количест-
во доказательств решающей роли этого участка мозга в регуляции гемодинамики. Однако на фоне многочисленных функциональных исследований сердечно-сосудистого центра, материалы об его структурной организации выглядят особенно скудными. Ограниченность и противоречивость данных о топохимии и взаимоотношениях газотрансмиттерных систем между собой и классическими нейромедиаторами в ядрах продолговатого мозга и моста, вовлеченных в регуляцию гемодинамики, ограничивают возможности для формирования объективных представлений о работе этого нервного центра. Поэтому основное внимание в работе мы уделили особенностям количественного распределения NO-, СО- и Н2S-позитивных нейронов в различных ядрах бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра.
Понятно, что эффективная работа мозга невозможна без уравновешенной и строго сбалансированной системы кровоснабжения. В этом отношении церебральная гемодинамика занимает особое положение в сосудистой системе: с одной стороны, она представляет собой мишень для управляющих воздействий со стороны нейронов сердечно-сосудистого центра, с другой, обеспечивая адекватное кровоснабжение нервного центра, является одним из механизмов управления его функциями. После открытия вазомоторного действия газотрансмиттеров появились веские основания полагать, что эти вещества играют ведущую роль в обеспечении взаимодействия сосудов и нейронов в процессе управления гемодинамикой. Однако при построении этой гипотезы не был установлен морфологический субстрат для реализации таких взаимодействий: мы не встретили материалов по комплексному изучению пространственной организации ферментов, участвующих в образовании газообразных посредников в нервно-сосудистых образованиях сердечнососудистого центра. Не имеют морфологического обоснования и промежуточные процессы, проходящие при участии газотрансмиттеров в нервном центре, которые, в конечном счете, обеспечивают трансформацию сенсорной информации в соответствующие нервные и сосудистые реакции.
Цель исследования. Установить закономерности организации, распределения и пространственных отношений сигналтрансдукторных систем, продуцирующих газотрансмиттеры (оксид азота, монооксид углерода и сероводород), в нервно-сосудистых образованиях бульбарного отдела сердечнососудистого центра.
Задачи исследования:
-
Провести качественную и количественную оценку NO-, H2S- и СО-продуцирующих нейронов в ядрах различной функциональной принадлежности в продолговатом мозге и мосте у крысы и человека.
-
В ядрах продолговатого мозга и моста, вовлеченных в регуляцию гемодинамики, изучить организацию и пространственные отношения газотрансмиттерных нейронов между собой и нейронами, включающими классические нейромедиаторы (ацетилхолин, норадреналин, серотонин).
-
Используя гистохимические и иммуногистохимические методы, изучить особенности организации и распределения ферментных систем, уча-
ствующих в образовании газообразных посредников, в стенке пиальных и внутримозговых артерий разного диаметра.
-
Установить наличие и локализацию медиаторноспецифических систем в афферентных и эфферентных нервных волокнах сосудов продолговатого мозга.
-
Исследовать динамические преобразования газотрансмиттерных систем в вазомоторных ядрах, пиальных и внутримозговых артериях разного калибра в процессе развития реноваскулярной гипертензии у крысы и артериальной гипертензии у человека.
-
На основании собственных материалов и литературных данных определить роль и место газообразных посредников в механизмах регуляции мозговой гемодинамики.
Научная новизна. В работе представлены оригинальные материалы по комплексному изучению локализации газообразных посредников в нервно-сосудистых образованиях бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра.
Проведена качественная и количественная характеристика NO-, СО- и Н2S-продуцирующих нейронов, в вазомоторных ядрах у крысы и человека, изучены пространственные отношения этих нейронов между собой, а также с нейронами, участвующими в трансмиссии ацетилхолина, норадреналина, серотонина. На основании полученных данных, выдвинута гипотеза, согласно которой регулирующее влияние газообразных посредников на целевые объекты, удаленные от места синтеза газов, объясняются способностью сигнальных молекул оказывать модулирующее воздействие на нейроны, продуцирующие классические медиаторы нервного импульса – ацетилхолин, но-радреналин, серотонин.
Установлено, что распределение ферментов, участвующих в синтезе газообразных посредников в стенке пиальных и внутримозговых артерий связано с калибром сосудов и их локализацией относительно поверхности мозга. Представлены морфологические доказательства участия нитроксидер-гической системы в афферентной и эфферентной иннервации сосудов продолговатого мозга.
Приведены материалы, свидетельствующие об активной перестройке ферментных систем, участвующих в продукции NO, СО и H2S, в процессе ремоделирования нервно-сосудистых образований мозга при развитии рено-васкулярной гипертензии у крысы и артериальной гипертензии у человека.
Полученные данные послужили основой для формирования принципиально новой концепции, предполагающей участие системы газотрансмиттеров в организации работы бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра, в котором артериальные сосуды, с одной стороны, представляют собой мишень для регулирующих воздействий NO-, СО- и H2S-продуцирующих нейронов, с другой, обеспечивая адекватное кровоснабжение нервного центра, являются одним из механизмов его управляющих воздействий.
Теоретическое и практическое значение работы. Приведенные сведения о закономерностях распределения NO, CO и H2S в нервно-
сосудистых образованиях мозга являются частью фундаментальных исследований в области нейробиологии. Полученные результаты могут служить теоретической базой для понимания роли газотрансмиттерной системы в центральных и местных механизмах регуляции мозговой гемодинамики при обычных условиях жизнедеятельности организма и сосудистых заболеваниях, наметить потенциальные пути для разработки новых препаратов и лечения нарушений мозговой гемодинамики. Результаты исследования могут быть использованы при проведении занятий на кафедрах гистологии, нормальной и патологической анатомии, нормальной и патологической физиологии, неврологии.
Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности результатов проведенного исследования определяется соответствием его дизайна критериям доказательной медицины, анализом репрезентативных выборок, достаточным объемом наблюдений и использованием современных разноплановых методов исследования. Примененные статистические методы адекватны поставленным задачам, а сформулированные положения, выводы и практические рекомендации аргументированы и логически вытекают из анализа полученных данных.
Основные результаты диссертации были представлены: на Международной научной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Бангкок, Паттайа (Таиланд, 2007)); на IX-м Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Бухара, Республика Узбекистан, 2008); на Международной научной конференции «Фундаментальные исследования» (Доминиканская республика, 2008); на научной конференции посвященной 100-летию кафедры медицинской биологии СПб ГМА им. И.И. Мечникова «Вопросы морфологии XXI века» (С.-Петербург, 2008); на III-й международной научной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Тайланд-Камбоджа, 2008); на Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации» (Оренбург, 2008); на научно-практической конференции «Актуальные проблемы биомедицинской антропологии и морфологии» (Красноярск, 2009); на Однораловских морфологических чтениях (Воронеж, 2009, 2010); на научно-практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии» (Волгоград, 2010); на Х-м Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010); на заочной конференции «Должановские чтения» (Воронеж, 2011); на VII-й международной научно-практической конференции «Образование и наука XXI века» (София, Болгария, 2011); на IV-й научной конференции «Микроциркуляция в клинической практике» (Москва, 2012); на V-й Коми республиканской конференции неврологов Северо-западного Федерального округа с международным участием «Актуальные проблемы неврологии» (Сыктывкар, 2012); на Международной заочной научно-практической конференции «Наука и образование в XXI веке» (Тамбов,
2013); на Международной научной конференции «Наука и образование в современной России», (Москва, 2013).
По теме диссертационного исследования опубликованы монография и 58 статей, в которых нашли отражение теоретические положения и результаты работы.
Положения, выносимые на защиту:
-
Ядра бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра характеризуются морфологической гетерогенностью газотрансмиттерных систем (NO-, H2S-, СО), отражающей их молекулярные и функциональные особенности.
-
На разных уровнях организации вазомоторных ядер имеются структурные предпосылки для обеспечения взаимодействия NO-, CO- и H2S-продуцирующих нейронов как между собой, так и с клетками, содержащими классические нейромедиаторы.
-
Между ядрами, между ядрами и проводящими путями в продолговатом мозге и мосте выявляются небольшие по величине иммунопозитивные нейроны, обладающие интенсивной реакцией на nNOS, СBS и НО-2. Стратегическое положение в бульбарном отделе сердечно-сосудистого центра, способность аккумулировать газотрансмиттеры и классические медиаторы нервного импульса, формировать локальные цепи интернейронов между ядрами различной функциональной принадлежности, предполагает активное участие этих клеток в центральной регуляции гемодинамики.
-
В стенке большинства пиальных и внутримозговых артерий у человека и крысы выявляются еNOS, CSE, СBS и НО-2, особенности распределения которых тесно связаны с диаметром сосудов (порядком ветвления) и положением относительно поверхности мозга.
5. Развитие РВГ у крыс и АГ у человека сопровождается активной
перестройкой ферментных систем, участвующих в продукции NO, СО и H2S
в стенке артерий головного мозга и ядрах бульбарного отдела сердечно
сосудистого центра. При этом изменения топохимии и количественного рас
пределения ферментов в артериальной сети мягкой оболочки продолговатого
мозга опережают изменения в большинстве ядер бульбарного отдела сердеч
но-сосудистого центра.
Публикации результатов работы. По теме диссертации опубликовано 79 научных работ, среди которых 1 монография, и 58 статей (в том числе 55 в журналах, включенных в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук», входящие в международные базы цитирования).
Степень личного вклада автора в результаты исследования. Работа выполнена на кафедре анатомии человека ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет». Автор планировал и непосредственно участвовал в проведении всех этапов диссертационной работы, самостоятельно проводил взятие трупного материала, все экспериментальные, электронномикроскопические, гистологические, гистохимические и иммуно-
Монооксид углерода в нервной системе
Как эндогенный биологический мессенджер в мозге, СО идентифицирован не так давно. Было доказано, что СО включается в центральную сердечно-сосудистую регуляцию, барорефлексную модуляцию и глутаматергическую нейротрансмиссию в ряде ядер мозга. Экспериментальными исследованиями была установлена изоформа НО, индуцируемая в мозге [339]. Унилатеральная микроинъекция гемина (1 мкмоль), вызывающая освобождение СО, приводила к значительному снижению кровяного давления и частоты сердечных сокращений. Эти сердечно-сосудистые эффекты гемина затухали при предварительном введении цинк-протопорфирина IX (ZnПП–IX), ингибитора НО. Предварительное введение ZnПП-IX значительно тормозит индукцию НО-1 после инъекции гемина. При этом заметных изменений экспрессии НО-2 не обнаруживается. In situ индукция экспрессии белка НО-1 была установлена в глиальных клетках и нейронах после инъекции гемина в ядра солнечного сплетения, что свидетельствовало о вкладе НО-1 в центральный контроль кардиоваскулярных функций [245]. Однако параллельно были получены и другие данные, позволяющие считать, что в нейронах переднего мозга, мозжечка, гиппокампа, среднего мозга, базальных ганглиев, таламуса, ствола мозга, обонятельной луковице преобладает активность НО-2 [238]. На ведущую роль НО-2 в обеспечении функций мозга указывали и другие исследования. В экспериментах, проведенных с использованием метода вестерн-блоттирования, Ли и соавт. [243] наблюдали 2–7-кратное повышение НО-2 мРНК в гомогенате ткани спинного мозга. Дополнительные опыты выявили ее повышение в 3,1 раза у толерантных к опиоидам животных. И хотя функциональная значимость этого феномена в мозге доподлинно не известна, возможно, что НО-2 включена в механизм формирования аналгетической толерантности к опиоидам или в развитие феномена гипералгезии после хронического воздействия опиоидов. Открытие гем-деградирующей активности в мозге подтолкнуло к предположению, что НО в ЦНС выполняет и другие функции, чем просто участие в деградации гема, а затем – к изучению СО в качестве многообещающей и потенциально важной сигнальной молекулы [254].
СО так же, как NО является ретроградным мессенджером, участвующим в развитии и поддержании долговременной потенциации в гиппокампе [202, 254]. Добавление СО во время слабой тетанической или низкочастотной стимуляции приводит к развитию долговременной потенциации. Ингибиторы НО блокируют индукцию долговременной потенциации и, более того, они прекращают уже возникшую потенциацию [342]. Следовательно, для того чтобы сохранить долговременную потенциацию, синтез СО должен быть постоянным. Вероятно, во время развития долговременной потенциации СО играет в большей степени тоническую поддерживающую роль, тогда как активация NОS необходима для индукции потенциации.
СО, продуцируемый в организме под влиянием фермента НО, как полагают, является ретроградным синаптическим посредником с выдающейся ролью в формировании долговременной потенциации в определенных областях мозга [125]. СО, генерируемый снаружи пресинаптическими нервными окончаниями, включен в индукцию долговременной потенциации как ретроградный мессенджер, который освобождается из постсинаптического дендрита, диффундирует обратно через синапс, повышая освобождение глутамата [94, 278]. С помощью флуориметрического метода было показано влияние СО на освобождение глутамата в синаптонейросомальных препаратах. ZnПП-IX, блокирующий СО, снижал индуцируемое деполяризацией освобождение глутамата Са2+-зависимым путем, но не оказывал никакого влияния на Са2+-независимое освобождение глутамата. На основе этих данных высказывается мысль о том, что СО играет ключевую роль в Са2+-зависимом освобождении глутамата в синапсах и может быть ретроградным мессенджером при долговременной потенциации [222]. Неравномерное распределение НО-2 в нервной системе, которая вырабатывает СО, генерация долговременной потенции в гиппокампе, возможная медиация гипоталамических факторов [202], указывают на то, что СО, является самостоятельным нейротрансмиттером и может быть включен, в частности, в ноцицептивную сигнализацию [243]. СО и NО, как и другие ретроградные посредники, могут действовать на различные механизмы возникновения и поддержания долговременной потенциации, взаимодействуя друг с другом. Однако в отличие от кровеносных сосудов, где показаны кооперативные эффекты NO и СО, в мозге имеются примеры, когда они оказывают антагонистическое действие, очевидно ввиду того, что в ЦНС увеличение синтеза СО происходит при активации метаботропных глутаматных рецепторов 1 типа [254, 266]. Протеинкиназа С значительно усиливает активность казеинкиназы (СК2), которая в свою очередь фосфорилирует и активирует НО-2 [140]. Таким образом, СК2 обеспечивает механизм быстрой активации НО-2 в ответ на нейрональное возбуждение. Возможна регуляция экспрессии НО-2 нитрозилированием цистеинов [254], что может иметь важное физиологическое значение, учитывая частую солокализацию NOS и НО-2 в нейронах. Транскрипционная регуляция экспрессии НО-2 описана для глюкокортикоидов [189, 254]. Установлено влияние СО на освобождение ацетилхолина из двигательной нервной терминали холоднокровных. Экзогенный СО усиливал как спонтанную, так и вызванную секрецию ацетилхолина. Блокирование гемоксигеназы приводило к эффектам, противоположным действию СО, что свидетельствует о возможности его эндогенного синтеза в нервно-мышечном синапсе. Эффекты СО опосредуются на пресинаптическом уровне и не затрагивают электрогенез двигательного нервного окончания [127]. Исследование механизмов модулирующего эффекта СО в нервно-мышечном синапсе показало, что гуанилатциклаза является не единственной мишенью действия СО. Эффекты этого газа не устранялись ингибиторами гуанилатциклазного пути и не имитировались увеличением уровня внутриклеточного цГМФ [91]. При этом влияния СО на вызванное освобождение медиатора имитировались увеличением внутриклеточного уровня цАМФ и полностью снимались блокированием аденилатциклазы. По всей вероятности, эффекты СО на секрецию медиатора могут оказываться через изменение внутриклеточной концентрации цАМФ в результате непосредственного активирования аденилатциклазы или опосредованного через цГМФ-зависимые фосфодиэстеразы [90].
Таким образом, СО, подобно NO, является эндогенным модулятором высвобождения медиатора в нервно-мышечном синапсе. Увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ в скелетной мышце и активация протеинкиназы С вызывают активацию НО-2 и последующий синтез СО, который ретроградно диффундирует в двигательное нервное окончание и модулирует освобождение ацетилхолина [89, 90, 201].
Технические приемы, использованные в работе
Из продолговатого мозга и моста крыс делали срезы в двух плоскостях – сагиттальной и фронтальной (рис. 10–12), что позволило наиболее полно микроскопировать и изучать ядра. У крыс ориентиром, определяющим локализацию изучаемых образований, служила антропологическая точка (bregma), находящаяся в проекции пересечения венечного и стреловидного швов черепа. Для более точного определения пространственной локализации нейронов в исследованных ядрах под микроскопом, использовали окуляр с помещенной в него сеткой с равновеликими квадратами.
Пространственные отношения нейронов различной медиаторной принадлежности в одноименных ядрах изучали «методом наложения изображений» [116], полученных на последовательных срезах исследуемого участка мозга. Каждое ядро на срезах ориентировали по характерным признакам в сагиттальной и фронтальной плоскостях, после чего его контуры воспроизводили на экране монитора в соответствии с положением ядер относительно координат сетки. Наложения ядер идентичных срезов с нейронами, выявленными разными методами исследования, для установления их пространственных взаимоотношений осуществляли при помощи компьютерной программы Adobe Photoshop.
При изучении нервных клеток ствола головного мозга методами на NADPH-d, nNOS, НО-2, CBS, ХАТ, катехоламины и серотонин в серии из последовательных срезов продолговатого мозга и моста, один окрашивали 0,5 % раствором метиленового синего, а следующий за ним обрабатывали для визуализации нейронов одним из указанных выше методом. Срезы отбирали таким образом, чтобы в их проекции находились ростральная, центральная и каудальная части каждого из исследованных в работе ядер (рис. 10, А–Е, 11, А–Л, 12, А–Д).
Пиальные сосуды изучали на тотальных препаратах мягкой оболочки, а, так же как и внутримозговые – на фронтальных срезах продолговатого мозга. Фрагменты мягкой оболочки расправляли на предметном стекле, высушивали в течение 2–3-х минут в струе проходящего воздуха, а затем обрабатывали в соответствии с процедурой, предусмотренной для используемого метода исследования. Тотальные препараты мягкой оболочки мозга применялись в основном, для изучения афферентной и эфферентной инервации пиальных артерий. Долю энзимпозитивных сосудов, а также СПОП фермента в структурных элементах стенки артерий устанавливали на серии поперечных срезов в соответствии с порядком ветвления пиальных сосудов, который определяли по их диаметру.
Микрофотографии с препаратов получали с помощью микроскопа Carl Zeiss, Jena соединенного посредством адаптера (рацпредложение № 2485/49 от 2002 г.) с фотокамерой Sony Сyber-shot DSC-P12 (5.0 megapixels) в положении трансфокатора – 3х. Регулировку яркости и контраста цифровых фотоизображений осуществляли при помощи компьютерных программ Adobe Photoshop.
Стандартизация параметров измерений освещенности при проведении исследований осуществлялась с помощью люксметра нового поколения ТКА-Люкс/Эталон.
В отдельной серии экспериментов с помощью фармакологических тестов мы изучали эндотелийзависимую (ЭЗВД) и эндотелийнезависимую (ЭНВД) реакции сосудов [98]. Для изучения прижизненной реакции пиальных артерий разного диаметра (порядка ветвления) животных предварительно наркотизировали внутримышечным введением раствора нембутала (5 мг на 100 г массы) и помещали в стереотаксический станок для фиксации головы в горизонтальной плоскости (рис.13, а). Твердую оболочку мозга в пределах отверстия удаляли, а поверхность мозга либо покрывали прозрачной пленкой, предохраняющей его от высыхания и отека, либо она постоянно орошалась термостатированным (35–37оС) раствором МкИлвейна (рН 7,4). Методом биомикроскопии, на специально изготовленной для этих целей установке, в отраженном свете под микроскопом Carl Zeiss Jena изучали
Для оценки ЭЗВД использовали ацетилхолиновый тест с введением ацетилхолина («Acros organics», США) (0,001 мг/кг), ЭНВД (миогенная реакция) – нитроглицериновый, с введением нитроглицерина (МТХ, Москва) (0,007 мг/кг) [98]. Кроме того, исследовали реакцию сосудов на применение ацетилхолина или нитроглицерина через 5 минут после введения в бедренную вену блокатора NO-синтазы L-NAME (2 мг/кг).
Контрольная группа включала 8 крыс, экспериментальная – 24, по 6 животных в каждой группе. У интактных животных ветви I порядка МОБМ при биомикроскопических тисследованиях имели диаметр от 60 до 51 (средний 56,8±5,3) мкм, II – 43–34 (35,6±4,7) мкм, III – 30–24 (23,2±3,8) мкм, IV – 21–16 (16,4±3,3) мкм, V – 14–12 (13,2±2,5) мкм.
В проекции среза каждого ядра определяли среднее количество энзимопозитивных нейронов и долю, которые они составляют от общего числа нейронов, выявленных в соответствующих ядрах метиленовым синим. Кроме того, в проекции каждого ядра высчитывали среднюю площадь профильного поля клеток и относительную плотность (концентрацию) энзимпозитивных клеток. Вычисляли также средний показатель оптической плотности осадка в нейронах ядра, который находили по сумме яркости пикселов при сканировании каждого нейрона в исследуемом ядре [106, 122]. Количественную обработку материала проводили на АСАИ Allegro только в тех ядрах, в которых постоянно и в достаточном количестве для статистической обработки определялись энзимопозитивные нейроны в соответствии с алгоритмом, описанным нами ранее [4, 5, 106]. При определении величины тел нервных клеток измеряли наибольшую длину и поперечник клетки.
Норадреналинергические нейроны
Симпатическая нервная система в течение длительного периода времени рассматривается в качестве важнейшего звена регуляции кровообращения. Центральное место в этом процессе часто отводится моноаминергическим механизмам «бульбарного вазомоторного центра», морфологическим воплощением которых являются небольшие группы норадреналинергических нейронов, расположенные между ядрами продолговатого мозга и моста [164, 317]. Вместе с тем, отсутствуют убедительные данные о локализации и численности норадреналинергических клеток в вазомоторных ядрах, что не позволяет оценить их вклад в моноаминергические механизмы регуляции кровообращения.
По нашим данным, в вазомоторных ядрах каудальной части мозгового ствола на долю нейронов, обладающих характерной для норадренергических клеток желтовато-зеленой люминесценцией, приходится в среднем 3–4% от общего числа нейронов. Большинство из них крупных (2984 мкм) и средних (1431 мкм) размеров, округлой или угловатой формы с отростками, в терминальной части которых находятся небольшие утолщения – варикозности (рис. 46, а, б).
Подавляющее число норадреналинергических клеток выявляется в проекции ЯСТ, ДЯБН и нескольких ретикулярных ядер – РГЯ, РПГЯ, РЛЯ, РОЯМ и РКЯМ, хотя и в них доля таких нейронов редко превышает 12% (рис. 47, А). В этих же структурах определяются и наиболее высокие значения относительной плотности (концентрации) клеток (рис. 47, Б). норадреналинергических нейронов в ядрах продолговатого мозга крысы. За 100% принята величина соответствующих показателей в одноименных ядрах при окраске препаратов метиленовым синим.
Но и в этих структурах на разных уровнях их сечения численность норадреналинергических нейронов существенно отличается. Например, в РГЯ основное количество этих нейронов сосредоточено в его центральной части. На некоторых срезах встречается до 30 крупных интенсивно флуоресцирующих клеток, численность которых в этой части ядра вдвое превышает средние цифры по ядру в целом. В каудальной части клетки встречаются редко, но много разнонаправленных флуоресцирующих нервных проводников, которые вместе с волокнами, начинающимися от нейронов РПГЯ, как предполагается, обеспечивают распространение возбуждения от медиальной зоны бульбарного отдела к симпатическим нейронам промежуточно-латерального ядра спинного мозга [246].
Экспериментальные исследования показали, что ЯСТ также играет важную роль в центральных гемодинамических эффектах симпатической нервной системы. При введении в него 6-оксидофамина, вызывающего дегенерацию норадреналинергических нейронов, отмечено существенное ослабление барорецепторных рефлексов, что подтверждает его участие в регуляторном процессе норадреналинергического компонента указанного ядра [300].
Результаты нейрофармакологических исследований хорошо коррелируют с полученными нами данными о том, что основное количество норадреналинергических клеток определяется в каудальной части ЯСТ, где их доля на некоторых срезах достигает 15%, тогда как в среднем по ядру величина этого показателя почти вдвое ниже. В краниальной части ЯСТ клеток немного, зато выявляются многочисленные разнонаправленные флуоресцирующие волокна. В других ядрах (РМЯ, ДЯБН, СПМЯ, РОЯМ) на долю норадреналинергических приходится около 1% клеток. И это притом, что в достаточно большой группе ядер с установленной вазомоторной функцией норадреналинергические нейроны постоянно не выявляются или определяются в ограниченном количестве. Результаты проведенного нами сравнительного анализа показывают, что в ядрах, в которых определяется ограниченное количество таких нейронов, как правило, в большем количестве встречаются клетки с экспрессией nNOS. В тех ядрах, где много крупных флуоресцирующих клеток (РГЯ, РПГЯ, РКЯМ) иммунопозитивные нейроны встречаются не так 118 часто. Однако во всех ядрах абсолютное число норадреналинергических нейронов намного ниже соответствующих значений, вычисленных на препаратах, окрашенных метиленовым синим. Например, в РМЯ из 695 клеток, маркированных метиленовым синим, норадреналинергическими являются лишь 0,8%. В ЯСТ и РЛЯ эти различия выражены в меньшей степени, но все равно значительны (рис. 47, А, Б). В большинстве других ядер на долю флюоресцирующих нейронов приходится от 0,5% до 2%, либо они постоянно не выявляются. Еще одну группу составляют норадренергические нейроны размером около 300–350 мкм2 веретеновидной или полигональной формы, лежащие между ядрами или между ядрами и проводящими путями. Особенно часто такие нейроны выявляются между ЯСТ и РМЯ, вокруг РЛЯ, на стыке РГЯ и РМЯ. Постоянно присутствуют в вентролатеральной части моста, медиальнее корешков лицевого нерва, на границе РГЯ и рострального ядра моста. Здесь же иногда выявляется небольшое количество довольно крупных (площадью свыше 1500 мкм2) интенсивно флюоресцирующих клеток.
Оксид азота в афферентной иннервации сосудов головного мозга
Важное место в процессе управления функциями сосудов принадлежит афферентной иннервации. Поражает большое количество и разнообразие форм чувствительных нервных окончаний в пиальных сосудах и межсосудистых областях мягкой оболочки продолговатого мозга. Методом импрегнации в них выявляются обширные рецепторные поля, включающие большое количество разнообразных видов рецепторов (рис. 64, а–г).
Долгое время считалось, что рецепцию и проведение возбуждения обеспечивает ацетилхолин, а холинергический механизм является едва ли не единственным участником этих процессов [64, 120]. Затем список веществ, включенных в механизмы восприятия и проведения нервного импульса, расширился, но лишь в последние годы появились сообщения о возможном участии в этих процессах оксида азота [41, 312].
Наши наблюдения показали, что при использовании гистохимических методов на NADPH-d у крысы и человека в стенке пиальных артерий, а также в межсосудистых областях мягкой оболочки мозга, постоянно определяются рецепторы, отличающиеся строением и активностью в них ферментов. На более крупных артериях (у человека диаметром 450–300 мкм, у крысы – 30 мкм) наблюдаются просто устроенные древовидные арборизации, которые с уменьшением калибра сосудов (до 200 мкм у человека и до 15 мкм у крысы) замещаются компактными и диффузными кустиковидными рецепторами, сменяющимися в свою очередь клубочковыми нервными окончаниями (рис. 65, а–д).
Древовидные и кустиковидные рецепторы обычно обладают низкой или, реже, умеренной активностью NADPH-d. Клубочковые рецепторы различаются активностью фермента, а также величиной, формой и концентрацией терминальных волокон. Основное количество этих рецепторов несет на себе характерные признаки, по которым можно выделить, по крайней мере, три типа наиболее часто встречающихся клубочковых рецепторов, образованные ветвями одного, двух или трех нервных волокон различного диаметра, которые отличаются плотностью терминальных волокон и активностью в них NADPH-d (66, а–в).
Среди нервных волокон, учатсвующих в образовании клубочковых рецепторов можно выделить тонкие афференты с поперечником меньше 4 мкм, отличающиеся невысокой активностью фермента, средние (4–7 мкм) – с умеренной активностью NADPH-d и толстые (7–9 мкм) – с высокой активностью энзима. I тип клубочковых рецепторов представлен шаровидными и близкими к ним по форме клубочками, размерами около 8 мкм у крысы и 20–30 мкм у человека, с высокой концентрацией тонких терминалей, образующих густую сеть (рис. 66, а). II тип – образуют компактные клубочки размером 7–9 мкм (как у крысы, так и у человека), с незначительным числом терминалей. III тип нервных окончаний выглядит как рыхлый клубочек, вытянутый в длину, размерами 15–20 мкм у крысы и 30–50 мкм у человека, с низкой концентрацией тонких волокон, по ходу которых видны веретеновидные утолщения (рис. 65, д).
Клубочковые рецепторы располагаются вдоль сосудистого русла очень неравномерно: у мест деления и у начала вновь образованных ветвей отмечается высокая концентрация рецепторов (до 20 на 1 мм2 длины сосуда у крысы), на других участках нервные терминали встречаются значительно реже (6–8 на 1 мм2 длины сосуда) или не определяются вовсе. Но во всех случаях относительная плотность NADPH-d–позитивных рецепторов, а также занимаемая ими площадь у крысы, как и человека составляет около 16–20 % от величины соответствующих показателей, установленных при импрегнации препаратов. Во внутримозговых сосудах преобладают более компактные чувствительные аппараты – клубочки (рис. 65, д, е). На срезах мозга хорошо видно, что отростки нервных клеток не только сопровождают сосуды, но и взаимодействуют с ними, оплетая их своими терминалями. Складывается впечатление, что большинство нитроксидергических нейронов имеет отношение к иннервации сосудов (рис. 67, а–в). Мы наблюдали разные варианты нейровазальных отношений в веществе мозга. Часто клеточные тела лежат на поверхности сосуда или в 143 непосредственной близости от его стенки (рис. 67, а, б). В других случаях отростки нейронов, прежде чем достигнуть сосуда проходят значительное (до 1500–2000 мкм) расстояние. При этом дендриты и аксоны одного клеточного тела нередко взаимодействуют одновременно с несколькими нейронами и сосудами: артериями и венами, артериями и капиллярами, артериями, венами и капиллярами (рис. 67, в).
Рецепторы, выявленные в пиальных и внутримозговых сосудах, заметно отличаются между собой интенсивностью гистохимической реакции. На отрезках сосудистого русла, зачастую, расположенных рядом друг с другом, определяются чувствительные нервные аппараты, как с высокой, так и низкой плотностью отложения продукта реакции. В местах деления артерий, у истоков образования мелких артерий и артериол, как правило, располагаются рецепторы с более высокой интенсивностью реакции.
Рецепторный сигнал, возникающий в периферической части дендритов, достигает чувствительных ядер сердечно-сосудистого центра, проходя через соответствующие ганглии черепных нервов. При изучении нижнего яремного узла у крысы и человека, мы постоянно находили NADPH-d-позитивные протонейроны (рис. 68, а, б).
