Введение к работе
Актуальность проблемы
Внутриклеточный транспорт определяет ряд ключевых процессов, жизненно важных как для самой клетки, так и для всего организма в целом. Это процессы эндо- и экзоцитоза, поляризация клетки в ответ на воздействие внешних сигналов и направленная локомоция, которая обеспечивает заживление ран, развитие воспалительных процессов, нормальное протекание эмбриогенеза и рост сосудов. Вместе с тем, поляризация и локомоция клеток играют определяющую роль при малигнизации опухолей в процессе канцерогенеза.
Транспорт по цитоплазме осуществляется моторными белками, перемещающими органеллы вдоль элементов цитоскелета. Цитоскелет клеток животных представлен актиновыми микрофиламентами, промежуточными филаментами и микротрубочками. При этом длинные беспорядочно расположенные промежуточные филаменты обеспечивают жёсткость клетки и помогают удерживать митохондрии в определённых клеточных компартментах, не участвуя в процессах внутриклеточного транспорта. Перемещение органелл осуществляется вдоль микротрубочек (МТ) и микрофиламентов (МФ) посредством моторных белков, относящихся к семействам кинезинов, динеинов и миозинов.
Моторные белки – это молекулы, использующие химическую энергию гидролиза АТФ для осуществления своих конформационных изменений, что приводит к последовательным «шагам» такой молекулы по МТ или МФ. Каждый моторный белок движется в одном строго заданном направлении. Поэтому наличие на поверхности органеллы одновременно различных моторных белков, а также выборочная активация нужных моторов позволяет осуществлять направленный транспорт по цитоплазме.
Степень разработанности темы исследования
Благодаря исключительной важности процессов внутриклеточного транспорта для жизнедеятельности клеток, исследования в этой области были особенно интенсивными в последние два десятилетия, благодаря бурному развитию современных методов исследований. Была не только детально описана морфология цитоскелета, но и проведена 3D-реконструкция молекул моторных белков, описан механизм их перемещения и некоторые способы регуляции. Однако ряд фундаментальных вопросов об организации внутриклеточного транспорта оставался без ответа, не давая возможности объединить все известные факты в одну непротиворечивую схему. Данная работа раскрывает ряд механизмов, определяющих архитектуру тубулиновой транспортной системы, и объясняет, чем обусловлена однонаправленность транспорта
по актиновой транспортной сети. Исследования, приведённые в работе, подразделяются на три основные части.
Первая и вторая части работы посвящены исследованию молекулярных механизмов, обеспечивающих выполнение двух условий, необходимых для обеспечения эффективного транспорта по МТ: 1) центр организации МТ должен располагаться в геометрическом центре клетки, 2) центр организации должен эффективно удерживать минус-концы МТ, обеспечивая их радиальность. Действительно, транспорт по радиальным МТ наиболее эффективен, т.к. минимизирует расход АТФ благодаря укорочению транспортных путей, и кроме того, радиальность МТ обеспечивает механизм search and capture, являющийся одним из способов регуляции внутриклеточного транспорта.
Обычно в качестве центра организации МТ выступает центросома – единственная немембранная органелла у большинства клеток позвоночных: ещё в 70-х годах ХХ века было показано, что именно её активность обеспечивает радиальность системы МТ. Хотя центросома впервые была описана Теодором Бовери ещё в конце XIX века и получила своё название благодаря центральному расположению в клетке, механизмы её позиционирования оставались неизвестными. Белковый состав центросомы весьма сложен. В её состав входят около трёхсот белков, выполняющих самые разные функции, вплоть до регуляции клеточного цикла. Однако в контексте разговора о клеточном транспорте основная роль центросомы – организация МТ как системы радиальных путей для моторных белков. Это происходит в результате образования (нуклеации) на центросоме новых МТ и удержания (заякоривания) уже существующих. Процесс заякоривания микротрубочек до сих пор недостаточно изучен; известно лишь, что этот процесс требует слаженной работы множества белков, организованных в функциональные комплексы переменного состава.
Третья часть работы посвящена изучению вопроса, чем обусловлено направление перемещения органелл по элементам цитоскелета. Общеизвестно, что по МТ транспорт органелл идёт в обе стороны, в то время как по МФ лишь в одну. Логично предположить, что направленность транспорта зависит от присутствия в транспортной системе соответствующих моторных белков. Однако миозин VI, обильно представленный в цитоплазме на поверхности мембранных органелл, в системе in vitro перемещается к минус-концам МФ. При этом свидетельств наличия двунаправленного транспорта по МФ в живых клетках нет. Следовательно, возможность двунаправленного транспорта определяется какими-то иными факторами.
В целом, эта работа раскрывает ряд механизмов, определяющих архитектуру системы МТ как основной транспортной системы клетки, и отвечает на вопрос, чем
обусловлена однонаправленность транспорта по другой транспортной системе – актиновой транспортной сети.
Исходя из вышесказанного, в настоящей работе были поставлены следующие ЦЕЛИ:
-
Исследовать молекулярные механизмы, определяющие архитектуру основной транспортной системы клетки – сети микротрубочек
-
Установить фактор, определяющий направленность транспорта мембранных органелл по другой транспортной системе – сети актиновых микрофиламентов.
В соответствии с поставленными целями были сформулированы следующие ЗАДАЧИ:
-
Изучить in vivo силы, помещающие и удерживающие центросому в геометрическом центре интерфазной клетки. Выяснить молекулярную природу всех этих сил и механизмы их регуляции. Построить рабочую модель позиционирования центросомы, объясняющую её центральное положение в интерфазной клетке и способную к саморегуляции при внесении изменений в систему in vivo и in silico.
-
Исследовать in vivo и in vitro роль динеина как функционально активного компонента центросомы. Изучить работу этого минус-концевого моторного белка в качестве структурно-образующего элемента цитоскелета, обеспечивающего удержание на центросоме минус-концов микротрубочек.
-
Изучить in vivo и in vitro роль серин-треониновой протеинкиназы LOSK в процессах организации микротрубочек вокруг центросомы. Исследовать работу этого белка как одного из участников процесса заякоривания микротрубочек.
4. Детально изучить механизмы миозин-зависимого транспорта органелл по сети
актиновых филаментов in vivo и in vitro. Установить, какую роль в этом процессе играет
динамика микрофиламентов и какие фундаментальные свойства актомиозиновой
транспортной системы она обуславливает.
Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы
В результате проведённых исследований была впервые описана совокупность механизмов позиционирования центросомы в интерфазных клетках животных. Применение нового оригинального метода локального разрушения системы МТ в сочетании с методами прижизненной флуоресцентной видеомикроскопии и воздействиями различных ингибиторов позволило получить новые данные, которые легли в основу компьютерной модели, описывающей все аспекты центрирования. В результате данный процесс полностью изучен: выявлены силы, воздействующие на МТ,
регуляторы данного процесса, и выяснен относительный вклад каждого из участников. Полученные результаты впервые позволяют объяснить центральное расположении центросомы в клетках животных.
Кроме того, в настоящей работе впервые продемонстрировано участие в процессе заякоривания МТ на центросоме двух белков – динеина и киназы LOSK. В обоих случаях данные прижизненных экспериментов in vivo полностью подтверждались затем результатами экспериментов in vitro. Роль моторного белка динеина в качестве структурно-образующего элемента цитоскелета показана впервые. Функции киназы LOSK, описанной ранее как белок, связанный с микротрубочками и центросомой, в качестве участника процесса заякоривания МТ, также впервые продемонстрированы в данной работе. Полученные данные позволили существенно углубить имевшиеся представления об архитектуре тубулиновой транспортной сети и способах её формирования и поддержания.
В заключительной части работы дан ответ на вопрос о механизмах транспорта по МФ, определяющих однонаправленность этого транспорта. Было применено сочетание различных молекулярно-биологических и цитологических методов (прижизненной цейтраферной видеомикроскопии, иммуннофлуоресцентной микроскопии, электронной микроскопии, восстановления флуоресценции после обесцвечивания (FRAP) и системы изучения подвижности in vitro) с последующим компьютерным моделированием. Благодаря комплексному применению этих методов впервые было показано, что направленность транспорта по МФ зависит не от наличия соответствующих моторных белков, а от динамики самих филаментов, составляющих транспортную сеть.
Понимание пространственной организации внутриклеточного транспорта даёт возможность подробнее исследовать многие процессы, чрезвычайно интересные как с точки зрения фундаментальной цитологии, так и с биомедицинской точки зрения. В частности, способы перемещения в цитоплазме клеток различного рода патогенов могут определять инфекционность того или иного возбудителя заболеваний. Разработка фармакологических агентов, влияющих на внутриклеточный транспорт патогенных частиц, является одной из задач современной молекулярной медицины. Кроме того, выше упоминалось о роли внутриклеточного транспорта в процессе поляризации, влияющего на протекание ангиогенеза, эмбриогенеза, канцерогенеза, заживление ран и осуществление иммунного ответа. Разработка стимуляторов или ингибиторов этих процессов также является перспективным направлением современной прикладной биологии. Таким образом, полученные в данной работе результаты имеют не только фундаментальное, но и существенное научно-практическое значение для современной клеточной биологии.
В результате выполнения настоящей работы были сформулированы следующие
Положение 1:
Позиционирование центросомы осуществляется благодаря совместной работе цитоплазматического динеина, актомиозиновой системы и сил, продуцируемых динамичными плюс-концами микротрубочек. Динамика плюс-концов микротрубочек оказывает дестабилизирующий эффект на положение центросомы. Центрирование осуществляется за счёт тянущего усилия динеиновых моторов, приложенного пропорционально длине микротрубочек, и центростремительного тока актина; активность динеина при этом регулируется малой ГТФазой Cdc42. Таким образом, в интерфазных клетках животных существует сложный саморегулирующийся процесс поддержания центра симметрии тубулиновой транспортной системы.
Положение 2:
Цитоплазматический динеин и протеинкиназа LOSK участвуют в заякоривании минус-концов микротрубочек на центросоме и организуют их в радиальную звезду, не влияя при этом на процесс нуклеации. Нарушение работы любого из этих белков приводит к хаотизации всей системы микротрубочек. Активность динеина обеспечивает структурную целостность центросомы, а активность протеинкиназы LOSK необходима для поддержания уровня центросомного динактина. Ингибирование LOSK приводит к нарушениям клеточной адгезии, динамики фокальных контактов, поляризации и локомоции клетки. Таким образом, динеин и киназа LOSK входят в число белков, необходимых для функционирования центросомы как центра организации тубулиновой транспортной сети.
Положение 3:
Миозин-зависимый транспорт органелл по цитоплазме происходит лишь при условии непрерывного тредмиллинга микрофиламентов. Тредмиллинг исключает возможность перемещения грузов по микрофиламентам в сторону их минус-концов. Таким образом, однонаправленность транспорта по актину определяется свойствами элементов цитоскелета, образующих транспортную сеть, а не наличием или отсутствием в цитоплазме соответствующих моторных белков.
Участие автора.
Участие автора заключалось в проведении экспериментов и получении научных результатов; в цифровой и статистической обработке и в дальнейшем анализе этих результатов, в построении на их основе математических моделей; в последующей
формулировке научных положений и выводов, а также в написании научных статей по результатам работы.
Степень достоверности и апробация работы.
Основные результаты и положения диссертационной работы были доложены на ежегодных научных конференциях Института Белка РАН (Пущино, 2000г., 2002г., 2003 г., 2008 г., 2011г., 2013г.), ежегодных конференциях ASCB – Американского Общества Клеточной Биологии (США, 2001г., 2002г., 2005г., 2009г., 2010г., 2013г), Всероссийском симпозиуме «Клеточная биология на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000г.), конференции EMBO/EMBL “Centrosomes and spindle pole bodies” (Гейдельберг, 2002), заседаниях Московского семинара по клеточной биологии (Москва, 2002г., 2009г., 2013г.), I и II съездах Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003г., 2007 г.), симпозиуме EMBO/FEBS «Frontiers in Cytoskeleton Research» (Госау, 2003г.,), IX Международной школе-конференции «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2005), Международных симпозиумах по биологической подвижности (Пущино, 2006г., 2008г., 2010г., 2012г.) летней конференции ASCB/ECF «Dynamic Interplay Between Cytoskeletal and Membrane Systems» (Дижон, 2007г.), международной конференции «Protein biosynthesis, structure and function» (Пущино, 2007г.), школе-семинаре по проблемам организации внутриклеточного транспорта, цитоскелета и путей передачи сигнала (Санкт-Петербург, 2009г.), I Всероссийской конференции «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет» (Санкт-Петербург, 2011г.), XXXVIII конгрессе FEBS (Санкт-Петербург, 2013г.), Всероссийском симпозиуме по биологии клетки в культуре (Санкт-Петербург, 2013).
Материалы диссертации доложены на объединённом заседании отделов электронной микроскопии и функциональной биохимии биополимеров НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ в рамках Московского семинара по клеточной биологии 2 октября 2013 г.
По теме диссертации опубликовано 48 печатных работ; в том числе 14 статей в отечественных и зарубежных реферируемых научных журналах, статья в тематическом сборнике, 33 тезисов докладов на российских и международных конференциях. 9 статей индексируются в ISI Web of Science.
Объём и структура диссертации.
Диссертация изложена на 232 страницах машинописного текста и состоит из Введения, Обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание Материалов и Методов исследования, Результатов и Обсуждения в трёх частях,
Выводов, Заключения, Списка видео, Списка публикаций и Списка литературы. Работа иллюстрирована 63 рисунками и 4 таблицами. Библиография включает 435 публикаций.
